天然产物法卡林二醇与人类G...BA_A受体相互作用的机制_沈琦.pdf

Chem.J.Chinese Universities,2023,44(2),2022050020220500(1/10)CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES高 等 学 校 化 学 学 报研究论文天然产物法卡林二醇与人类GABAA受体相互作用的机制沈琦1，陈海瑶1，高登辉1，赵熹1，那日松2，刘佳2，黄旭日1（1.吉林大学理论化学研究所,长春 130061；2.河南农业大学植物保护学院,郑州 450046）摘要 通过分子动力学模拟、伞形采样模拟、结合自由能计算和分子对接等方法,研究了法卡林二醇在-氨基丁酸A型(GABAA)受体上结合作用的模式和对GABAA受体动态属性的影响,确定了3个有效结合位点均对此受体产生拮抗作用,为后续研究聚乙炔醇类化合物对GABAA受体作用及相应药物开发提供了理论依据.关键词 法卡林二醇；-氨基丁酸 A型受体；分子动力学模拟；拮抗作用中图分类号 O641 文献标志码 A doi：10.7503/cjcu20220500Interaction Mechanism of the Natural Product Falcarindiol and Human GABAA ReceptorSHEN Qi1，CHEN Haiyao1，GAO Denghui1，ZHAO Xi1*，NA Risong2，LIU Jia2，HUANG Xuri1（1.Institute of Theoretical Chemistry，Jilin University，Changchun 130061，China；2.College of Plant Protection，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450046，China）Abstract Falcarindiol is a natural polyacetylene alcohol compound that has demonstrated anti-inflammatory，neurological and potentially anticancer properties，and modulates the activity of the-aminobutyric acid type A（GABAA）receptor which is an important therapeutic target for neurological disorders in humans，but the mechanism of action is not clear.In this paper，the binding mode and dynamic properties of falcarindiol acting on GABAA receptor were investigated by molecular dynamics simulation，umbrella sampling simulations，binding free energy calculations and molecular docking，and determined that all three effective binding sites have antagonistic effects on this receptor.This work will provide a theoretical basis for the subsequent study of the effects of polyethynyl alcohol analogues on GABAA receptors and the corresponding drug development.Keywords Falcarindiol；-Aminobutyric acid type A（GABAA）receptor；Molecular dynamics simulation；Antagonism神经退行性疾病是大脑和脊髓的细胞神经退行性变形、丢失而导致的疾病.如帕金森、阿尔兹海默症、癫痫和亨廷顿舞蹈症等均为神经退行性疾病，主要表现为认知功能和运动功能的下降.