PBOO对豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞形态结构的影响.docx

PBOO对豚鼠膀胱卡哈尔间质细胞形态结构的影响【摘要】 目的 探讨豚鼠膀胱流出道梗阻对膀胱卡哈尔间质细胞形态结构的影响。方法 建立雌性豚鼠PBOO模型，并根据尿动力学检测结果将模型分为PBOO后逼尿肌不稳定组和PBOO后逼尿肌稳定组，以假手术组作为对照，饲养4周后取膀胱组织，制成全层组织铺片和冰冻组织切片，ckit免疫荧光染色分别观察各组膀胱肌层和黏膜下ICC的形态和分布情况。结果 PBOO 4周后，DO组豚鼠膀胱出现排尿频率、排尿压力的增加，并且观察到明显的储尿期膀胱不稳定收缩。对照组、DS组和DO组豚鼠膀胱均观察到ckit染色阳性且呈典型长梭形有突起的ICC，主要分布于平滑肌肌束间和黏膜下层；在DO组豚鼠的膀胱中ckit染色阳性的ICC分支突起增加且互相连接呈网络状，而在对照组和DS组中ICC呈散在分布，细胞之间联系较松散。结论 在PBOO所致DO豚鼠膀胱中ICC发生了形态和结构的变化，相互之间连接呈网络状， ICC的形态和结构的变化可能是逼尿肌不稳定的重要发病基础。【关键词】 卡哈尔间质细胞；逼尿肌不稳定；膀胱流出道梗阻；膀胱Abstract： Objective To investigate the altered morphology characters of interstitial cells of Cajal cells (ICC) in guinea pig bladder after partial bladder outlet obstruction (PBOO).Methods Partial bladder outlet obstruction (PBOO) animal models were produced in female guinea pigs and were validated with urodynamic examination. Animals with unstable bladder pressure after PBOO were set as DO group .Animals with stable bladder pressure after PBOO were set as detrusor stable (DS) group and control group was composed by shamoperated animals. Immunohistochemistry studies for ckit as a specific mark for ICC were performed on guinea pig bladders in each group. Results Four weeks after surgery, animals in DO group showed an increased voiding frequency, higher voiding pressure and irregular nonvoiding contractions (n=12, ). We found increasing mutual connection and multilayer construction in suburothelium and intermuscular layers of DO but not DS and control bladders. Conclusion Those findings demonstrated the morphological and structure differences of ICC in guinea pig bladder after PBOO, which suggest ICC be involved in the etiopathogenesis of DO.Key words： cajal interstitial cells ; detrusor overactivity; partial bladder outlet obstruction; bladder膀胱逼尿肌的兴奋和收缩可受神经、体液等多种因素的调控和影响。目前的研究表明，膀胱平滑肌的兴奋调控可能与一种特殊的间质细胞，卡哈尔间质细胞有关1。