ELISA法检测花生酱中黄曲霉毒素B1前处理方法的改进研究.pdf

1 5 2 4 中国卫生检验杂志 2 0 0 7年 8月 第 1 7卷 第 8期C h i n e s e J o u rna l o f H e a l t h L a b o r a t o r y T e c h n o lo g y，A u g 2 0 0 7；V o l 1 7 N o 8 【经验交流】E L I S A 法 检测 花生酱中 黄曲 霉毒素B。前处 理方 法的改 进研 究 齐齐(辽宁省大连市甘井子区疾病预防控制中心，辽宁大连 1 1 6 0 3 1)关键词 酶联免疫吸附试验(E L I A S)法；黄曲霉毒素 B。；前处理 中图分类号 R 1 5 5 5 文献标识码 c 文章编号 1 0 0 48 6 8 5(2 0 0 7)0 81 5 2 4-0 2 黄曲霉毒素 B 是黄色曲霉菌(A s p e r g i l l u s fl a v u s)或寄生 曲霉菌(A s p e r g i l l u s p a r a s i t i c u s)的主要次生代谢产物，在 自然 界中广泛存在，是 目前已知的自然物质中致癌性最强的一种。黄曲霉毒素 B 毒性剧烈，致癌性强，即使含量非常少，通过生 物积累，也能引起人体器官癌变，所以它在食品中的安全限量 为 1 5 k g以下 J。目前检测黄曲霉毒素 B 主要有 3种方法：1 薄层法(国标第一法，G B T 5 0 0 9 2 22 0 0 3)；2 酶联免疫法(E L I S A 法)(国标第二法)；3 液相色谱法。其 中薄层法样品处理繁 琐，毒性大，灵敏度低，液相检测成本高，样品处理复杂，只有 酶联免疫法，成本低廉，灵敏度高，操作简便，成为现在大多数 检测机构所采用的一种方法。但由于食品样品的多样性，不 同样品、不同提取方法仍然会对 E L I S A法检测结果有影响口 。本文针对目前检测较广的花生酱样品的前处理方法进行了改 进研究，以供相关检测人员参考。1 材料与方法 1 1 主要仪 器与材料 酶标仪、微量振荡器、恒温培养箱、黄曲霉毒素 B，检测试 剂盒、花生酱。1 2样品提取 方法 1 2 1 改进方法(甲醇 一水提取)准确称取 5 0 g花生酱 于 2 5 0 ml 具塞锥形瓶 中，再准确加入 2 5 0 m l 的 甲醇 一水(1：1)提取液，然后加入 2 0 m l石油醚或正己烷，将瓶塞盖紧，水 封后，在振荡器上振荡 3 0 m i n(7 0 0 r m i n)，用定性快速滤纸过 滤于 1 2 5 m 1 分液漏斗中，静置分层，放出下层清液于 2 5 m l比 色管 中，为样品提取液 1。1 2 2 国标 方法 参 照 国标(G B T 5 0 0 9 2 2 2 0 0 3)内容，制作样品提取液 2。1 3 黄曲霉毒素 B 标准溶液配制 用甲醇将黄曲霉毒素 B 标准品配制成 1 m g m l 工作液，再用甲醇 一P B S 溶液(2：8)稀释至相应浓度，紫外分光光度计 测定溶液(3 6 0 n m波长)的光密度值，代入下式计算：X=A xM x1 0 0 0 xf E 式中：x 一该溶液中黄曲霉毒素 B。的浓度，g m l A 一测得的光密度值 作者简介 齐齐(1 9 7 9一)，女，学 士，检验师，主要从 事微生物 检验工作。M 一黄曲霉毒素 B 的分子量3 1 2 E 一摩尔消光系数，2 1 8 0 0 f-_使用仪器的校正因素 根据计算将该溶液配制成 1 0 g m l 标准溶液，检测时，用 甲醇 一P B S 溶液将该标准溶液稀释至所需浓度(0 1、0 5、1 0、5 0、1 0 _ k g)。1 4 酶联免疫法检测步骤(参照试剂盒说明书)配制实验用酶标抗原溶液。