神经退行性疾病的致病因素有很多（如氧化应激、蛋白质异常聚集、炎性机制、线粒体功能障碍和遗传等）且致病机制尚不明确，病程不可逆转.目前，全球约有4000多万人受到神经退行性疾病的影响，随着全球老龄化人口的增多，这一数字还会继续增加.所以，开发出安全有效的治疗神经退行性疾病的药物是目前亟需解决的问题.相关研究表明，多种神经退行性疾病均与神经系统内广泛表达的-氨基丁酸A型（Gamma-aminobutyricacid，GABAA）受体的功能紊乱有关，GABAA受体是许多神经类药物作用的靶收稿日期：2022-07-25.网络首发日期：2022-09-29.联系人简介：赵 熹,男,博士,副教授,主要从事生物大分子的计算及药物筛选方面的研究.E-mail:基金项目：国家自然科学基金(批准号:21702048)和河南农业大学教学改革项目(批准号:2021XJGLX100)资助.Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.21702048)and the Teaching Reform Project of the Henan Agricultural University,China(No.2021XJGLX100).CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES高 等 学 校 化 学 学 报研究论文Chem.J.Chinese Universities,2023,44(2),2022050020220500(2/10)点15.GABAA受体是五聚体配体门控氯离子通道半脱氨酸（Cys）超家族的一员，属于神经递质受体.广泛存在于神经元突触、突触外缘或神经元膜的突触外部分，其内源性配体为GABA分子，是中枢神经系统的抑制性神经递质6，7.GABA分子与GABAA受体结合后将激活受体，使其通道开放，Cl从细胞外流向细胞内，引起神经元的超极化从而抑制神经元兴奋.因此，GABAA受体是许多治疗神经性系统疾病药物（如镇静剂、助眠剂、麻醉剂和抗惊厥药物等）的作用靶点，在平衡兴奋性信号中起着基础性的作用8，9.GABAA受体一般包含 19 个不同的亚基，共计 8 类（1-6，1-3，1-3，1，1，1，1 和 1-3）.人脑中存在较为丰富的GABAA受体亚基为，和组成的五聚体，通常以2个1，2个2和 1个2为组合形成12210.GABAA受体镶嵌于磷脂膜中，整个受体可分为胞外结构域（Extracellulardomain，ECD）和跨膜结构域（Transmembranedomain，TMD），每个亚基的胞外结构域包含一个N端螺旋、10个链和多个“Loop区”，其中Loop A，B，C在亚基上定义为“+”，Loop D，E，F定义为“”11，12.跨膜结构域由4个螺旋（M1M4）和一个可变长度的细胞质环构成.五聚体的5个M2螺旋构成受体离子通道，9位置的亮氨酸及2位置的丙氨酸和脯氨酸为通道的门控，在药物结合后会选择性地打开或关闭13，14.研究发现，聚乙炔醇化合物都可以作用于GABAA受体15.聚乙炔分布广泛且种类多，主要存在于食用植物、真菌和海藻等.聚乙炔化合物的研究从20世纪60年代中期开始受到重视，大量研究者对人参中的聚乙炔醇化合物进行了深入研究.随着对聚乙炔醇化合物的深入研究，来自不同种植物的聚乙炔醇化合物也相继被报道16，它们都可以对GABAA受体1721产生作用.Uwai等22曾研究过多种聚乙炔醇化合物与GABAA受体的作用，如菊苣毒素（Cicutoxin）、大菊毒素（Isocicutoxin）、维罗尔A，B和C（Virol A，B和C）、人参炔醇（Falcarinol）和法卡林二醇（Falcarindiol）等.综合目前已有的实验研究发现大多数聚乙炔醇化合物在结构上较为相似，以17个碳骨架为主，具有键共轭体系、烯丙基和 羟基官能团，这些结构特点对聚乙炔醇化合物的活性具有直接的影响2325.法卡林二醇分子FAD Falcarindiol（3R8S）是一种天然的聚乙炔醇化合物，存在于人参、伞形科和芹菜科的许多药用和食用植物中，法卡林二醇已被证明有抗炎、抗癌特性26，27.研究表明，法卡林二醇分子对GABAA受体具有一定的调节作用22，但其作用机制尚不明确.本文采用分子动力学模拟和相应的分析方法，研究了法卡林二醇和GABAA受体的作用位点及作用机制，为开发天然药物、研究聚乙炔醇化合物与GABAA受体的作用机制提供了理论依据.1 实验部分1.1常规动力学模拟GABAA受体的亚基有多种组合，选择了人体内含量最丰富的GABAA受体亚型122，从PDB（ProteinDataBank）库下载编号为6X40的晶体结构.