水产品中5种环境激素农药LC-MS_MS快速检测方法_关文碧.pdf

食品工业 2023 年第44卷第 2 期 304 分析检测水产品中5种环境激素农药LC-MS/MS快速检测方法关文碧1,2*，杨晓静1，郑嵋丹1，朱国榕11.肇庆学院食品与制药工程学院（肇庆 526061）；2.农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（肇庆）（肇庆 526061）摘要建立液相色谱-串联质谱快速检测水产品中的5种环境激素类农药的残留分析方法。试验对提取溶剂的种类、提取方式、盐析条件和净化条件进行优化。最佳样品前处理为乙腈振荡提取20 min,加入氯化钠和无水硫酸钠盐析,离心后直接取上清液过膜进样。方法学考察表明:纯溶剂中及鱼、虾、螺中5种农药残留在1200 g/L的质量浓度范围线性良好;检出限为1 g/kg,定量限为5 g/kg。在5,20和50 g/kg这3个添加质量分数下,农药平均回收率为70.55%107.34%,变异系数(coefficient of variation,C.V.)为0.73%10.35%(n=6)。利用该方法检测市售60份鱼、虾和螺样品中的环境激素类农药残留,均未检出腈菌唑、丙环唑、三唑醇、戊唑醇和吡虫啉。该方法灵敏度高、可靠性好、操作简单而且快速,能满足水产品中环境激素类农药快速定量分析的要求。关键词水产品;液相色谱-串联质谱;环境激素类农药;残留分析Rapid Determination of Five Pesticide Endocrine Disruptors in Aquatic Products by Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryGUAN Wenbi1,2*,YANG Xiaojing1,ZHENG Meidan1,ZHU Guorong11.School of Food and Pharmaceutical Engineering,Zhaoqing University(Zhaoqing 526061);2.Laboratory of Quality&Safety Risk Assessment for Agro-Product(Zhaoqing),Ministry of Agriculture and Rural Affairs(Zhaoqing 526061)Abstract A method for rapid determination of five pesticide endocrine disruptors in aquatic products by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was established.The extraction solvents,extraction methods,salting out conditions and purification conditions were optimized.The best sample pretreatment method was acetonitrile extraction,shaking extraction for 20 min,adding sodium chloride and anhydrous sodium sulfate for salting out,and directly taking the supernatant for membrane injection after centrifugation.Good linearity with R20.999 2 was realized over the experimental concentration ranges of 1-200 g/L in organic solvent and in aquatic products matrices.For five pesticides in shrimp,fish,and white snail,the limits of detection were 1 g/kg and the limits of quantitation were 5 g/kg.At three concentration levels of 5,20,and 50 g/kg,the average recoveries of five target pesticides were 70.55%-107.34%,and the coefficient of variation(C.V.)were 0.73%-10.35%(n=6).This method was used to screen the target pesticides in 60 aquatic samples sold in the market.All target pesticides were not detected in 60 samples.The method