洗涤液清洗抗体板条 2次，拍干后备用。选择数孔分别加入 5 0 l 黄曲霉毒素 B。系列标 准溶液(0 1、0 5、1 0、5 0、1 0 g k g)，其余孔中各加入 5 0 l 待测样品提取液，随即在各孔中分别加入 5 0 l 酶标抗原溶 液，摇匀，3 7 C避光温育 3 0 m i n。将温育后的抗体板取出，弃 去未反应抗原溶液，用洗涤液洗涤 5次，每次问隔 2 m i n。拍 干后各孔分别加入 5 0 l 底物液和 5 0 l 显色剂。3 7 C显色 1 5 m i n。往各孔中分别加入 5 0 l终止液，立即用酶标仪在 4 5 0 n m波长处测定各孔 O D值，并绘制标准曲线，计算出样品 中黄曲霉毒素 B 的含量。2结果 与分析 2 1 不同稀释度对 回收率的影响 根据以前文献的报道 J，样品提取液中甲醇的含量较高 易对测定结果造成假阴性。由于改进方法 的样 品提取 液 中的 甲醇含量为 5 0，易造成较大误差，因此对样品提出液 1 进行 稀释，用甲醇 一P B S(2：8)溶液分别稀释 2 倍、5倍、1 0倍，通过 不同加标浓度的回收率测定来确定最佳稀释度(见表 1)。表 1 样 品提取液 1不同稀释度加标回收率的测定 从表 1 中可以分析 甲醇对反应系统的影响，甲醇含量太 高，加标回收率就会很低。当稀释度为 5倍时，即样品测定液 中甲醇含量为 2 6 时，加样回收率接近 1 0 0，与文献 的结 论相符，可以确定该稀释度为最佳稀释度。同时也能发现在 加样浓 度为 5 g k g时，回收率 比加样浓 度 1 g k g和 1 0 g k g要理想，主要原因是浓度 5 g k g在稀释 1倍，5 维普资讯 http:/ 中国卫生检验杂志 2 0 o 7年 8月 第 l 7卷 第 8期C h i n e J o u m0 f H e a l 出 L a b o mt o r y T e c h n 0 l o g y，A u g2 7；V o l 1 7 N o 8 1 5 2 5 倍，1 0倍后，实际浓度都在 E L I S A检测标准 曲线线性范 围 内。2 2 两种前处理方法回收率比较 选取 1 0份花生酱样品，进行 5 g k g浓度的加标，通过两 种前处理方法的提取稀释 5倍后，按方法 1 4 E L I S A检测步骤 测定回收率(见表2)。表 2两种前处理方法回收 率测定 比较 样品编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 平均值 改进方法()8 1 9 9 8 0 7 5 5 l o 8 0 8 8 2 7 5 1 1 1 6 1 9 4 5 6 6 9 l 0 7 1 9 1 1 国标方法()6 5 3 6 4 2 4 9 9 6 q 0 6 2 9 5 8 1 7 4 5 6 7 6 5 0 5 7 9 4 6 4 1 由以上数据可以看出，改进方法的回收率比国标法要高，这是由于国标法用三氯甲烷进行二次抽提，降低了回收率，只 有5 0 8 0。其实在实验过程中，我们可以发现在用三氯 甲烷进行抽提的最后一步，用 1 0 0 m l甲醇 一水(1：1)去溶解 凝结物，其实凝结物不易全部溶解，粘附于蒸发皿壁上，即使 先用纯甲醇溶解，效果也不太理想，这可能就是 回收率较低的 主要原因之一。3 讨论 花生酱是一种广泛食用 的食品，富含亚油酸等人体必需 的不饱和酸，特别有利于人体的吸收和消化作用，而且多吃 花生酱可以有效降低人体内胆固醇含量，减少罹患心脏病的 危险。花生酱的主要生产原料是花生仁，花生是 自然界中最 易被黄色曲霉菌、寄生曲霉菌等污染的农作物之一，较高的 含水量使花生酱非常容易霉变，所以监管部门对花生酱中黄 曲霉毒素含量的检测十分必要。