ICC首先在胃肠道组织中发现，其细胞膜上带有特异性的ckit受体酪氨酸激酶的表面标记。ICC对胃肠道基本电节律的形成、神经传导的调控、信号整合等多种生理功能起到了重要的作用。目前，在胃肠道组织以外的多种平滑肌组织陆续发现了ICC的存在34，但是胃肠道外ICC的功能学研究尚处于起步阶段。 逼尿肌不稳定(Detrusor Overactivity， DO)是常见的膀胱功能障碍， 临床上常表现为一种以尿急症状为特征的征候群，常伴有尿频和夜尿症状，可伴或不伴有急迫性尿失禁；尿动力学上可表现为膀胱储尿期的膀胱不稳定收缩。根据2002年国际尿控协会的定义，DO在尿动力学的描述中为充盈期出现无意识的逼尿肌自发或经诱发的收缩。DO常伴发于膀胱流出道梗阻的患者。然而相当一部分患者在机械梗阻病因解除后排尿功能障碍并未得到有效缓解，提示逼尿肌不稳定的发病机制还有待进一步研究。既往的很多研究中关于神经调控异常和逼尿肌自身的结构变化等假说也不能满意的解释DO的发病原因，而ICC在膀胱中的发现和初步研究表明，膀胱ICC在调节膀胱的局部收缩和逼尿肌自发性兴奋中可发挥重要的作用，因此，基于膀胱ICC的相关研究可能是对DO等膀胱功能障碍性疾病发病机制的重要补充。 本研究建立膀胱流出道部分梗阻致DO模型，通过免疫荧光标记的方法，比较ICC在PBOO膀胱中形态结构的差异，为进一步认识DO的发病机制打下一定基础。1 材料与方法主要材料与试剂 健康雌性豚鼠，体重320460 g，34月龄，购自第三军医大学动物实验中心。激光共聚焦显微镜，RM6240多通道生理检测仪，微量输液泵，羊抗豚鼠ckit多克隆抗体，大鼠抗豚鼠平滑肌肌动蛋白(SMM)单克隆抗体，驴抗羊AF488荧光二抗、驴抗大鼠AF594荧光二抗，DAPI细胞核染料。实验方法豚鼠膀胱流出道部分梗阻模型建立 参照Kubota等人的实验方法构建豚鼠DI模型。简述1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，将直径为1 mm 的硬膜外导管经尿道外口插入膀胱，以此作为尿道支撑。取下腹部正中切口，长约2 cm，切开皮肤及皮下组织，剪开腹直肌前鞘腱膜，分离腹直肌，找到膀胱，仔细游离膀胱-尿道交界处，近端尿道稍作分离，于此处穿过2-0丝线，结扎近端尿道，结扎丝线的松紧标准以牵拉探子时周围组织可随之移动，而探子又可轻易拔除为度，然后拔除探子，逐层缝合关闭切口。假手术组动物按照上述手术方法行开腹及近端尿道钝性分离，但不行结扎梗阻实验，作为对照。术后每只豚鼠单笼喂养，保持动物笼清洁干燥。所有实验动物术后适量使用抗生素：庆大霉素 mg/kg，腹腔注射，1次/d，共3 d。豚鼠膀胱尿动力学检测 PBOO手术4周后行尿动力学检测。25%乌拉坦溶液按1 g/kg 体重腹腔内注射麻醉。豚鼠取仰卧位，四肢固定，乙醇消毒尿道外口及会阴部，将外直径为1 mm 的硬膜外导管经尿道外口插入膀胱 (见尿液流出)；若为PBOO后模型豚鼠，可打开腹腔解除梗阻后再行插入。 轻压豚鼠腹部，排尽尿液，导管接5号针头，经三通管与尿动力检测仪及微量灌注泵相连。设置测压参数：压力模式，扫描速度10 s/div，灵敏度 cmH2O，时间常数直流，采集频率400 Hz，滤波频率30 Hz；标定零点。用微量灌注泵以 ml/min 速率灌注，膀胱灌注液采用生理盐水，同步记录随容积增加膀胱压力波形、膀胱容量以及排尿间隔时间。豚鼠膀胱组织铺片和冰冻切片免疫荧光染色 在标本制作中使用组织冰冻切片和组织全层铺片两种方法，前者主要观察黏膜下ICC；而后者主要用于观察肌层的ICC。组织铺片的制作方法为：断颈处死动物，下腹部正中切口暴露膀胱，结扎双侧输尿管，将4多聚甲醛自尿道注入膀胱内，维持充盈状态并固定10 min。将充盈的膀胱剪下置入4多聚甲醛中继续固定68 h 后，沿腹侧面纵行剪开，在解剖显微镜下，小心剔除黏膜层。将肌层组织制成含12 层肌细胞厚度约100200 m 的组织铺片。冰冻切片的制作方法为：动物处死和标本采集同上，膀胱组织4多聚甲醛固定68 h，10%30%蔗糖溶液梯度脱水过夜，-20 下OCT冰冻包埋液包埋组织，冰冻切片机沿垂直于黏膜层方向行20 m 冰冻切片，贴于多聚赖氨酸处理防脱载玻片表面。切片和铺片标本的荧光染色方法相同，简述1%BSA室温孵育1 h 后加入羊抗豚鼠ckit和大鼠抗豚鼠SMM一抗4 孵育过夜，PBS漂洗3次，每次10 min，加入驴抗羊AF488和驴抗大鼠AF594荧光二抗室温孵育1 h，DAPI复染细胞核10 min，PBS漂洗2次，每次10 min。