was sensitive,reliable,and easy to operate,which could meet the requirements of rapid quantitative analysis of pesticide endocrine disruptors in aquatic products.Keywordsaquatic products;liquid chromatography-tandem mass spectrometry;pesticide endocrine disruptors;residue analysis*通信作者；基金项目：广东省普通高校青年创新人才项目（2021KQNCX104），大学生创新创业训练计划项目（X202210580138），肇庆学院创新科研团队资助项目（202108）在我国环境激素类农药优先名录中1，三唑醇是除活体试验以外的试验数据证明具有内分泌干扰作用的农药，吡虫啉、腈菌唑、丙环唑和戊唑醇是美国环保局经4个暴露途径筛选出的农药品种。2018年珠江流域监测显示吡虫啉的检出率为98.6%，最大检出质量浓度为162 ng/L2。2019年江苏太湖水样监测显示3，戊唑醇检出率为97%，最高检出质量浓度为2 040 ng/L；三唑醇检出率为100%，质量浓度为1115 ng/L。20202021年间河北白洋淀中丙环唑的监测质量浓度为3.841 209 ng/L4。沈阳污水处理厂的进水和出水中均检出腈菌唑，质量浓度在1.55 g/L范围内5。为保护人类健康，美国规定鱼、软体动物中吡虫啉的限量值为50 g/kg6，日本规定上述5种农药在水产品中执行0.01 mg/kg的限量标准7。而我国尚未对水产品中腈菌唑、丙环唑、三唑醇、戊唑醇和吡虫啉制定最大残留限量要求。试验选择高选择性、高灵敏度的液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术，基于高效、价廉的分散固相萃取法，建立LC-MS/MS快速检测水产品中5种环境激素类农药的残留分析方法，并在广东省内采集市售60份鱼、虾和螺样品进行检测，为水产品中环境激素类农药残留风险评估和风险预警提供数据支持。食品工业 2023 年第44卷第 2 期 305 分析检测1材料与方法1.1材料与仪器腈菌唑标准溶液100 mg/L、丙环唑标准溶液100 mg/L、三唑醇标准溶液100 mg/L、吡虫啉标准溶液1 000 mg/L（阿尔塔科技有限公司）；戊唑醇标准溶液100 mg/L（北京海岸鸿蒙标准物质技术公司）；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、乙酸乙酯（分析纯）、甲酸（分析纯）、乙酸（分析纯）：上海安谱实验科技股份有限公司；氯化钠、无水硫酸钠（均为分析纯，西陇科学股份有限公司）；PSA固相萃取填料、C18固相萃取填料（直径4060 m，天津博纳艾杰尔科技有限公司）；相纳米氧化铝（直径10 nm，南京先丰纳米材料科技有限公司）；弗罗里硅土（0.075 00.150 mm孔径，即100200目）、中性氧化铝（0.048 00.075 0 mm孔径，即200300目）：上海阿拉丁生化科技有限公司。Waters Xevo TQD液相色谱质谱联用仪（美国Waters公司）；Centrisartg-16C高速冷冻离心机、Secura分析天平（德国Sartorius公司）；Multi Reax全能型振荡器（德国Heidolph海道夫）；Thermo V-TOC超纯水系统（美国Thermo公司）；KQ-25ODE数控超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器公司）。1.2试验方法1.2.1溶液配制分别量取1.0 mL腈菌唑/丙环唑/戊唑醇/三唑醇标准溶液（100 mg/L）和100 L吡虫啉标准溶液（1 000 mg/L）于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配得10 mg/L 5种农药的混合标准溶液。量取1 mL甲酸和1 mL乙酸分别加入100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度线，摇匀，配得1.0%甲酸乙腈和1.0%乙酸乙腈。1.2.2样品前处理分别取虾、鱼、贝可食用部分，用高速搅拌机充分搅碎后置于-18 冰箱中避光保存，使用前常温解冻。称取2 g鱼、虾及贝类样品于50 mL塑料离心管中，加入10 mL乙腈，振荡提取20 min，加入2 g氯化钠和2 g无水硫酸钠，涡旋30 s，在4 000 r/min转速下离心5 min，取上清液过0.22 m有机滤膜，待测。1.2.3色谱条件1.2.3.1HPLC条件色谱柱ACQUITU UPLC HSS T3（2.1 mm50 mm，1.8 m）；柱温25；流速0.3 mL/min；进样量5.0 L；流动相为0.1%甲酸水溶液和乙腈；洗脱方式采用梯度洗脱。