WS_T 594-2018 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法.pdf

ICS 11.020 C 05 WS 中华人民共和国中华人民共和国卫生行业卫生行业标准标准 WS/T 5942018 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法 Test methods of fly resistance to insecticides-A molecular method for detecting insensitive ace allele in the Musca domestica 2018-03-01 发布 2018-08-01 实施 中国人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布中国人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布 WS/T 5942018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准主要起草单位：中国科学院动物研究所、北京市疾病预防控制中心、扬州大学、中国疾病预防控制中心传染病预防控制所、中国农业大学、中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所、上海市疾病预防控制中心。本标准主要起草人：邱星辉、李梅、曾晓芃、钱坤、周小洁、李静、刘起勇、高希武、赵彤言、冷培恩。WS/T 5942018 1 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法 1 范围 本标准规定了家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因的检测方法。本标准适用于家蝇乙酰胆碱酯酶第342氨基酸位点基因型的检测。2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。2.1 乙酰胆碱酯酶 acetyl cholinesterase 存在于生物体的一种水解酶，由乙酰胆碱酯酶基因ace编码。2.2 等位基因 allele 存在于同一物种的相同基因的不同形式互称为等位基因。2.3 342G、342V 和 342A 342G、342V和342A分别表示家蝇乙酰胆碱酯酶第342氨基酸残基位点上的氨基酸为甘氨酸（Gly）、缬氨酸（Val）和丙氨酸（Ala）。3 样本采集 采用诱捕或网捕等方法从现场采集家蝇成虫内，浸泡在100%乙醇溶液中带回实验室。浸泡样品可在4 条件下短期（6个月内）保存，可在-20 以下长期保存。4 引物 引物F的序列为CGGTGCATTTGGGTTTCTAC，引物R的序列为 CGTAACCGCTAAGATCTGCTG。引物设计参照附录A。配制为10 mol/L浓度，保存于-20 冰柜。5 仪器设备 5.1 PCR（聚合酶链式反应）仪。5.2 琼脂糖凝胶电泳仪。WS/T 5942018 2 5.3 凝胶成像仪。5.4 恒温水浴锅。6 主要试剂 6.1 DNA聚合酶（Taq酶）。6.2 限制性内切酶Bsp1286I。6.3 限制性内切酶Eae I。7 操作步骤 7.1 在 PCR 管中加入 10PCR 缓冲液(含 100 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L KCl,15 mmol/L MgCl2)2.5 L，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 L，引物 F 0.5 L，引物 R 0.5 L，单头家蝇的基因组 DNA 1 L （100 ng300 ng，提取方法可参见附录 B，也可用商售的 DNA 提取试剂盒或其他类似方法提取）和 Taq酶(25 个单位)，用灭菌水补齐至 25 L，混匀。7.2 将 PCR 管放入 PCR 仪中，设置 PCR 反应程序为：94 3 min；94 30 s，50 30 s，72 30 s，35 个循环；72 10 min。运行程序。7.3 PCR 运行结束后，取 5 L PCR 产物在 1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压设定在 160 V，电泳20 min 后在紫外光下检测，有清楚单一的 609bp 的条带的 PCR 产物用于进行以下酶切反应。7.4 取合格样品（即电泳检测产物为 609bp）的 PCR 产物设置两个酶切反应，反应 A 用 Bsp1286I 酶、反应 B 用 Eae I 酶进行酶切，酶切反应体系的设置根据酶产品的使用说明进行（参见附录 C）。