结构文件由5条亚基组成，每个亚基大约含有340个残基，总残基数共17812个原子，删除不需要的结晶水分子和其它辅助结晶的杂分子.法卡林二醇分子的几何参数和三维（3D）构型通过Gaussian 09程序28在6-31+G（d）基组和B3LYP方法下进行结构优化，法卡林二醇分子是电中性的，通过能量最小化获得稳定的构象.采用FTMap服务器29来确定GABAA受体的潜在结合位点，对整个蛋白界面进行全局搜索寻找有利于特定探针结合的区域，不同探针分子（乙醇、异丙醇、异丁醇、丙酮、乙醛、二甲醚、环己烷、乙烷、乙腈、尿素、甲胺、苯酚、苯甲醛、苯、乙酰胺和N，N-二甲基甲酰胺共16种分子）的重叠域被定义为共同位点，最大的共同位点被预测为蛋白结合界面最重要的位点.这种方法相比于目前流行预测方法（GRID，CAVITY和MCSS等）可以避免许多假阳性的结合位置.通过AutoDockVina1.1.230进行位点对接，中心网格框的坐标由预测的结合位点确定.网格间距为0.1 nm，尺寸为242424的盒子，使用评分函数的随机全局优化来将配体对接到可能的结合位点进行初步识别.在每个预测位点生成了10个配体模型，根据给出的结合自由能和分子构象选出最优的对接情况.对处理好的晶体结构采用PROPKA3.1程序31进行质子化处理，在pH=7.0时确定了蛋白质氨基酸CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES高 等 学 校 化 学 学 报研究论文Chem.J.Chinese Universities,2023,44(2),2022050020220500(3/10)残基的状态.采用InflateGRO2程序32将其嵌入由512个POPC脂质（1-棕榈酰-2-油酰基磷脂酰胆碱）分子构成的双层膜中.脂质分子位于xy平面.蛋白质分子垂直于脂质双分子平面，能量最小化后最终移除了63个脂质分子达到平衡状态.模拟基于GROMOS54a7力场33使用SPC显性溶剂模型，由27个氯离子平衡系统电荷.体系首先经过1000步能量最小化消除原子间的不合理接触，然后进行100 ps正则系综（NVT）模拟，系统温度升至300 K.后续进行1 ns恒温恒压（NPT）模拟，保持在300 K和1105 Pa大气压，整个过程施加周期边界条件，所有键使用LINCS（LinearConstraintSolver）算法34.范德华相互作用截断半径为1.2 nm，长程静电相互作用使用PME（ParticleMeshEwald）方法35，在NPT系综下进行200 ns的分子动力学模拟.所有模拟均在GROMACS2018.8软件包36中进行，采用VMD37和PyMOL38软件包对模拟轨迹和结构进行可视化处理.法卡林二醇分子的拓扑文件由ATB服务器39得到.1.2伞形采样模拟采用伞形采样模拟来探究不同位点对氯离子进入通道能量值的变化.使用拉伸分子动力学和加权直方分析法（WHAM）.选取200 ns常规动力学的最后一帧蛋白结构，将氯离子置于蛋白通道质心，选择“Umbrella”拉伸方式，拉伸方向为“Direction”，沿z轴方向进行牵引.对于拉伸速率和牵引力常数的选择进行多组实验.最终选择拉伸速率为0.01 nm/ps，牵引力常数为1000 kJmol1nm2的情况.在整个跨膜结构域内拉伸距离为4 nm，每隔0.05 nm选取一个窗口，共选取了80个窗口.进行7组实验（GABAA蛋白晶体、只加入GABA分子、加入FAD-2FAD-6复合物），对取样的每个窗口先进行500 ps的NPT预平衡，最终1 ns的伞形模拟，共计进行了720 ns的伞形模拟，且在重叠情况不好的区域进行了补点.拉伸速率设置为0，对氯离子施加较大的限制力，以保证每个窗口受体和离子的相对位置.2 结果与讨论2.1GABAA 受体与法卡林二醇分子的对接情况根据位点预测和分子对接得到的结果如图1（A）和（B）所示，法卡林二醇的分子结构如图2所示，将法卡林二醇在GABAA受体上的7种状态分别标记为FAD-1FAD-7.FAD-1位于胞外亚基2+/2之间，FAD-2在胞外亚基1+/2之间，是经典苯二氮卓类药物的位点40，FAD-3位于胞外亚基+/之间，是乙醇41和吡唑并喹啉药物的位点.FAD-4则是在GABA分子结合的正构位点1（2+/1）偏下方区域.