DB36T1846-2023家畜化脓隐秘杆菌病诊断技术规范.docx

ICS 11.220CCS B 41DB36江西省地方标准DB36/T 18462023家畜化脓隐秘杆菌病诊断技术规范Diagnostic specifications for Trueperella pyogenes disease in livestock2023 - 09 - 18 发布2024 - 03 - 01 实施江西省市场监督管理局 发 布DB36/T 18462023前言本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江西省农业农村厅提出并归口；本文件起草单位：江西省农业科学院畜牧兽医研究所、赣州市畜牧业发展和动物疫病防控中心。 本文件主要起草人：谭美芳、杨群、曾艳兵、李海琴、季华员、谭佳、张帆帆、方绍培、黄美峰、吴诚诚、饶煜玲。IDB36/T 18462023家畜化脓隐秘杆菌病诊断技术规范1 范围本文件规定了家畜化脓隐秘杆菌病诊断的术语和定义、试剂与器材、临床诊断、病原菌的分离培养、 病原菌的鉴定、结果判定和生物安全。本文件适用于牛、羊、猪等家畜化脓隐秘杆菌病的诊断、检疫及流行病学调查。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 4789.6-2003食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验GB/T 4789.28食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求GB 19489实验室生物安全通用要求NY/T 541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1化脓隐秘杆菌 Trueperella pyogenes化脓隐秘杆菌，原称化脓棒状杆菌、化脓放线菌，属于放线菌科隐秘杆菌属，是一种无荚膜、无芽 孢、无鞭毛、不运动的短棒状杆菌，革兰氏阳性，兼性厌氧，具有溶血活性。该菌主要定植在动物的皮 肤、呼吸道、泌尿生殖道和胃肠道等黏膜表面，是一种内源性、条件性致病菌。3.2化脓隐秘杆菌病 Trueperella pyogenes disease由化脓隐秘杆菌感染动物引起的以化脓性炎症为主的传染病，常导致牛、羊、猪等多种家畜的化脓 性肺炎、子宫内膜炎、乳房炎、关节炎、脓肿等疾病，严重时引发败血症而死亡。4 试剂与器材4.1 试剂4.1.1 普通琼脂平板、鲜血琼脂平板和生化发酵管的配制，按 GB/T 4789.28 的要求实施。4.1.2 PCR 相关试剂按 GB/T 4789.6-2003 中第 4 章的规定准备。15.1 流行病学该病常呈散发，不同年龄和品种的家畜均可感染，乳房炎的发生多见于炎热的夏季，停乳期奶牛和 青年母牛易感；关节炎多发于犊牛和仔猪。病原菌可通过病畜上呼吸道、乳房、外阴等的分泌物和粪便 排出，直接或间接通过饮水器和其他污染物传播；该菌还可通过打耳号、去势等途径感染。5.2 临床症状5.2.1 化脓性肺炎病畜体温升高，食欲减退，伴有咳喘、流涕、呼吸急促等呼吸道症状，渐进性消瘦。5.2.2 子宫内膜炎患病母畜发情期分泌物量多、不能成拉丝状，或量少、粘稠、浑浊。产后食欲不振，弓背努责，排 出污红色、粘稠的分泌物，恶臭。患病母畜一个或多个乳区发生炎症和水肿，乳房分泌物变色、粘稠，呈奶油样或浆液样，恶臭；严 重时乳区变松软，脓肿向外破溃，发热，食欲不佳，停止反刍。5.2.4 化脓性关节炎病畜精神沉郁，采食量下降，关节肿胀，跛行或不能站立。5.2.5 皮下或肌肉脓肿颊部、淋巴结等部位可见大小不等的脓包。5.3 病理学变化5.3.1 化脓性肺炎剖检可见喉头和气管中存在泡沫样黏液；胸腔有脓性浑浊积液，胸膜增厚；肺部表面有黄白色脓肿 或坏死灶，间质增宽，伴有不同程度的充血、实质性肉变。