天然产物荧光探针的提取及荧...实验”课程期末实验考试设计_叶嘉文.pdf

2023年 第6期广东化工第50卷 总第488期237天然产物荧光探针的提取及荧光淬灭性质天然产物荧光探针的提取及荧光淬灭性质“大学化学实验”课程期末实验考试设计“大学化学实验”课程期末实验考试设计叶嘉文，张伟捷，陈玲*，莫宗文，王海平，刘捷威(五邑大学 生物科技与大健康学院，广东 江门529020)摘要使用天然产物进行荧光检测，可以大大提高其使用的安全性和降低对环境的污染。硝基苯是爆炸物的模型化合物，本实验从金鸡纳树皮中提取奎宁并酸化为硫酸盐。我们发现硝基苯可以对硫酸奎宁乙醇溶液进行有效的荧光淬灭，KSV值为0.2457 mM-1，检测限为78.97 ppm。该实验趣味性高，综合性强，可用于我校“大学化学实验”期末实验考核。该实验便于在本科生课程开展，既包含有机、无机、分析基础操作，也涉及分析、物化公式的理解和运用。在全面考察课程内容知识点的基础上，可以客观、综合地检验学生的学习效果。同时，教学设计体现思政教育。关键词奎宁提取；硝基苯；荧光淬灭；淬灭常数；实验考试中图分类号TQ文献标识码A文章编号1007-1865(2023)06-0237-03The Extraction of Natural Fluorescent Probe and Fluorescence QuenchingProperty:A Designed Experiment for Final Examination of“College Chemistry Experiment”CourseYe Jiawen,Zhang Weijie,Chen Ling*,Mo Zongwen,Wang Haiping,Liu Jiewei(School of Biotechnology and Health Sciences,Wuyi University,Jiangmen 529020,China)Abstract:Using natural substances for fluorescent detecting can greatly improve the security and reduce the pollution for environment.Nitrobenzene is a modelcompound of explosives.In this experiment,quinine was extracted from peruvian bark and acidified to be the sulfate.And the fluorescence of quinine sulfate inethanol was found to be effectively quenched by nitrobenzene.The KSVvalue is 0.2457 mM-1and the LOD is calculated as 78.97 ppm.This experiment is interestingand comprehensive,which can be used for the final examination of“College Chemistry Experiment”course.It is convenient for implementing in undergraduateteaching.It not only contains some basic operations of inorganic,organic,and analytical chemistry,but also the understanding and application in formulas of bothanalytical and physical chemistry.Therefore,the designed experiment is helpful to check the learning outcome of students objectively and synthetically,on the basisof a comprehensive survey of knowledge points.Meanwhile,teaching designs embody ideological and political education.Keywords:extraction of quinine；nitrobenzene；fluorescence quenching；quenching constant；experiment examination奎宁是一种从金鸡纳树皮中提取的，重要的天然荧光物质1。奎宁除了可以作为药物和奎宁汽水外，还可以作为一种很好的荧光分子探针，检测卤素离子2-4。荧光检测技术由于其具有选择性高、灵敏度高、无需电学连接和响应速度快等优点，被广泛应用于气体5、溶剂6、压力7、温度8、爆炸物9等检测当中。