在跨膜结构域提供了 3 个位点，FAD-5 和FAD-6分别在2+/1亚基之间，这两个位点是依托咪酯42和丙泊酚等43药物结合的位置；FAD-7则在通道孔径处，是非竞争性拮抗剂苦毒素44的结合位点，起到阻塞通道的作用.Fig.1Seven sites of falcarindiol binding to GABAA receptors（A）The four sites of the extracellular structural domain FAD-1FAD-4；（B）three sites in the transmembrane structural domain FAD-5FAD-7.Fig.2Molecular structure of falcarindiolCHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES高 等 学 校 化 学 学 报研究论文Chem.J.Chinese Universities,2023,44(2),2022050020220500(4/10)2.2伞形采样模拟法卡林二醇对氯离子通过通道的影响对于GABAA受体蛋白，这里对跨膜区螺旋的氨基酸进行了序列对比（图3），发现3个亚基上的氨基酸大多都是保守的，其中M2螺旋上的2和9位置是通道的门控，负责通道的打开和关闭.本文将重点关注2到9位置螺旋的变化.为了进一步确定结合在不同位点的法卡林二醇对受体的作用，将氯离子置于蛋白通道的中心，整个螺旋通道长度约为4 nm，随后进行拉伸分子动力学和伞形采样模拟计算氯离子通过通道的平均力势（PMF），再结合WHAM分析.其中，FAD-7处于通道内起阻塞作用，已确定为拮抗剂，未进行实验.所以7组实验包括不同位点FAD-2FAD-6的复合物、只含GABA分子的复合物及单独GABAA蛋白晶体.由图4（A）可见，加入GABA分子的受体在2 nm后氯离子通过的能量值相对于单独GABAA蛋白的情况明显降低，说明GABA分子的加入有利于氯离子通过，GABA分子对GABAA受体可以产生激活作用，但通常需要激动剂来影响受体，进而促进GABA分子和受体结合，单独使用GABA只会产生较弱的作用45.FAD-2FAD-4的PMF值均高于单独GABAA蛋白，说明这3个位点的法卡林二醇不利于氯离子通过通道，且从门控9位置（1 nm）开始能量明显升高.图4（B）中FAD-5和FAD-6氯离子通过通道的能量值均高于单独GABAA蛋白，且FAD-5有一些突出的峰值，说明法卡林二醇的存在对螺旋的运动产生影响，使氯离子进入通道的某些位置能量值更高一些.而FAD-6整体数值相对较平缓.通过PMF图像数据趋势，发现几个位点都是不利于氯离子通过，说明法卡林二醇对GABAA受体起到拮抗作用.Fig.3Comparison of amino acid sequences of helices in the transmembrane regionFig.4Calculated PMF of chloride ions through GABAA receptor helical channels of FAD2FAD4 GABAA protein and GABAonly molecular complexes(A)and FAD5FAD6 GABAA protein and GABAonly molecular complexes(B)cryoEM structure:Cryoelectron microscopy structure of GABAA.CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES高 等 学 校 化 学 学 报研究论文Chem.J.Chinese Universities,2023,44(2),2022050020220500(5/10)进一步验证了法卡林二醇对受体的拮抗作用.若是激活剂则利于GABA分子与受体结合，且2亚基上的Loop C会包裹住GABA分子，整个亚基逆时针运动.若是拮抗剂则不利于GABA分子与受体结合，且Loop C倾向于打开的状态，未对GABA分子进行束缚.在模拟只有GABA分子存在的复合物时，发现位点2的GABA分子在200 ns内一直与受体保持结合状态，而位点1的GABA分子在30 ns后脱离了受体，这与相关研究13中关于位点2的亲和力大于位点1的结果一致.GABA分子分别与2亚基上的Glu155，Thr202和1亚基上Arg67形成氢键作用，周围的疏水氨基酸主要为Phe200和Phe65 图5（A）.