5.3.2 子宫内膜炎剖检可见子宫体积增大，宫颈口不同程度的肿胀和充血，宫腔内有脓液，子宫内膜有糜烂或溃疡灶。5.3.3 化脓性乳房炎剖检可见乳腺组织内有大小不等的化脓灶，弥散分布，充满黄白色或黄绿色的脓性渗出物。5.3.4 化脓性关节炎剖检可见关节腔内有脓汁，关节软骨上有黄色干酪样物。25.2.3 化脓性乳房炎5.3.5 皮下或肌肉脓肿剖检可见脓肿有较厚的纤维素包膜，内含白色或黄绿色脓汁。淋巴结脓包剖检还可见淋巴结被大量 结缔组织包裹，质地坚硬。6 病原菌的分离培养6.1 样品的采集、保存与运输分泌物、脓汁、乳汁、组织等病料样品的采集、保存与运输按照NY/T 541的要求执行。6.2 细菌分离培养6.2.1 接种样品接种在无菌条件下进行。用消毒后的剪刀处理组织病料，露出无菌切面，用无菌接种环自切面 处伸入组织内部，划线接种于普通琼脂平板和鲜血琼脂平板；液体样品直接划线。6.2.2 菌落形态观察7 病原菌的鉴定7.1 镜检革兰氏染色阳性，无荚膜，无芽孢，无鞭毛，散在分布，形态不均一的棒状短杆菌。7.2 生化鉴定7.2.1 生化试验挑取符合 6.2.2 特征的疑似菌落，按 GB4789.28 中规定的方法接种生化发酵管，于 37恒温培养18 h24 h。7.2.2 生化特性记录生化试验结果。表 1 化脓隐秘杆菌生化反应结果3接种后的平板在37恒温条件下倒置培养48 h，观察菌落特征。普通琼脂平板上不生长，鲜血琼脂平板上形成的菌落形态单一，白色或灰白色，圆形，湿润，半透明，表面光滑隆起，直径约1 mm，且菌落周边形成透明的-溶血环，则为化脓隐秘杆菌疑似菌落。生化试验项目反应结果生化试验项目反应结果葡萄糖+甘露醇蔗糖尿素乳糖+甲基红+半乳糖+吲哚麦芽糖+硝酸盐棉籽糖触酶果糖+VPDB36/T 184620237.2.3 结果判定若疑似菌落的生化特性与标准化脓隐秘杆菌生化特性（表 1）一致，可确认该菌为化脓隐秘杆菌。7.3 PCR 鉴定7.3.1 模板制备细菌基因组模板的制备方法，按GB/T 4789.6的规定执行。7.3.2 引物序列检测基因是化脓隐秘杆菌保守的特异性基因plo（溶血素编码基因）。上游引物序列：5-GGC CCG AAT GTC ACC GC-3；下游引物序列：5- AAC TCC GCC TCT AGC GC-3。扩增片段大小为270 bp。7.3.3 反应体系每个样品建立25 L PCR反应体系，见表2。用化脓隐秘杆菌标准菌株（ATCC 19411）的基因组作为阳性对照，无菌双蒸水作为阴性对照。表 2 化脓隐秘杆菌 plo 基因扩增体系配置表试剂名称加样体积（L）2Taq PCR Master Mix12.5上游引物（10 mol/L）1下游引物（10 mol/L）1DNA模板2灭菌去离子水8.57.3.4 PCR 循环条件预变性95 5 min；95 30 s，55 30 s，72 30 s，30个循环；72延伸5 min，结束反应，4保存。7.3.5 PCR 产物电泳配制1.5%的琼脂糖凝胶，添加工作浓度的核酸染料。取5 L PCR产物进行电泳，同时用DNA marker作为分子量参考。用凝胶成像系统观察分析电泳结果。7.3.6 结果判定阳性对照扩增出270 bp的条带，同时阴性对照未见有PCR扩增条带，检测结果成立。被检样品出现与阳性质控同样大小的条带时，判为阳性；被检样品未出现与阳性质控同样大小的条带时，判为阴性。8 综合判定符合5规定的流行病学、临床症状和病理变化，判定为临床疑似病例。临床疑似病例按6规定的进行细菌的分离培养，用7.2和7.3中的任一方法检测，结果为阳性者，可确 诊为化脓隐秘杆菌病。4DB36/T 184620239 生物安全实验室生物安全要求按照GB 19489的规定执行。5