临床试验工作小结.pptx

基础分子生物学基础分子生物学基础分子生物学基础分子生物学中的几个概念中的几个概念中的几个概念中的几个概念1/1/分子生物学（分子生物学（分子生物学（分子生物学（molecular biology）：）：）：）：（广义）在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分子(核酸、蛋白质)的结构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。研究内容包括各种生命过程，比如光合作用、发育的分子机制、神经活动的机理、癌的发生等。（狭义）范畴偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或（狭义）范畴偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNADNA结构与结构与功能、复制、转录、表达和调节控制等过程。功能、复制、转录、表达和调节控制等过程。2/2/核酸（核酸（核酸（核酸（nucleic acidnucleic acid）：）：）：）：是生物体细胞内一类重要的生物大分子。其主要生物学功能是作为遗传信息的载体。核酸以核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸（nucleotidenucleotide）为基本结构单位，通过3，5磷酸二酯键形成的链状多聚体。核苷酸由戊糖（核糖）、磷酸、含氮碱基戊糖（核糖）、磷酸、含氮碱基戊糖（核糖）、磷酸、含氮碱基戊糖（核糖）、磷酸、含氮碱基三部分构成。核酸分类：核酸分类：核酸分类：核酸分类：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNADNA）核糖核酸（ribonucleic acid，RNARNA）碱基：碱基：碱基：碱基：嘧啶碱：T、C、U嘌呤碱：A、G核糖：核糖：核糖：核糖：D-2-脱氧核糖（D-2-deoxyribose）D-核糖（D-ribose）DNADNA的结构：的结构：的结构：的结构：一级结构：（共价结构）DNA分子中的核苷酸排列顺序/碱基排列顺序二级结构：（双螺旋模型）主链、碱基配对、螺旋参数、大沟和小沟高级结构：（超螺旋结构）正超螺旋、负超螺旋3/3/染色体的组装（真核生物）染色体的组装（真核生物）染色体的组装（真核生物）染色体的组装（真核生物）4/4/染色体组染色体组染色体组染色体组产品临床试验工作可分为五方面：产品临床试验工作可分为五方面：产品临床试验工作可分为五方面：产品临床试验工作可分为五方面：一、工作前的计划与准备：试验方案拟定与试验用品的准备；二、试验样本准备：人全血基因组DNA提取及信息整理；三、试验样本检测：RT-PCR检测及结果分析；四、工作流程中问题的发现、交流与解决；五、收尾与总结。一、一、工作前的计划与准备工作前的计划与准备 种类与数量种类与数量试验用品的准备试验用品的准备：1、试剂盒：、试剂盒：基因型检测试剂盒：反应液/反应酶/质控品 血液基因组DNA提取试剂盒2、耗材：、耗材：移液器（枪）：1000 ul/200 ul/50 ul/10 ul/2 ul（白色长尖）吸头（枪尖）：20 ul（白色长尖）/200 ul（黄色）/1000 ul（蓝色）吸头盒（三种规格）荧光PCR管（长且不透明、8联排）和盖子 Eppendrof 管（1.5 ml）多空板（96孔/60孔）、样本储存盒（72孔）、Marker 笔、手套3、样本信息对照表、样本信息对照表二、二、试验样本准备试验样本准备：人全血基因组人全血基因组DNA提取提取 节奏与程度节奏与程度提取前的检查与准备：提取前的检查与准备：1、检查试剂盒各溶液，若产生沉淀，须在室温放置一段时间，必要时可在37 水浴预热；2、依据提取步骤，为溶液编号；3、缓冲液GD和漂洗液PW 需加入适量无水乙醇；4、剪去吸附柱的盖子、剪去吸附柱的盖子提取步骤：提取步骤：1、第二次加入细胞裂解液CL（裂解红细胞）时，需要剧烈振荡，以充分混匀沉淀（可见管中液体深红，并有较多泡沫，管底无结块沉淀）；2、加入缓冲液GB后，充分颠倒混匀（如不充分，可能会产生白色沉淀，一般37放置时会消失，不影响后续试验）；3、56水浴时间延长至30 40 min，其间颠倒混匀数次，观察溶液是否变得清亮，并为收集管编号（如未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少、纯度不加，直接影响荧光检测）；4、水浴后加入200 ul 无水乙醇，出现絮状沉淀，轻柔颠倒混匀（此时DNA析出，故自此步骤开始，颠倒要轻柔缓慢，否则破坏DNA结构）；5、最后向吸附膜中间位置悬空滴加100ul 超纯水。三、三、试验样本检测：试验样本检测：RT-PCR检测及结果分析检测及结果分析 精细、顺序、安全精细、顺序、安全RT-PCR前的准备：前的准备：1、超净工作台紫外光灭菌；2、从-20 取出扩增反应所需的反应液和质控品，置于室温溶解，涡旋混匀约 10 s，离心待用（可使试剂充分溶解混匀，避免因体系溶质不均匀影响反应）；3、准备荧光PCR八联排管（白色/长管 长管与ABI 7500仪器符合度较好，利于充分受热，否则严重影响检测结果，导致荧光信号低），并做适当标记；RT-PCR 反应体系的分装与加样：反应体系的分装与加样：1、移液器的“连续吸放液”调移液器量程至23ul，将排放按钮按至第一停点（第一档），再将吸头垂直浸入液面，平稳松开按钮，在液面之下，再次将排放按钮按至第一档，排出吸头尖端的气泡后，松开按钮，吸入液体，之后放液只需按至第一档即是23ul（如吸头尖端仍有气泡，可反复吸放，直至排净气泡）；2、样本放置顺序、吸头安装顺序、试验者感知顺序三者形成“校正机制”，保障顺序加样（校正机制的建立，有助于连贯而正确地加样）；3、移液器的吸放液要“慢吸快放”，且试验者要观察吸头尖端，进行视觉“校正”，避免吸空放空；4、放液时，吸头先伸入液面以下放出液体，再在管壁处打净残液（如吸头仍存残液，将移液器按至第二档，将残液打至吸头尖端处，拔掉吸头，并再次安装回去，将残液打回管中）；5、不能直接用手触摸PCR管，因为人的手上含有荧光素，沾染在管壁上的荧光素会影响荧光仪检测。操作时必须戴不含荧光物质的一次性手套并且要经常更换（应使用镊子夹取管子和管盖）；6、吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；7、加样完成后，盖紧盖子，并离心；8、超净工作台使用后，用次氯酸钠擦拭，避免试验环境污染；结果分析：结果分析：分析的思路：分析的思路：1、基线和阈值的选择和设置是否正确（直接与Ct值相关）；2、阳性和空白对照的结果是否正常（既可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性，空白对照的污染将导致结果失信。如空白对照出现阳性，则为污染，需检查试剂准备区域是否污染、检查使用的器材是否污染、检查实验室的区域分离和人流物流的单向流动等）；3、扩增曲线的线形关系如何（“S”型扩增曲线，分为四个阶段：基线期、指数增长期、指数扩增期、平台期）分析中遇到的问题：分析中遇到的问题：