分析了法卡林二醇在位点FAD-2FAD-7的复合物受体200 ns轨迹里结合GABA分子的情况，主要分析了GABA正构位点2的情况，因为其亲和力较位点1强，更具说服力.结果列于表1，可见，这几个复合物中GABA分子在位点2停留的时间都比位点1长，且GABA分子没有一直停留在某个位点.其中，FAD-4和FAD-6在位点2的GABA分子停留时间相对于其它几个复合物要长，但最终都离开了受体，说明法卡林二醇在这几个位点不利于GABA分子与受体的结合，没有起到激活作用.分析了受体上GABA分子位点2的2亚基Loop C区域关闭、打开状态，通过测量2亚基上的Ser201残基的Ca原子和1亚基上残基Leu128的Ca原子之间的距离变化来判断 图5（B），其中，灰色为只含GABA分子的亚基，蓝色和绿色分别为含有法卡林二醇分子的亚基和亚基，黑色箭头表示Loop C有打开的趋势.位点2原子间距离随时间变化的结果如图6所示，发现只有GABA分子存在时原子间的距离基本保持在1 nm附近，模拟轨迹里观察到位点2的GABA分子也一直存在，原子间距离变近说明Loop C有关闭的趋势.FAD-2FAD-7受体位点2的原子间距离相对于单独GABA分子存在情况都有变大的趋势，且原子间距离变化和位点2 GABA分子停留时间基本保持一致.Fig.5Interaction of GABA and surrounding amino acids at site 2（A）Interaction of GABA and surrounding amino acids at site 2；（B）The distance between the residue Ser201 Ca atom on the -subunit loop C and the-subunit Leu128 Ca atom is 1.2 nm.Subunits containing only GABA molecules are in gray，subunits containing falcarindiol molecules are in color.Table 1GABA and FAD-2FAD-6 GABA molecular residence timeSite12GABA30 ns 200 nsFAD210 ns30 nsFAD3 5 ns15 nsFAD4 80 ns105 nsFAD520 ns50 nsFAD6 50 ns100 nsFAD75 ns8 nsCHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES高 等 学 校 化 学 学 报研究论文Chem.J.Chinese Universities,2023,44(2),2022050020220500(6/10)通过以上分析，FAD-2FAD-7位点受体上GABA分子停留时间较短和两亚基上残基CA原子之间距离变大，说明Loop C倾向于打开，便于GABA分子离开GABAA受体.再次说明法卡林二醇在这几个位点不利于受体结合GABA分子，模拟过程中GABA分子相继脱离受体，未激活受体而是起到拮抗作用.2.3不同结合位点的复合物整体稳定性分析上述分析确定胞外区和跨膜区的位点对GABAA受体均起到拮抗作用，对GABAA蛋白晶体、只含GABA分子复合物以及法卡林二醇在上述7个位点与GABAA受体的复合物（GABA分子均存在的条件下）进行模拟，共9组结构，每组进行200 ns，共计1.8 s的分子动力学模拟.得到蛋白质的均方根偏差（RMSD）和均方根涨落（RMSF），结果见图S1（见本文支持信息）.图S1（A），（C）和（E）为9组实验蛋白体系C原子的RMSD在200 ns内的变化范围，可以看出基本稳定在0.3 nm左右.由图S1（A）明显看出，加入GABA分子整体趋于更稳定的状态.图S1（C）中FAD-1FAD-4前100 ns的RMSD值还处于上升状态，其中FAD-3相对于其它3个位点有着更稳定的RMSD.图S1（E）中FAD-5FAD-7在约20 ns以后基本都保持平稳的RMSD，说明在模拟过程中法卡林二醇在跨膜区相比于胞外区可以使蛋白整体趋于更平稳的状态.图S1（B），（D）和（F）给出了9组实验蛋白体系C原子的RMSF变化.