由于花生酱含油量高，添加剂成份复杂，粘度大，如果要 在样品提取过程中完全去除油脂、荧光物质、色素、结构类似 物等难度非常高。如果应用薄层色谱法、高效液相法等，这些 干扰因素对方法影响较大，要消除这些影响，不仅操作繁琐，测定结果也容易产生较大误差。E L I S A法应用抗原抗体的免疫反应原理，专一性强，干扰 因素的影响相对较小。由表 1的数据可以看出，用甲醇 一水 对样品进行简单的提取后再对提取液进行一定倍数的稀释，即可获得 比较满意 的结果，省 去了后 面用 三氯 甲烷进 行重 复 提取的步骤，不仅提高了回收率，也简化 了样品的提取过程，从而提高了工作效率，减少了挥发性溶剂对实验室和实验人 员可能产生的污染。参考文献】1 居 乃琥 黄曲霉毒素 M 北京：轻工业出版社，1 9 8 0 59 8 2 G B 2 2 2 0 o 3 食品卫生检验方法理化部分(一)s 3 赵 晓联，赵春城 酶联 免疫 吸附法测定 A F B l误差分析 J 中国 卫 生检验杂志，2 0 o 2，1 2(1)：6 o一 6 2 4 孙秀兰，赵晓联，汤坚，等 大米中黄曲霉毒素 B 的提取方法优化 J 食品科学，2 o o 5，l l(7)：6 7 56 7 7 (收稿 日期：2 0 o 7 0 4 2 3)(上接第 1 5 0 2页)表 1 3 3 7例呼吸道j豉染者 E S R、血清 c RP及 wB c分析 E S R与 C R P、wB c比较 分别 为 5 5 8 7和 1 3 0 4，P均 o 0 o l E S R和 C R P异常者经过治疗后复查，随临床症状好转，E S R及 C R P恢复正常。与末梢血 WB C比较，E S R和 C R P检 测的阳性率显著升高(P 0 0 0 1)。3讨论 E S R是指在一定条件下红细胞的沉降速度，与红细胞数 量、表面积、直径、血红蛋白量和各种蛋白比例等有关，一般情 况下，细胞因素变化较小，疾病时血浆因素变化较大，如机体 有感染、组织损伤、坏死或某些疾病有无活动、进展、恶化及肿 瘤浸润、播散、转移等时，红细胞相互重叠呈“缗钱”状后所承 受的血浆阻力减少，使血沉加快，但血沉是缺乏特异性的指 标。C R P是一种能与肺炎球菌 C多糖体反应形成复合物的急 性时相反应蛋白，由肝脏合成，能激活补体促进细胞吞噬等免 疫功能，表现炎症反应，是急性时相反应极灵敏的指标。非特 异性急性细菌性感染时急剧增高；病毒感染 C R P增高不如细 菌感染明显 J，且受其它因素影响很小。临床上不少发热、呼吸道感染的病人，尤其是儿童，医生 在鉴别细菌性或病毒性感染时，最常用的检验指标是血细胞 分析。从表 1 可以看 出，E S R和 C R P也是 一个很 好的鉴别 指 标。E S R和 C R P配合血常规结果更有助于发热原因的分析。同时检测 E S R和 C R P还可以用来监测疾病的活动情况和严 重程度，对观察治疗效果有很好的导向作用，特别是对抗生素 的合理应用有提示性作用。当治疗有效、病情好转或缓解时，E S R和 C R P恢复正常，治疗无效时继续上升。作为一种炎症 筛选指标，E S R和 C R P检测特别对不能表达症状的病人：婴儿 和儿童等，有很好的提示作用，故此 E S R和 C R P可以作为感 染性疾病的诊断和治疗的监控指标。参考文献】1 冯树星，曾宇娟，张亮明，等 不同疾病血沉动态观察结果分析 J 贵州医药，2 0 o 5，2 9(8)：7 4 7 7 4 7 2 钱玉英，陈秉良 老年肺部感染患者生长激素一胰岛素样生长因 子轴的变化与蛋 白代 谢关 系 J 中国实 用 内科 杂志，2 0 o 5，2 5 (4)：3 3 6 3 3 7 (收稿 日期：2 0 o 7一 o 4 2 3)维普资讯 http:/