饲料中霉菌总数测定方法.pdf

2012-XX-XX 定稿编制人参照GB/T 13092-2006 饲料中霉菌总数测定方法审核人批准人霉菌总数检测操作规程1 原理根据霉菌生理特性，选择适宜霉菌生长而不适宜细菌生长的培养基，采用平板计数法测定霉菌总数。2 试剂与仪器2.1 所用器具三角烧瓶、玻璃珠、具塞试管、培养皿、1000L 枪头、5mL 枪头、称量勺、接种环、接种针、移液器2.2 仪器：分析天平、恒温培养箱、微型振荡器、超净工作台、高压灭菌锅2.3 所用试剂和培养基高盐察氏培养基取高盐察氏培养基 109g，加入蒸馏水 1L，搅拌加热 至完全溶解，分装三角瓶，115高压灭菌 30 min，备用。3、操作步骤3.1 配制 0.85%生理盐水称取氯化钠 8.5g 溶于 1000mL 蒸馏水中。3.2 锥形瓶加入生理盐水 90mL，试管中加入生理盐水 9mL，121灭菌 30min。（三角烧瓶个数与样品数量一致，试管数量与稀释次数相关）。3.3 将 1000L 枪头、培养皿、5mL 枪头、称量勺、带 6 颗玻璃珠具塞试管，121灭菌30min。（注意计算数量）3.4 枪头、培养皿置于烘箱 103烘干。（1-31-3 步需提前一天完成）步需提前一天完成）3.5 对称量房间进行紫外灭菌 30 分钟，关灯静置 60 min。以无菌操作取样品 10g 于含 90mL生理盐水三角烧瓶中，于振荡器上振荡 30min，制成 1:10 的均匀稀释液。3.6 吸取 1:10 稀释液 10mL 注入带玻璃珠的试管，置微型混合器上混合 3min。3.7 用 1000L 枪头吸取 1:10 稀释液 1mL，沿管壁慢慢注入含有灭菌生理盐水 9mL 的试管中，于振荡器上混合均匀，制成 1:100 的均匀稀释液。3.8 另取一只 1mL 灭菌吸管，按照上述操作方法，作 10 倍递增稀释，如此每递增稀释一1 12012-XX-XX 定稿编制人参照GB/T 13092-2006 饲料中霉菌总数测定方法审核人批准人次，更换一支灭菌吸头。3.9 选择 3 个适宜稀释度，分别在作 10 倍递增稀释的同时，吸取该稀释的吸管移 1mL 稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个培养皿。3.10 稀释液移入培养皿后，及时将凉至 461的高盐察氏培养基（可放置 461水浴锅内保温）注入培养皿约 15mL，小心转动培养皿使试样与培养基充分混匀。3.11 待琼脂凝固后，倒置平皿于 281恒温培养箱内培养 3 天后开始观察，培养观察一周。计算平板内菌落总数目，菌落总数乘以稀释倍数，即得每克试样所含霉菌总数。4 霉菌总数计算方法做平板菌落计数时，可用肉眼观察，如菌落形态较小可借助放大镜观察。在计算出各平板菌落总数后，求出同稀释度的两个平板菌落的平均值。4.1 霉菌总数的报告形式菌落总数在 100 以内时，按其实有数报告，大于 100 时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法修约。为了缩短数字后面的零数，也可以用 10 的指数表示。（见表 1）4.2 霉菌总数计数的报告4.2.1 平板霉菌总数的选择选择菌落总数在 10100 之间的平板进行霉菌总数测定，每一稀释度使用两个平板菌落的平均数。两个平板其中一个平板有较大片状菌落生长时不宜采用；若片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘 2 以代表全平皿霉菌总数。4.2.2 稀释度的选择应选择平均菌落总数在 10100 之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之（见表 1 中例次 1）若有两个稀释度，其生长的菌落总数均在 10100 之间，则视两者之比如何来决定。若其比值（高稀释度数值：低稀释度数值）2，应报告其平均值；若2 则报告其中较小的数字（见表 1 中例次 2 及例次 3）。若所有稀释度的平均菌落总数均大于 100，则应按稀释度最高的平均菌落总数乘以稀释倍数报告之（见表 1 中例次 4）。若所有稀释度的平均菌落总数均小于 10，则应按稀释度最低的平均菌落总数乘以稀释倍数报告之（见表 1 中例次 5）。22012-XX-XX 定稿编制人参照GB/T 13092-2006 饲料中霉菌总数测定方法审核人批准人若所有稀释度均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释度报告之（见表 1 中例次 6）。若所有稀释度的平均菌落总数均不在 10100 之间，其中一部分100，或者小于 10时，则以最接近 10 或 100 的平均菌落总数乘以稀释倍数报告之（见表 1 中例次 7）。表 1 稀释度选择及菌落总数报告方式例稀释液及菌落总数次10-110-210-3123456多不可计多不可计多不可计多不可计90多不可计808795多不可计208122011000稀释液之比1.42.1稀释度选择取平均菌落总数在 10100 之间的稀释度10100 之间，比值（12000：8700）2，报告平均值10100 之间，比值（20000：9500）2，报告较小的数值所有稀释度的平均菌落总数均大于 100，报告稀释度最高的数所有稀释度的平均菌落总数均小于 10，报告稀释度最低的数所有稀释度均无菌落生长，则以1 乘以最低稀释度所有稀释度的平均菌落总数均不在 10100 之间，报告最接近10 或 100 的数霉菌总数报告方式/CFU/g（mL）/CFU/g（mL）8000103509500110000901108.0101.0109.5101.1109010534371023102001.0104注：CFU/g（mL）与个/g（mL）相当3