洗脱程序：01.0 min，乙腈由10%上升至90%，1.03.0 min，乙腈保持90%，3.03.5 min，乙腈下降至10%，3.55 min乙腈保持10%。1.2.3.2质谱条件离子化模式ESI+；质谱扫描方式采用多反应监测；干燥气流量600；干燥温度200；离子传输管温度500；5种农药的质谱参数见表1。表15种农药的质谱参数化合物母离子子离子去簇电压/V 碰撞能量/eV吡虫啉256.0157.0,209.0(定量)5122,15腈菌唑289.170.0(定量),125.03321,30三唑醇296.170.0(定量),99.12210,15戊唑醇308.270.0(定量),125.05718,27丙环唑342.1159.1(定量),205.15227,202结果与分析2.1样品前处理方法的优化2.1.1提取溶剂的优化试验以虾作为基质，选择甲醇、乙腈、乙酸乙酯、1%甲酸乙腈和1%乙酸乙腈5种溶剂做加标回收试验，对提取溶剂的种类进行优化，结果如图1所示。用乙腈提取5种农药添加回收率相对较高，目标物回收率在75%95%，因此使用乙腈作为提取剂。图1提取溶剂对虾中农药回收率的影响2.1.2提取方法优化不同提取方式对样品的提取效果具有一定差异，选取虾作为样品基质，比较振荡提取20 min和超声提取20 min这2种提取方式下目标物的添加回收率，结果见图2。振荡提取的目标物回收率比超声提取目标物回收率高，因此，试验选择振荡提取方式。图2提取方式对虾中农药回收率的影响2.1.3盐析条件的优化试验对比“2 g氯化钠+2 g无水硫酸钠”和“2 g氯化钠+2 g无水硫酸镁”的盐析效果。使用“2 g氯化食品工业 2023 年第44卷第 2 期 306 分析检测钠+2 g无水硫酸钠”作为盐析剂，5种农药回收率为75.7%91.8%，SRSD为3.38%7.59%。使用“2 g氯化钠+2 g无水硫酸镁”作为盐析剂，5种农药回收率为69.3%114.2%，CV为4.11%11.21%。所以试验选用“2 g氯化钠+2 g无水硫酸钠”作为盐析剂。2.1.4净化条件的优化试验分别以50 mg PSA、50 mg C18、50 mg 10 nm氧化铝、50 mg弗罗里硅土和50 mg中性氧化铝作为净化剂，以及不加净化剂6个条件进行净化效果的对比。不同净化条件下虾中农药添加回收试验结果如图3所示。使用等量的PSA、C18、纳米氧化铝、弗罗里硅土和中性氧化铝时，吡虫啉添加回收率分别为67.1%，61.3%，66.6%，59.4%和66.7%。不使用净化剂时，吡虫啉回收率为78.2%。净化剂的使用会导致吡虫啉的添加回收率下降。同时，使用C18作为净化剂会使丙环唑和戊唑醇下降到66.4%和69.6%。此外，对比不同净化条件下目标物的基质效应。基于1.2.2的样品前处理方法，分别以50 mg PSA、50 mg 10 nm氧化铝、50 mg弗罗里硅土和50 mg中性氧化铝作为净化剂对1 mL空白虾样品提取溶液进行净化及不加净化剂净化，得到不同净化条件下虾的空白样品溶液，用以稀释10 mg/L的5种农药的混合标准溶液，配制5.0200 g/L的基质标准溶液和溶剂标准溶液。按照式（1）计算农药的基质效应，结果如表2所示。无净化和加入不同净化剂对目标农药的基质效应影响不大。因此，在满足回收率的要求并兼顾节省经济成本、简化提取步骤的前提下，试验选择省略添加净化剂步骤，样品经提取、盐析、离心后过膜直接供LC-MS/MS检测分析。图3不同净化条件对虾中农药回收率的影响表2不同净化条件对农药的基质效应的影响净化条件基质效应腈菌唑丙环唑戊唑醇三唑醇吡虫啉PSA1.021.061.122.030.64中性氧化铝1.111.071.152.150.7710 nm氧化铝1.071.101.151.990.77弗罗里硅土1.151.121.212.020.69无净化1.091.111.172.070.722.2分析方法的确证2.2.1溶剂标准曲线、基质标准曲线和基质效应按照1.2.2的样品前处理方法制得鱼、虾、白螺的空白样品溶液，分别以空白样品溶液和甲醇稀释10 mg/L的5种农药的混合标准溶液，配得质量浓度1.0，2.0，5.0，10，20，50，100和200 g/L的基质标准溶液和溶剂标准溶液。采用LC-MS/MS检测，以进样浓度为横坐标，农药峰面积为纵坐标，分别绘制基质标准曲线和溶剂标准曲线，结果表明，鱼、虾、螺样品基质中和纯甲醇溶剂中5种农药在1200 g/L的质量浓度范围内均有良好的线性关系，基质标准曲线和溶剂标准曲线的相关系数（r）均在0.999 20.999 9范围内。按照式（1）计算农药的基质效应，结果如表3所示。基质效应=（1）基质标准曲线斜率溶剂标准曲线斜率当基质为虾时，腈菌唑、丙环唑、戊唑醇无明显的基质效应，三唑醇有明显增强的基质效应，吡虫啉有明显减弱的基质效应；当基质为鱼时，腈菌唑无明显基质效应，丙环唑、戊唑醇和三唑醇表现为明显减弱的基质效应，吡虫啉为明显增强的基质效应；当基质为白螺时，除三唑醇没有明显的基质效应外，其余4种均有明显减弱的基质效应。