天然产物荧光探针具有低毒、安全等特点，在人体或者公共场合的检测中非常有优势10。爆炸物为安全检查中最为常见的项目，而爆炸物主要成分为硝基化合物。硝基化合物由于 其 分 子 电 子 的 最 低 未 占 有 轨 道(Lowest UnoccupiedMolecular Orbital,LUMO)较低，非常容易吸收激发态物质的能量而产生荧光淬灭9。使用天然产物荧光物质对硝基化合物进行荧光探测，可以在公共场合使用中，如车站和机场等，大大减少对人体的危害和对环境的污染。“大学化学实验”是培养学生化学学习兴趣、科研思维和能力的重要基础实验课。为了全面、客观地考核学生对课程的掌握度，检验教师的教学效果，选择合适的综合实验进行期末考核是较好的方法。通过引入新创实验作为期末考核实验，可以丰富学生的化学知识，培育科学素养。同时，可以从实验设计、实验药品、实验方法等为出发点，挖掘蕴含的思政教育点，进一步推进学生的全面培养。1实验实验1.1实验目的(1)从金鸡纳树皮提取天然荧光探针奎宁，并制备为硫酸奎宁。将硫酸奎宁配成乙醇溶液，加入一定量的硝基苯，针对硫酸奎宁对硝基苯的荧光传感性能进行评估。(2)将这个实验作为考试融入“大学化学实验”课程，综合无机、有机、物化等考点，并设定多个评分考察。以爆炸物的认知和检测作为课程思政，作为考试实验讨论的一部分。1.2实验原理金鸡纳树皮是最早用于治疗疟疾的中药材，国内外科学工作者研究发现含有多种生物碱，其中奎宁占比最高。常见的从中药材种提取生物碱的方法有冷浸、超声、热回流、微波萃取、临界提取等。由于奎宁易溶于有机溶剂，常用有机溶剂浸泡来提取。蒲含林等人发现超声技术可以提高从金鸡纳树皮种提取硫酸奎宁的效率11。在紫外光下，奎宁溶液显明显的蓝光，其荧光可以被合适的淬灭剂淬灭12。荧光淬灭是指荧光分子与某些物质发生相互作用，导致荧光强度下降的物理或化学过程。氧、卤素、重金属离子及硝基化合物均是著名的荧光淬灭剂。荧光淬灭分动态淬灭和静态淬灭两种。其中，动态淬灭是荧光分子由于扩散而与淬灭剂分子发生的碰撞淬灭，一般过程中荧光分子的寿命会由于淬灭剂的加入而减短，且吸收光谱无明显变化。其过程符合Stern-Volmer方程，如下所示：F0/F=1+KSVQ其中，F0为没有淬灭剂存在时的荧光强度；F为淬灭剂存在时的荧光强度；Q为淬灭剂浓度；KSV称为Stern-Volmer淬灭常数，是双分子淬灭速率常数与单分子衰变速率常数的比率。实际实验中，常以F0/F对Q作图，得到一直线，其斜率为KSV，即可求得淬灭常数。在有些情况下，荧光淬灭是由于荧光分子和淬灭剂分子形成没有荧光的基态配合物的结果，称为静态淬灭。过程中荧光强度和淬灭剂浓度之间的关系如下所示：F0/F=1+KQ该关系式与动态淬灭的相似，只是这里的K指的是不发光的配合物的形成常数13。单独通过分析荧光强度所得到的荧光淬灭数据，难以判断淬灭的类型。一般需要通过分析淬灭过程中荧光寿命、吸收光收稿日期2022-09-07基金项目国家自然科学基金(22101211，22101210，21901189，21821003)作者简介叶嘉文(1990-)，男，广东佛山人，博士，讲师，主要研究方向荧光化合物。*为通讯作者。广东化工2023年 第6期第50卷 总第488期谱，温度和黏度的关系等，来综合判断荧光淬灭类型14。1.3实验过程1.3.1试剂及仪器无水乙醇，浓硫酸，氢氧化钙，氢氧化钠，硝基苯，活性碳，所有试剂及药品均为分析纯，购自阿拉丁公司。金鸡纳树皮为生药材，购自云南瑞丰成中药材公司。超声(JP050S，洁盟)，荧光仪(FluoroMax+，Horiba)，紫外可见分光光度计(U3900，Hitachi)，核磁共振波谱仪(500 MHz，布鲁克)。1.3.2实验准备称取约100 g金鸡纳树皮，粉碎，往粗粉中加入乙醇800 mL，并加入20 g消石灰和70 mL 4%(质量分数)氢氧化钠溶液，搅拌均匀，室温超声2次(每次45分钟)。减压过滤，滤液浓缩，加入适量5%(质量分数)H2SO4溶液，过滤，滤液用活性炭脱色，并用氢氧化钠溶液调节pH为6.5左右，静置11。蒸馏掉部分乙醇后，过滤，真空干燥，得硫酸奎宁，分子式(C20H24N2O2)2H2SO42H2O。奎宁结构见图1。图图1奎宁的化学结构奎宁的化学结构Fig.1The chemical structure of quinine1.3.3光谱实验1.3.3.1硫酸奎宁溶液的配置准确称取一定量的硫酸奎宁(392 mg，0.5 mmol)，用无水乙醇溶解，50.00 mL容量瓶定容，摇匀。配置成0.010 mol/L的硫酸奎宁的乙醇溶液。用移液管取上述浓度的硫酸奎宁溶液0.50 mL，加入到无水乙醇中，用100.00 mL容量瓶定容，摇匀。配置成5.010-5mol/L的硫酸奎宁溶液。1.3.3.2硝基苯溶液的配制分别移液管移取2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 mL硝基苯乙醇溶液(硝基苯乙醇=5100，v/v，c=0.489 M)于10.00 mL容量瓶中，乙醇定容，摇匀。