专题九-考点一-基因工程(含PCR技术与应用).docx

第一篇专题突破
专题九现代生物科技专题【考情解读】
考
点
1.基因工程的诞生。2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)。3.基因工程的应用。4.蛋 白质工程。5.植物组织培养。6.动物细胞培养与体细胞克隆。7.细胞融合与单克隆抗体。
8.动物胚胎发育的基本过程与胚胎工程的理论基础。9.胚胎干细胞的移植。1().胚胎工程 的应用。11.转基因生物的平安性。12.生物武器对人类的威胁。13.生物技术中的伦理问 题。14.简述生态工程的原理。15.生态工程的实例。
考 情
1. 考查题型：多以简答题呈现。
2. 命题趋势：基因工程几乎每年均有考查，多以基因工程的基本程序为背景，既可单独 考查其中相关的生物学原理和考前须知，也常结合细胞工程和胚胎工程进行综合考查。

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植物坦炽培养.植物体细胞柴交
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」生态工程的实例钮开展前快
大肠杆前
诚嘟％a

大肠杆前
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无值牙签
菌落&
大 肠 肝 前
含四 环素
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切割后的质粒 I④
化别离一
厂元长激乙C丙 |•徐霸广含氮羊青霉含四环泰
[③素和四环素*
必人生长激索mRNA—人的某种组织细胞
（1）FI的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有的因子。过程①所用到的组织细胞是,③过程的目的是,⑤过程
常用溶液处理大肠杆菌。
⑵如果用限制酶PWI、&VRI和位〃dill对图中质粒进行切割，形成的DNA片•段种类有 种，这些种类的DNA片段中含有完整氨茉青霉素抗性基因的DNA片段和四环素 抗性基因的DNA片段分别有种和种。
⑶如果只用限制酶Ps/I切割目的基因和质粒。完成过程（©）. （@）后（受体大肠杆菌不含 Amp\ Tef）,将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取培养 基甲上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长 状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选的大肠杆菌；接种到培养基乙上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是。含有
目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是。
答案（1）调控作用人垂体组织细胞将平末端处理为黏性末端CaCk （2）9 3 3（3）含四环素抗性基因完整的pBR322质粒（或含有成叩「、7^的质粒）在丙中能存活，在 乙中不能存活
解析（I）目的基因主要是指编码蚤白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子，垂体 才能产生生长激素，过程①所用到的组织细胞是人垂体组织细胞。⑤过程将基因表达载体导 入大肠杆菌。常用CaCh溶液处理大肠杆菌，使大肠杆菌处于易于吸收外界环境中DNA分 子的感受态。
⑵（后面的f均按照顺时针方向）假设Pst I > EcoR I和位〃dill三种酶的切点分别用1、2、3 表示。一种酶分别酶切时，一共可以得到3种片段1-1、2—2、3—3:任意两种酶分别同 时酶切时，可得到1-2、2-1、2-3、3-2、1-3、3—1六种片段：三种酶同时酶切时， 可得到1~2、2-3、3~1三种片段。综上所述，共计9种不同的片段（1-1、1-2、1~3、 2-1、2-2、2-3、3-1、3-2、3-3）。其中片段 3-2、2-2、3-3 共 3 种含有完.整氨节 青霉素抗性基因，片段2-1、2—2、1一1共3种含有完整四环素抗性基因。
（3）用限制酶如I切割目的基因和质粒，会破坏人，好（氮芋青霉素抗性基因），但彻「（四环素 抗性基因）没有破坏。在甲中能生长的是具有四环索抗性基因的细菌，因此接种到甲培养基 上的目的是筛选含四环素抗性基因的大肠杆菌：培养基乙上含有泉芋青霉素和四环素，能够 存活的大肠杆菌应该含有Am/f.彻「基因，因此接种到培养基乙上的大肠杆菌菌落，能存活 的大肠杆菌体内导入的是完整的pBR322质粒（或含有Amp\亿/的质粒）。与丙相比，乙培 养基中少了两个菌落，说明丙培养基中这两个菌落中的大肠杆菌成功导入了重组质粒，而且 目的基因插入质粒后，破坏了 A〃?p『（氮千青霉素抗性基因），使含有目的基因的大肠杆菌不能 在含有柬芋青霉素的乙培养基上生长，但 久汽四环素抗性基因）是完好的，那么含有目的基因 的大肠杆菌能在含有四环素的丙培养基上生长，因此含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和 丙上的生存情况是在丙中能存活，在乙中不能存活。
题组二蛋白质工程目前，市场上出售的胰岛素主要是从动物体内提取和基因工程生产等途径得到的。请回 答以下问题：
（1）利用重组酵母细胞生产胰岛素的过程中，胰岛素基因可以从中获取。获得的DNA经扩增后，与载体相连构建成重组DNA,将重组DNA导入酵母细胞后获得重组酵母 细胞，该过程常用的载体为。
经限制酶切割后的载体与胰岛素基因能再次拼接的原因是。
（2）天然胰岛素存在很多缺点，如起效慢、半衰期短等。科研人员利用蛋白质工程生产出了 速效、长效胰岛素。该技术的基本途径为：
E设比预期的蛋推测一E找到一相应的脱轼一生产出速效、