7.5 将酶切后的产物上样在 1.5%的琼脂糖凝胶上，电压设定在 160 V，电泳 20 min 后在紫外光下检测。8 基因型确定基因型确定 根据酶切产物的电泳结果（参见附录 D），确定家蝇个体的乙酰胆碱酯酶的基因型，见表 1。表1 家蝇个体乙酰胆碱酯酶的基因型确定 反应 I(加 Bsp1286I 酶切)反应 II(加 Eae I 酶切)乙酰胆碱酯酶 342 氨基酸位点基因型 361bp、248bp 609bp 敏感型纯合子（G/G）609bp 609bp 不敏感 I 型纯合子（V/V）609bp 361bp、248bp 不敏感 II 型纯合子（A/A）609bp、361bp、248bp 609bp 不敏感 I 型/敏感型杂合子（G/V）609bp、361bp、248bp 609bp、361bp、248bp 不敏感 II 型/敏感型杂合子（G/A）609bp 609bp、361bp、248bp 不敏感 I 型/不敏感 II 型杂合子（V/A）注：G 表示氨基酸残基为 Gly（甘氨酸）；V 表示氨基酸残基为 Val（缬氨酸）；A 表示氨基酸残基为 Aal（丙氨酸）。WS/T 5942018 3 A A 附 录 A（资料性附录）引物设计参照序列 342V CGGTGCATTTGGGTTTCTACATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC 342A CGGTGCATTTGGGTTTCTACATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC 342G CGGTGCATTTGGGTTTCTACATCTTTCACCGGTTATGCCAGGTTTTGAAGAAGAAGCTCC 342V CGGCAACGTGGGTCTTTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTGAAGGAGAATGCCCG 342A CGGCAACGTGGGCCTCTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTTAAGGAGAATGCCCG 342G CGGCAACGTGGGCCTTTGGGATCAGGCCTTGGCCTTGCGTTGGCTGAAGGAGAATGCCCG 342V TGCATTTGGCGGCAATCCGGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGGTTCGAGTTC 342A TGCATTTGGCGGCAATCCGGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGGTTCGAGTTC 342G TGCATTTGGCGGCGATCCCGAATGGATGACGCTGTTTGGTGAATCGGCTGGTTCGAGTTC 342V CGTGAATGCTCAACTGATGTCGCCGGTAACGCGTGGCCTGGTCAAACGTGGTATGATGCA 342A CGTGAATGCTCAACTGATGTCGCCGGTAACGCGTGGCCTGGTCAAACGTGGCATGATGCA 342G CGTGAATGCTCAACTGATGTCGCCGGTAACGCGTGGCCTTGTCAAACGTGGCATGATGCA 342V GTCGGTCACAATGAATGCTCCCTGGAGCCACATGACATCAGAGAAGGCGGTTGAAATTGG 342A GTCGGCCACAATGAATGCTCCCTGGAGCCACATGACATCAGAGAAGGCGGTTGAAATTGG 342G GTCGGGCACAATGAATGCTCCCTGGAGCCACATGACATCAGAGAAGGCGGTTGAAATTGG 342V TAAAGCTTTGGTAAATGACTGTAACTGTAATGCCTCATTGTTACCGGTAAGCAGTGGAGT 342A TAAAGCTTTGGTAAATGACTGTAACTGTAATGCCTCATTGTTACCGGTAAGCAGTGGAGT 342G TAAAGCTTTGGTAAATGACTGTAACTGTAATGCCTCATTGTTACCGGTAAGCAGTGGAGT 342V ATTTATGCGACTATACGAATTTTTCTTTGCTGATGAATTTTATTTTCCTCTTTTTTGTGT 342A ATTTATGCGACTATACGAATTTTTCTTTGCTGATGAATTTTATTTTCCTCTTTTTTGTGT 