得到硝基苯浓度依此为0.0979，0.147，0.196，0.245，0.293 M的乙醇溶液。1.3.3.3荧光淬灭实验准确移取(1)溶液20.00 mL共6份，分别加入乙酸5.00mL，摇匀。其中第一份溶液不加硝基苯，其余26份溶液分别加入(2)所配置的硝基苯乙醇溶液0.50 mL。得下表所示含不同浓度硝基苯的硫酸奎宁乙醇溶液。表表1各样品硝基苯浓度计算结果各样品硝基苯浓度计算结果Tab.1The result of concentrations of nitrobenzene insamples from 16序号123456硝基苯浓度/mM01.922.883.844.805.751.3.4实验结果我们使用核磁共振波谱对产物进行分析，并对主要的化合物分子上主要的氢进行了归属(如图2所示)。图图2硫酸奎宁在氘代乙醇的核磁氢谱硫酸奎宁在氘代乙醇的核磁氢谱Fig.21H NMR spectrum of quinine sulfate in ethanol-D6接着我们对样品溶液进展了紫外和荧光光谱测试。根据1号溶液(无硝基苯)的紫外可见吸收光谱(如图3所示)，260 nm为苯环内部的*跃迁，330 nm为孤对电子到苯环的n*的跃迁，在常见的紫外灯365 nm下，也有少量吸收。我们选取了330 nm作为最大激发波长，来收集各样品溶液的发射光谱。图图31号溶液的紫外可见吸收光谱及号溶液的紫外可见吸收光谱及16号溶液的荧光发射光谱号溶液的荧光发射光谱Fig.3The UV-vis absorption spectrum of 1 and the fluorescence spectra of 1616号溶液的荧光发射光谱如图3所示，在330 nm紫外光的激发光下，硫酸奎宁乙醇溶液的最大发射峰在437 nm左右，为较强的蓝色荧光，主要来源于喹啉环和与其共轭的强给电子基团甲氧基。随着硝基苯浓度的增高，溶液的荧光逐渐减弱。说明硝基苯对硫酸奎宁的荧光有淬灭作用。以1溶液437 nm发射峰的荧光强度为F0，26号同样波长的强度为F，得系列F0/F值。如图4所示，取6个浓度的点作线性拟合，得KSV值为0.2457 mM-1，这个结果与文献报道的卤素离子对硫酸奎宁在水溶液中的淬灭常数类似15。根据检测限(limit of detection,LOD)计算公式LOD=3/K，可得检测限为78.97 ppm。2023年 第6期广东化工第50卷 总第488期239图图416号溶液的号溶液的F0/F值对硝基苯浓度的线性拟合值对硝基苯浓度的线性拟合Fig.4The relationship between F0/F and concentrations ofnitrobenzene in 162教学教学2.1实验设计背景“大学化学实验”一课是针对非化学化工类的工科专业本科生开设的课程，主要面向我校应用物理与材料学院、纺织材料与工程学院的学生，班级学生数量在20多到50人不等。针对学生的相关专业及未来可能从事的生产、科研活动，课程选定了8个主要内容(如表2所示)，其中第一次课是关于安全、实验基础知识、玻璃仪器使用及洗涤等的导论课，其他七个为基础实验课程，涵盖无机、分析、有机、物化四个方向。表表2我校“大学化学实验”课程内容我校“大学化学实验”课程内容Tab.2The content of“College Chemistry Experiment”coursein Wuyi University序号课程内容知识点1化学实验基础知识与玻璃仪器的准备安全知识2分析天平称量操作3酸碱标准溶液的配制与比较溶液配置，滴定4氯化钠的提纯及含量分析加热，过滤，结晶，离子鉴定5废酒精的蒸馏及微量法测沸点蒸馏操作6重结晶及熔点的测定重结晶，熔点测定7液体粘度的测定：测定乙醇的粘度粘度测定，相关计算8电解质溶液的电导电导测定，相关计算金鸡纳树皮可以用来治疗疟疾，具有悠久的药用历史，其中奎宁是金鸡纳树皮的主要成分。同时，奎宁溶液具有荧光，如著名的荧光饮料tonic water的主要成分就是奎宁16。硝基苯是爆炸物的主要成分，对很多荧光物质有淬灭效果，利用该性质可以用荧光分析法检测其含量17。将“明星”天然产物奎宁引入实验教学，并利用硝基苯来进行奎宁溶液的荧光淬灭实验，计算淬灭常数，可以考察、锻炼学生在有机、无机、分析实验相关操作的动手能力，同时加深他们对物理化学中动力学过程及相关公式的理解运用，综合考核学生的化学知识与操作技能(见图5)。课程思政要点主要有3个，一是实验设计方法，体现了学科的方法论和科学素养；二是化学在生产生活等的应用，如天然产物的提取，药用价值等；三是化学与安全，如荧光淬灭法检测爆炸物硝基苯，可以用在安全检测甚至反恐工作中。以上要点可以采取灵活多变的方式渗透在实际教学过程，如实验前的文献阅读调研；学生分组预习实验，讨论如何利用原理解决化学问题；教师利用实例讲授等。