白质结构 -LLI —核昔酸序列 K效胰岛素其中，A是, B是=
该过程改造了,制造出了新的蛋白质，新胰岛素长效的原因是9
新胰岛素的设计还要注意防止患者出现等免疫问题。
答案（1）基因文库质粒切割产生的黏性末端相同（2）预期蛋白质的功能应有的氨基 酸序列天然胰岛素新胰岛素与天然胰岛素结构不同，体内分解胰岛素的酶无法分解新胰 岛素过敏解析（1）获取目的基因常用的方法：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 利用重组酵母细胞生产胰岛素的过程中，胰岛素基因可以从基因文库中获取。基因工程的载 体有质粒、入噬菌体的衍生物、动植物病毒等，其中质粒是常用的载体。只有具有相同黏性 末端的基因才能拼接，因此经限制酶切割后的载体与胰岛素基因能再次拼接的原因是切割产 生的黏性末端相同。
（2）蛋白质工程的基本途径为：从预期的蚤白质功能出发一设计预期的蚤白质结构一推测应 有的氨基酸序列一找到相对应的脱氧核昔酸序列（基因）。以上是蚤白质工程特有的途径；以 下按照基因工程的一般步骤进行。因此图中A是预期蛋白质的功能，B是应有的氨基酸序 列。
玄通教材防遗漏（选修3P4-6正文）基因工程的工具包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶及载体,最常用 的载体是质粒。
1. （选修3P8〜n正文）获取目的基因常用的三种方法：从基因文库中获取F1的基因、利用PCR 技术扩增目的基因及通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
2. （选修3 Pio正文）PCR技术扩增的过程是：目的基因DNA受热（90〜95 °C）变性后解链为 单链,引物与单链相应互补序列结合（55〜60 °C,即“复性”），然后在热稳定DNA聚合酶
酶）作用下延伸,如此重复循环。
3. （选修3Pn正文）基因表达载体的构建是基因工程的核心,一个基因表达载体的组成除目 的基因外，还必须有启动于、终止子及标记基因等。
4. （选修3 P,i正文）标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有 目的基因的细胞筛选出来。
5. （选修3 P”正文）蛋白质工程是指以蛋白是分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基 础，通过基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人 类的生产和生活的需求。
6. （选修3 Pm正文）植物组织培养就是在无菌和人_E控制条件下,将离体的植物器官、组织、 细胞,培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽,最 终形成完整的植株。
7. （选修3P36正文）进行植物体细胞杂交之前，必须先利用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁, 获得具有活力的原生质体，再川物理法或化学法诱导原生质体融合。
8. （选修3 P44正文）动物细胞工程常用的技术手段有动物细胞培养、动物细胞核移植、动物 细胞融合、生产单克隆抗体等。
9. （选修3 P”正文）人们通常将动物组织经胰蛋白酶或胶原蛋Fl酶处理后的初次培养称为 原代培养，将贴满瓶壁的细胞重新用蜒自函等处理，然后分瓶继续培养称为也理茬。
10. （选修3 P47正文）动物细胞核移植是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个己经去掉细胞 核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。
11. （选修3 P54正文）单克隆抗体制备过程中涉及两次筛选，第一次是利用特定的选择性培 养基进行筛选,排除未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞，只留下杂交瘤细胞；第 二次是克隆化培养和抗体检测,获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
12. （选修3 P6-63正文）哺乳动物精子的发生是从翅倒&开始的连续过程，卵子的发生自胎 儿期即形成初级卵母细胞，排卵前后完成减数第-次分裂，至受精时完成减数第二次分裂。
13. （选修3 P63正◎当在卵细胞膜和透明带的间隙可以观察到西仝极体时，说明卵子己经 完成了受精，这是判断卵子是否受精的重要标志。
14. （选修3 P64F正文）透明带反响及卵细胞膜反响是阻止多精入卵的两道屏障。
15. （选修3 P69正文）用促性腺激素处理,使实验动物排出更多的卵子，然后从输卵管中冲 取卵子，直接与获能的精子在体外受精。
16. （选修3 P79正文）进行胚胎分割时，应选择发育良好、形态正常的桑枢胚或囊胚。要注 意将内细胞团均等分割。
17. （选修3 P80正文）哺乳动物的胚胎干细胞简称ES或EK细胞，是由早期胚胎或原始性腺 中别离出来的一类细胞。
18. （选修3 P1O3-1O7正文）生态工程所遵循的基本原理有物质循环再生原理、物种多样性原理、 协调与平衡原理、整体性原理、系统学和工程学原理。
考点一 基因工程（含PCR技术与应用）
岂主干整合1.基因工程的理论基础
基础
理论
基因拼接
蛋白质 （性状）
外源基因在 受体细胞内畏达
I①基因是控制生物性状的遗: :传物质的结构和功能单位；； i②遗传信息的传递邰遵循中［ I心法那么； : ：③/物认共用一套遗传密码: !'I①DNA的基本组成机位都I !是四种脱氧核苻酸；
；②DNA分子都遂循碱基互: :补配对原那么；
:③双链DNA分子的空间结: !构都是规那么的双螺旋结构II
2.基因工程的3种基本工具