342G ATTTATGCGATTACACGAATTATTCTTTGCTGATGAATTTTATTTTCGGCTTCTTTGTGT 342V TTTCAACTTAGGAAAATCCACAAGCTGTCATGGCTTGCATGCGACAGGTTGATGCGAAAA 342A TTTCAACTTAGGAAAATCCACAAGCTGTCATGGCTTGCATGCGACAGGTTGATGCGAAAA 342G TTTCAACTTAGGAAAATCCCCAAGCTGTCATGGCTTGCATGCGACAGGTTGATGCGAAAA 342V CAATTTCTGTCCAACAATGGAACTCGTATTCTGGAATTTTAAGTTATCCCTCGGCCCCAA 342A CAATTTCTGTCCAACAATGGAACTCGTATTCTGGAATTTTAAGTTATCCCTCGGCCCCAA 342G CAATTTCTGTCCAACAATGGAACTCGTATTCTGGAATTTTAAGTTTTCCCTCGGCCCCAA 342V CTATAGATGGAGCATTTTTGCCCGCAGATCCAATGACACTGTTGAAAACAGCAGATCTTA WS/T 5942018 4 342A CTATAGATGGAGCATTTTTGCCCGCAGATCCAATGACACTGTTGAAAACAGCAGATCTTA 342G CTATAGATGGTGCATTTTTGCCCGCAGATCCAATGACACTGTTGAAAACAGCAGATCTTA 342V GCGGTTACG 342A GCGGTTACG 342G GCGGTTACG 注：下划线分别对应上游引物与下游引物序列(反向互补)；方框内为编码342位氨基酸的密码子。WS/T 5942018 5 B B 附 录 B（资料性附录）家蝇基因组 DNA 提取方法 B.1 取单头家蝇，去除腹部后置于 1.5mL体积的离心管(eppendorf 管)中，加入 0.5 mL 新鲜配制的裂解液（含 100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl,1%SDS，0.15 mmol/L 精胺，0.5 mmol/L 亚精胺 和 2 U/mL的蛋白酶K），碾磨将虫体捣碎，置 60 温浴，20 min后取出。B.2 加入 75 L的 8 M醋酸钾，混匀，置冰上 10 min。B.3 14000 g 离心 5 min，取 400 L上清液转至新的离心管。B.4 加入 800 L 冰冷的 100%乙醇，室温放置 10 min B.5 离心 10 min，弃上清，离心沉淀用 500 L的 70%乙醇清洗。B.6 离心 5 min，沉淀干燥后（可置超净台中，开通风），加入 50 L灭菌水或TE缓冲液 （10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH=8.0）中溶解。提取的DNA样品可直接用于PCR。样品保存 4 备用，也可于-20 中长期保存。WS/T 5942018 6 C C 附 录 C（资料性附录）酶切体系设置范例 C.1 酶切反应体系的设置见表C.1。表C.1 酶切反应体系 成分 10 NEBuffer 4 100 BSA Bsp1286I Eae I PCR产物 灭菌水 反应 A 2 L 0.5 L 0.5 L 0 1 g 补至20 L 反应B 2 L 0 0 0.5 L 1 g 补至20 L 注：采用限制性内切酶Bsp1286I，EaeI。10NEBuffer 4和100BSA随酶提供，其中 1NEBuffer 4 含 50 mmol/L KAc，20 mmol/L Tris-Ac，10 mmol/L Mg(Ac)2，1 mmol/L DDT，pH7.9(25 测定)，100 BSA 成分为10 mg/mL的BSA(牛血清白蛋白)。C.2 37下进行温浴，时间 2h4h，反应结束，直接用于电泳检测。WS/T 5942018 7 D D 附 录 D（资料性附录）家蝇乙酰胆碱酯酶 342 位点不同基因型 PCR 产物的酶切结果 家蝇乙酰胆碱酯酶342位点不同基因型的PCR产物酶切结果见图D.1。G氨基酸残基为Gly（甘氨酸）；V氨基酸残基为Val（缬氨酸）；A氨基酸残基为Aal（丙氨酸）；G/G敏感型纯合子；V/V不敏感 I型纯合子；A/A不敏感II型纯合子；G/V不敏感I型/敏感型杂合子；G/A不敏感II型/敏感型杂合子；V/A不敏感I型/不敏感II型杂合子；1Bsp1286I酶切产物图；2EaeI酶切产物图。注：最右侧道为DNA分子量标记。图D.1 家蝇乙酰胆碱酯酶342位点不同基因型PCR产物的酶切结果 _