图图5期末考核实验与课程内容相关性期末考核实验与课程内容相关性Fig.5The relationship betweenfinal examination and course content2.2考试安排考试前两周，向学生公布考题和实验原理，提供参考文献。学生利用一周时间进行实验设计，教师回收预习报告并批改，返回到学生。预留34天时间给学生修改并做实验准备。考虑到缩短实验时间，更好地提高效率，硫酸奎宁的提取中，前期准备由实验员处理，得到含硫酸奎宁的乙醇溶液。考试现场，教师介绍前期提取实验的内容。学生直接量取一定量的硫酸奎宁乙醇溶液，蒸馏并回收掉部分乙醇，浓缩液静置，待析出较多晶体后，过滤，干燥得到硫酸奎宁样品。此部分在有机实验室完成，需34小时。接着，学生将硫酸奎宁样品带到无机及分析化学实验室，准确配制一定浓度的硫酸奎宁乙醇溶液待用。并配制不同浓度的硝基苯乙醇溶液。将二者混合，得到相同硫酸奎宁浓度，不同硝基苯浓度的溶液。紫外灯下观察其荧光淬灭效果。接着，使用紫外可见分光光度计测试1号样品的吸收光谱，并使用荧光仪测试16号样品的发射光谱。清洗好实验仪器，结束实验。此部分需34小时。预留一周的时间让学生完成实验报告。2.3评分标准视实际情况，考试可两人或多人一组，评分标准如表3所示。表表3评分标准评分标准Tab.3Standard for evaluation总成绩实验操作实验记录分析解决问题结果处理团队合作台面清洁实验安全100蒸馏抽滤称量溶液配置151020555101010103结论结论本文从植物中提取了天然荧光探针奎宁，对其对硝基苯的检测性能和相关的机理进行了研究，证明了其用于公共场合的爆炸物检测的可能性。本设计实验涉及天然产物的提取、荧光淬灭现象、爆炸物的检测，有助于加深非化学专业学生体会化学在生活、健康、安全中起到的重要作用，提高他们对学科的了解与认同感。同时，学生在了解、设计实验的过程中，培养了一定科学素养。在考试过程中，可以综合考察他们的化学操作水平及数据处理分析能力。我们将在后面的教学中更留意教师和学生的反馈，并根据实际情况持续改善，力求探索出更丰富有趣、合理客观的实验考核方式。参考文献参考文献1Cheon T M，Cheong B S，Cho H G，et alQuinine Assay with Home-BuiltUV-LED Fluorometer：Quantitative Analysis，Photo-Bleaching，FluorescenceQuenching，and Urine AnalysisJJ Kor Chem Soc，2012，56(5)：577-582(下转第236页)广 东 化 工 2023 年 第 6 期 236 第 50 卷 总第 488 期 验，学生顶多是掌握了染料废水处理的基本操作，但对于实验的主人翁意识不强，没有探索现象、分析原因的热情，学习效果自然大打折扣。所以，以“探索加验证”的理念鼓励学生们自主选择方法进行实验，不仅能提高学习的积极性，让学生们学会对自己的实验负责，而且以分享会的形式，集成大家对染料废水处理的思路，一起学习，共同进步。为了让学有余力的同学进一步提高自己的科研素养，首次提出学生们课后可以大创实验的模式将其进行到底，已有的实验结果为背景、结合提出的建议及文献，制定新的实验方案提高染料废水的色度和COD 值去除率。通过反复考证最优方案后，可考虑将教学的课堂从实验室延伸到污水厂实地进行，面对的不再是自制的染料水溶液，而是真实的印染废水，为印染厂提供切实有效的污水处理方案是最终目的。相信通过这样的一次教学训练，学生们的实验技能、科研素养、心理素质都会有质的提升，对于亟需吹响环境保护号角的新时代而言，培养高水平的环保人才是历史赋予高等教育的使命。参考文献参考文献 1田莉改性核桃壳吸附脱除亚甲基蓝染料的研究J印染助剂，2022，39(6)：51-55 2刘源，张娜，刘群，等阳离子染料废水处理技术研究进展J/OL净水技术，2022 3薛飞华，朱宝玉 染料废水处理技术方法的研究J 环境与发展 2019，31(7)：91，93 4刘江红，苏会敏，魏晓航，等 阳离子染料废水处理技术研究进展J 化工科技，2021，29(4)：60-64 5陈文华，李刚，许方程，等 染料废水污染现状及处理方法研究进展J 浙江农业科学，2014(2)：264-269 6崔玉民，殷榕灿 染料废水处理方法研究进展J 科技导报 2021，39(18)：79-87 7秦彬，谷晋川，殷萍，等染料废水处理技术研究进展J化工环保，2021，41(1)：9-18 8林旭龙，崔家琪，赵小华，等印染废水的混凝脱色研究J广东化工，2012，39(3)：236-237，240 9许良英，孙爱华 活性染料染色废水脱色效果的研究J 环境工程，2010，28(5)：13-16 10程垒，白晓龙活性炭吸附对水中亚甲基蓝染料脱色的影响J中国资源综合利用，2015，33(11)：29-32 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