激光共聚焦显微镜观察。统计学方法 数据用xs表示，软件进行t检验。2 结果PBOO模型制作和尿动力学检测 PBOO模型组动物18只；对照组动物5只。模型组意外死亡4只，排除实验，对照组动物全部存活。对照组膀胱充盈性测压曲线较平滑，排尿反射存在，充盈过程中可观察到少量自发性收缩，幅度微小，如图1A所示。PBOO后9只豚鼠出现膀胱测压曲线不平滑，膀胱容量及压力增加，排尿反射频繁，充盈过程中自发性收缩波幅增大，定义为DO组。另5只豚鼠梗阻后压力稳定膀胱测压曲线较平滑，膀胱容量和排尿压力均显着大于正常对照组，膀胱充盈过程中未见自发性收缩波，定义为逼尿肌稳定(Detrusor Stable，DS)组。各组的尿动力学检测结果见表1。膀胱组织免疫荧光染色 组织铺片荧光染色可见豚鼠膀胱组织平滑肌束间和肌束内有形态典型的ckit阳性的ICC细胞(封4图3A，箭头所示)，大部分细胞呈纺锤形或长梭形有突起，散在分布于平滑肌肌束之间，少量存在于平滑肌肌束内， 缺乏相互的连接。少量ckit阳性细胞为圆形或类圆形无突起和侧枝， 根据文献报道， 该类细胞为肥大细胞。DS组豚鼠膀胱组织ckit染色阳性的ICC细胞分布和形态与对照组类似。而在DO组我们观察到ckit阳性的ICC的形态和组织结构发生了变化，逼尿肌束之间的ICC排列较为紊乱， 细胞突起数量较对照组和DS组明显增多且相互观察到排尿连接呈网状，。在切片标本中我们主要观察黏膜下层ICC，正常膀胱和DS膀胱中黏膜下ckit阳性的ICC紧贴黏膜层，相互之间首尾相接，呈12层排列，而DO膀胱中黏膜下ICC层次明显增多，ICC排列较为紊乱。黏膜层由于上皮细胞对抗体的黏附作用，因此SMM和ckit均为阳性，染色呈金黄色，。图1 各组膀胱充盈测压曲线A、B、C分别为对照组、DS组和DO组，箭头示表1 各组动物充盈性膀胱测压结果与对照组比较, ；与DS组比较,3 讨论 DO是常见的膀胱功能障碍性疾病。以往基于神经控制理论，提出了许多DO发病机制的假说，如：神经超敏学说、受体分布失衡学说等等89。但是临床上针对DO的治疗难以取得令人满意的疗效。很多学者都发现了膀胱逼尿肌在去神经状态下可以出现自发性的收缩，这种自发的逼尿肌活动在DO膀胱中具有高频率、低阈值的特点。因此，膀胱功能调控除了神经因素之外的膀胱源性局部因素受到了越来越多的关注。很多研究都表明，膀胱平滑肌的兴奋调控可能与一种特殊的间质细胞，ICC有关。膀胱中存在ICC最初是在2002年由英国学者McCloskey发现10，在他的一系列研究中探讨了膀胱ICC的分布、形态学特征及其与神经的相互关系，2007年的第五届国际Cajal间质细胞论坛建议将泌尿系这一类与胃肠道ICC有相似形态学特征的间质细胞命名为泌尿系ICC11，本文对于该类间质细胞的命名也借鉴了上述标准。目前的研究表明，膀胱ICC有与胃肠道ICC类似自发性兴奋的特点，乙酰胆碱等神经递质可兴奋膀胱ICC12，但是关于膀胱ICC的功能学研究目前尚不成熟。 借鉴胃肠道ICC的分群方法，可将膀胱ICC按照其主要分布特征分为：膀胱黏膜下层ICC和膀胱肌束间ICC以及肌束内ICC1,13，为了能更好地观察各群ICC的分布，我们在实验中采用冰冻切片和组织铺片的方法分别观察黏膜下和肌层的ICC。我们的研究表明，ICC在DO膀胱中的形态和结构发生了一系列变化，主要表现在肌间层ICC相互连接增加和黏膜下层ICC分布的变化，由于膀胱ICC具有自发性兴奋性的特点，其相互联系的增加可能是整个膀胱兴奋性改变的结构基础。当然并非所有的动物在PBOO之后都发生了ICC的变化，部分梗阻后逼尿肌稳定的动物膀胱ICC与正常膀胱类似。我们推测这可能与动物对手术耐受的个体差异以及梗阻的时间等因素有关，但由于梗阻时间过长难以保证动物的存活率，因此我们将梗阻时间限制在4周以内。这也进一步证实了ICC与DO的发生存在密切的关系。到目前为止，膀胱ICC相关的研究还很有限，但是越来越多的证据表明：ICC对于膀胱正常生理功能的维持有着重要的意义，是正常排尿生理和泌尿系统病理生理学研究的新方向。同时，ICC在膀胱功能障碍中的作用也引起越来越多的关注。ICC结构和功能的异常可能是DO重要的发病机制之一。【参考文献】 1 Davidson RA, McCloskey KD. 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