由图S1（B）可见，加入GABA分子后受体的Loop 区氨基酸残基波动减弱，说明GABA分子的加入稳定了GABAA受体.图S1（D）中在100号残基附近和350号残基附近波动较大，这些残基恰好在FAD-4所在位置旁的两个亚基上.其它位点氨基酸没有明显变化.图S1（F）中3个位点残基整体没有太大波动，FAD-5的1700号氨基酸整体波动明显，这些氨基酸是位于此位点旁的2亚基和1亚基上.FAD-6显示在1200号残基附近有波动，此位置的残基位于FAD-6旁的1亚基的胞外区.说明此处法卡林二醇可能会对胞外区的氨基酸运动产生影响.在FAD-7中350号附近、400号和1000号附近的氨基酸残基位于胞外区且有较大的波动，说明法卡林二醇结合GABAA受体后影响了胞外区氨基酸运动.通过几组复合物RMSD和RMSF图分析，发现法卡林二醇在不同的位点均能与GABAA受体较好地结合，且位于跨膜结构域的FAD-5FAD-7的位点复合物整体稳定性较好.Fig.6Distance between the CA atom of residue Ser201 on the 2 subunit Loop C and the CA atom of residue Leu128 on the 1 subunit at site 2 of the GABA molecule over time（A）FAD-2FAD-4 and GABA；（B）FAD-5FAD-7 and GABA.CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES高 等 学 校 化 学 学 报研究论文Chem.J.Chinese Universities,2023,44(2),2022050020220500(7/10)2.4结合自由能采用gmx_MMPBSA方法46对法卡林二醇在受体上的7个位点进行了结合自由能（Gbind）计算.结果列于表2，FAD-1在胞外区的2+/2亚基之间，多数药物均未结合在此位点，而且相比于其它位点结合自由能特别小，说明其与受体结合稳定性较差，所以，暂未考虑此位点.胞外区FAD-2FAD-4的结合自由能相对于跨膜区略小，尤其是FAD-2结合自由能比胞外区的另外两个位点大，所占据的是苯二氮卓类药物的位点，这类药物通常具有激活、变构调节GABAA受体的作用，温度和熵变的乘积(TS)，跨膜区 3 个位点 FAD5FAD7 与胞外区 FAD2FAD4 的位点变化不大47.跨膜区的 FAD-5FAD-7具有更大的结合自由能，其中非极性相互作用（Gnonpolar）是主要的能量贡献，为范德华作用(Evdw)与非极性去溶剂化自由能(GSA)之和,且Evdw占主导地位.跨膜区3个位点FAD-5FAD-7相比于胞外区FAD-2FAD-4的静电相互作用(Eele)变小，极性溶剂化自由能（GPB）也变小.2.5结合位点的氢键和疏水作用为了进一步分析法卡林二醇分子在不同位点的结合能力，对结合位点的氢键作用和疏水作用进行了分析，采用VMD分析100200 ns内氢键占有率（见本文支持信息图S2）.由图S2（A）可见，FAD-2主要与2亚基上Asp75，Arg144，Asn60和1亚基上His102残基形成了氢键相互作用，且与Asp75结合的氢键占有率达到了98.02%.FAD-3主要与1亚基上His102，Lys156和2亚基上Glu182，Ser46残基形成氢键作用.FAD-4主要与1亚基上Asp184，Arg187，Asp63和2亚基上Glu153，Lys102残基形成氢键作用.这3个位点都在胞外区，氢键占有率普遍高于跨膜区的3个位点，这也证实了FAD-2FAD-4的结合自由能分解项里Eele项占主导地位.图S2（B）中跨膜区的3个位点中FAD-5的氢键占有率较大，主要与2亚基上Asn265，Thr262，Met261和1亚基上Thr265残基形成氢键相互作用，且结合自由能分解项中FAD-5的静电相互作用也是大于跨膜区的另外两个位点.FAD-6主要与2亚基上Asn265，Arg269和1亚基上Thr265残基形成氢键作用.FAD-7主要与2亚基上Ser267，Ala264和2亚基上Thr256，Ala252残基形成氢键作用.通过氢键占有率分析发现，这几个位点的法卡林二醇能与周围氨基酸形成较好的氢键相互作用.除了分子本身存在两个羟基官能团，也说明了法卡林二醇在这几个位点能和GABAA受体稳定结合.