表35种农药的基质效应样品腈菌唑丙环唑戊唑醇三唑醇吡虫啉虾1.11.11.12.20.4鱼1.00.50.70.31.2白螺0.70.70.80.90.82.2.2准确度和精密度基质农药5 g/kg20 g/kg50 g/kg平均回收率/%C.V./%平均回收率/%C.V./%平均回收率/%C.V./%虾腈菌唑75.83.572.92.484.22.2丙环唑72.02.182.00.785.61.2戊唑醇70.62.880.42.482.90.9三唑醇94.54.197.34.5107.34.6吡虫啉79.51.879.02.088.02.7表4虾、鱼和白螺中5种农药的平均添加回收率和相对标准偏差（n=6）转下页食品工业 2023 年第44卷第 2 期 307 分析检测为验证试验方法的准确度和精密度，在虾、鱼、白螺3种水产品中进行5，20和50 g/kg 3个质量分数下的添加回收率试验，所得平均添加回收率和变异系数如表4所示。结果表明，5种农药的平均添加回收率为70.55%107.34%，C.V.为0.73%10.35%，符合农药残留分析的要求。2.2.3检出限和定量限按照3倍信噪比判断检出限，10倍信噪比判断定量限，分别得到5种农药的检出限为1 g/kg、定量限为5 g/kg。2.2.4实际样品测定为检验试验方法的可行性和实用性，从广东湛江市场中随机采购鱼、虾、螺各20个样品进行检测，图4为质量浓度20 g/L的虾基质标准溶液和虾的实际样品的总离子流图。60个鱼、虾、螺样品均未检出腈菌唑、丙环唑、戊唑醇、三唑醇和吡虫啉5种农药。图4质量浓度20 g/L的虾基质标准溶液的总离子流图（A）及虾实际样品的总离子流图（B）3结论试验通过对提取溶剂、提取方式、盐析条件、净化条件等进行优化，建立LC-MS/MS快速检测水产品中的腈菌唑、丙环唑、戊唑醇、三唑醇和吡虫啉的残留分析方法。试验方法灵敏度高、可靠性和实用性良好，可作为水产品中农药残留快速定量分析的一种新方法。参考文献：1 程燕,谭丽超,周军英,等.我国环境激素类农药优先名录筛选J.农药科与管理,2014,35(4):28-35.2 ZHANG C,TIAN D,YI X H,et al.Occurrence,distribution and seasonal variation of five neonicotinoids insecticides in surface water and sediment of the Pearl Rivers,South ChinaJ.Chemosphere,2019,217:437-446.3 WANG T L,ZHONG M M,LU M L,et al.Occurrence,spatiotemporal distribution,and risk assessment of current-use pesticides in surface water:A case study near Taihu Lake,ChinaJ.Science of the Total Environment,2021,782:146826.4 SUN X L,LIU M,MENG J W,et al.Residue level,occurrence characteristics and ecological risk of pesticides in typical farmland-river interlaced area of Baiyang Lake upstream,ChinaJ.Scientific Reports,2022,12:12049.5 DONG J N,FENG Z A,KANG S S,et al.Magnetic solid-phase extraction based on magnetic amino modified multiwalled carbon nanotubes for the fast determination of seven pesticide residues in water samplesJ.Analytical Methods,2020,12:2747-2756.6 袁娜,杨臻,乔璐,等.中国与主要贸易国水产品中农药残留限量标准对比分析J.食品安全质量检测学报,2021,12(10):4244-4256.7 王维茜,杜业刚,陈玉浩.水产品中农药残留国内外标准体系分析与检测方法研究进展J.食品安全质量检测学报,2022,13(11):3690-3696.接表4基质农药5 g/kg20 g/kg50 g/kg平均回收率/%C.V./%平均回收率/%C.V./%平均回收率/%C.V./%鱼腈菌唑78.53.496.81.883.71.2丙环唑83.21.4101.32.184.32.2戊唑醇77.91.997.02.284.61.8三唑醇72.16.680.38.282.510.4吡虫啉72.14.886.91.886.33.6白螺腈菌唑91.73.893.22.688.22.1丙环唑77.42.497.21.788.81.6戊唑醇87.72.682.32.185.61.6三唑醇92.13.891.86.8103.94.2吡虫啉72.62.581.82.886.71.5