图S3（见本文支持信息）给出了6个位点与周围氨基酸残基的疏水相互作用，图S3（A）（C）是位于胞外区的3个位点FAD-2FAD-4，从疏水作用图中可以看到法卡林二醇主要是和亚基上“+”（Loop A，B，C）部分上的残基形成疏水相互作用，而亚基上“”（Loop D，E，F）部分的疏水相互作用较小.也就说明法卡林二醇主要和亚基胞外区上的“+”所在部分的氨基酸形成疏水相互作用.由图S3（D）（F）可见，跨膜区的3个位点FAD-5FAD-7与周围氨基酸形成了较强的疏水作用，这也证实其自由能中范德华相互作用占主导.位点FAD-5和FAD-6周围共有的疏水氨基酸有Met286，Phe289，Met236和Pro233，说明这两个位点在2和1两个亚基间的位置基本一致，但是分子构象不同导致略有差别.FAD-5位点法卡林二醇更接近于螺旋M3和M4，且分子本身有朝外的趋势，FAD-6位点法卡林二醇接近于M1和M2螺旋更朝Table 2Free energy of falcarindiol binding at FAD-1FAD-7 sites on the GABAA receptor*SpeciesFAD1（2+/2）FAD2（1+/2）FAD3（1+/2）FAD4（2+/1）FAD5（2+/1）FAD6（2+/1）FAD7（Pore）Eele/（kJmol-1）-118.378-101.399-120.052-159.712 -64.283 -31.275 -31.966Evdw/（kJmol-1）-99.604-153.113-125.934-101.604-167.406-150.114-160.561GPB/（kJmol-1）173.117168.678197.071223.961115.817 95.374 81.220GSA/（kJmol-1）-20.974-22.192-21.564-20.456-22.903-23.242-22.782Gpolar/（kJmol-1）54.73967.27977.01964.25051.53464.09949.254Gnonpolar/（kJmol-1）-120.579-174.176-147.499-122.060-190.309-173.356-183.340TS/（kJmol-1）51.53427.22116.98312.63119.761 9.03312.602Gbind/（kJmol-1）-14.305 -80.806 -53.497 -45.179-119.014-100.224-121.487*Gpolar=Eele+GPB；Gnonpolar=Evdw+GSA.CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES高 等 学 校 化 学 学 报研究论文Chem.J.Chinese Universities,2023,44(2),2022050020220500(8/10)向蛋白通道内部.FAD-7位点与周围5个亚基上的氨基酸都形成了相互作用，由于此位点的特殊性属于通道阻塞剂，结合自由能最大，说明这个位点对受体而言是拮抗剂且结合状态稳定.FAD-5和FAD-6的位置均在2和1亚基之间，这两个亚基也是胞外区的GABA分子所在的位点，已有研究表明，受体上GABA分子的两个位点并不是对称的48.主要是由于周围亚基顺序不同，因此从这方面单独考虑位点.2.6通道孔径变化及螺旋运动趋势为了进一步选择结合较好的位点，通过Cluster分析FAD-2FAD-6复合物在200 ns里的轨迹，选取最大聚类的代表性结构，采用HOLE程序进行通道孔径分析，主要关注5个亚基的M2螺旋组成的通道部分（图7）.可见，9位置亮氨酸Leu与2位置丙氨酸Ala和脯氨酸Pro组成通道门控.由图7（A）可见，9位置和2位置通道较窄.由图7（B）可见，FAD-5位点处整个通道相比于只含GABA分子的情况变得更窄（颜色显示了通道的宽度，绿色表示通道变得更窄）.由图7（C）可见，FAD-6处9和2之间通道也是明显变窄，FAD-5和FAD-6不仅通道变窄，而且跨膜螺旋也具有较大的变形，所以导致整个通道有弯曲的趋势.其它几个胞外区的位点在分析通道和螺旋变化时，没有观察到明显的变化，因此将关注重点放在了跨膜结构域位点及其螺旋的变化上.对FAD-5FAD-7的受体跨膜螺旋变化情况进行分析，观察了几个位点的跨膜螺旋变化情况.结果发现，FAD-5FAD-7相对于单独使用GABA分子的情况有顺时针的扭转趋势（见本文支持信息图S4）.如图S4（A）（C）所示，灰色螺旋为单独使用GABA分子，彩色部分为FAD-5和FAD-6的螺旋部分，蓝色箭头所指为法卡林二醇的位置，蓝色圆形为通道内法卡林二醇的位置.可见，跨膜区的3个位点都使螺旋有顺时针转动的趋势.FAD-5螺旋顺时针转动的趋势较FAD-6和FAD-7更明显.而其它几个在胞外区的位点没有观察到螺旋明显的变化.由图S4（D）可见，法卡林二醇存在时胞外亚基彩色部分相对于只含GABA分子的灰色部分也有顺时针的变化，并且两个GABA分子位点的Loop C有明显的打开.这种变化趋势与GABAA受体激活剂的情况相反，再次说明跨膜区位点对GABAA受体起到拮抗作用.通过Bio3D程序包49，对运动轨迹中跨膜螺旋残基自身运动相关性进行分析，FAD-5FAD-7和只含GABA分子的受体跨膜螺旋氨基酸残基运动相关性如图S5（见本文支持信息）所示.红色表示氨基酸残基之间呈现正相关运动，蓝色表示氨基酸残基之间呈现负相关运动.对角线区域表示残基自身运动且相关性较高.FAD-5中在1100号氨基酸和500600号氨基酸正相关运动较明显，1100号氨基酸对应为2螺旋，500-600号氨基酸对应2螺旋.FAD-6中跨膜螺旋氨基酸运动相关性不是很明显，在500600号氨基酸2螺旋上有一些正相关的运动.FAD-7中在1螺旋400500号氨基酸运动相关性较为明显，2螺旋550600号氨基酸也存在一些正相关运动.只含GABA分子的螺旋自身残基运动相关性较高外，其它氨基酸的运动相比于含法卡林二醇的情况蓝色加深，更加趋于负相关运动.通过跨膜螺旋残基运动相关性对比，发现含有法卡林二醇分子和只含GABA分子的氨基酸有着相反的运动趋势.为了确定法卡林二醇分子的存在对跨膜区氨基酸运动的影响，又对FAD-5FAD-7和只含GABA分子的受体M2螺旋氨基酸运动轨迹中曲率变化进行了分析，结果如图8（A）（D）所示.通过对比含有法卡林二醇和只含GABA分子的情况，发现FAD-5和FAD-6中2亚基和2亚基上氨基酸残基运动发生Fig.7Changes in the radius of the M2 helical channel of the GABAA receptor channel(A)GABA;(B)FAD5;(C)FAD6.CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES高 等 学 校 化 学 学 报研究论文Chem.J.Chinese Universities,2023,44(2),2022050020220500(9/10)变化，FAD-7中2亚基的运动较为明显.氨基酸残基的曲率变化结合之前亚基上Loop C的打开和跨膜结构域螺旋顺时针运动，推断这是法卡林二醇与跨膜结构域螺旋上氨基酸残基相互作用使其运动发生变化，导致亚基之间相互驱动使螺旋顺时针转动，进而带动胞外区的Loop C发生顺时针转动呈打开的趋势，便于GABA分子脱离受体.3 结 论对GABAA受体上7个法卡林二醇的位点进行了结合自由能计算，通过对氢键相互作用和周围疏水性残基相互作用、伞形采样模拟计算氯离子进入通道的能量变化以及法卡林二醇对GABA分子结合受体及受体螺旋构象变化的影响等分析，确定了法卡林二醇在GABAA受体上存在的稳定结合位点，有效位点是跨膜螺旋上2亚基和1亚基的两个位点及通道内的一个位点，这些位点均对受体起到拮抗作用.本研究为后续天然产物中聚乙炔醇类化合物治疗相关神经类疾病提供了理论依据.支持信息见http:/ 考 文 献1 Hsu Y.T.，Chang Y.G.，Chern Y.，Roy.Soc.Open Biol.，2018，8（12），1801652 O Gorman Tuura R.L.，Baumann C.R.，BaumannVogel H.，Parkinsonism Relat.D，2018，54603 Dutar P.，Villette V.，Curr.Alzheimer Res.，2017，14（1），30394 Garret M.，Du Z.，Chazalon M.，Cho Y.H.，Baufreton J.，CNS Neurosci.Ther.，2018，2923005 Takcs V.T.，Cserp C.，Schlingloff D.，Psfai B.，Sznyi A.，Sos K.E.，Krnyei Z.，Dnes.，Gulys A.I.，Freund T.F.，Nyiri G.，Nat.Commun