(基因工程的3种基本工具〕
限制性核作用识别特定的核昔酸序列并切开特定部位
的两个核首酸之间的磷酸二酯键
酸内切怖嫌-•般用同种限制酶切割裁体和目的基因 DNA连接酣「①E-coli DNA连接维只能连接黏性末端 飞该一②T, DNA连接酶能连接黏性末端和平末端我体
特点厂①能在宿主细胞内检定存在并大虽复制 一②有一个至多个限制酶切割位点
I-③具有特殊的标尼基因，以便对含H的基因 的受体细胞进行筛选

的因取
目基获
熟记基因工程的四个操作步骤
（1）目的基因的获取途径
一从基因文库中获取
一利用PCR技术扩增
人工」-利用mRNA反转录合成
合成通过DNA合成仪用化学方法合成
（2）基因表达载体（重组质粒）的构建

启 动 子

:基因的首端JRNA聚合酶识别和结合的部 ［位.驱动基因的转录
目的基因：人们所需要的基因新函位置：目的基因的尾端 八止于\功能：终止转录
标记基因：用于目的基因的检测与箫选

（3）将目的基因导入受体细胞

目的基因 导入受体 细胞的方
植物
植物体细胞或受精卵一农杆值转化法、 花粉管通道法、基因枪法（本法针对氓 子叶植物）
业一-•般为受精卵——“显微注射法” 壑堕原核生物——“感受态细胞法“

（4）目的基因的检测与鉴定

DNA分了•杂交技术检测受体细胞DNA上是否插入＜ ~ 目的基因
目的基因 的检测与 鉴定方法
分子宗交技术_ 检测目的基因是否转录出mRNA 抗帜一抗体楸，检测目的基因是否翻译出蛋白质 个体生物学水平鉴定抗虫或抗病接种实验等图解记忆蛋白质工程
基用修饰或基因
操作

合成
手段

a

设计一:
改造现有蛋白质,

流程:
或制造出新的蛋 白质
结果

预期蛋门质的功能设计预期的蛋白质靖构 推测应有的氛基酸序列
找到相对应的脱轼核仔 酸序列（基因）
5. PCR技术原理与条件含义多聚酿链式反响的简祢.是一种体外职速 扩增DNA片段的技术
驷一 DNA双链复制
条件 棋板DNA、引物、游离的dCTP、dATP、
— dGTP、dTTP、热检定DNA聚合醵（，时前）术理条 技原与件

术理条 技原与件
前提 有一段目的基因的核背酸序列，以便 一根据这一序列合成引物
空_DNA的合成方向总是从了•链的5,端向3,端 方向延伸引物 基一小段RNA或单.链DNA.它能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对
短时间内大扯扩增目的基因
目的

6. PCR技术的过程

当温度加热至90-95 t时，双链DNA解链 为氓链5'

5'
口 | 口 | | 口 | | |
|加热至9<)~95丁I I 11 1155 I I I 11 I I I I 11 3
温度冷却至55-60 t时，两种引物通过碱_基互补陀对与两条单链DNA结合
当温度加热至70^75 t时.mq诙从引物起 _始进行互补链的合成（从宁端向3,端延伸） 3、
?：」」」」ng 引物「5J 11111111 FT ^.!.l.LlJJLLLlT'y
'引物I引物n邕真题研究
1. （2021-全国乙，38）用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如 图所示。
1
1
1
I
GAA1TC
CCCGGG
CTGCAG
GATATC
CTTAAG
GGGCCC
GACGTC
CTATAG
t
f
t
t
EcoR 1
Sma I
Pst I
EcoRV
限制酶：
回答以下问题:
.酶切
切割后的
⑴常用的DNA连接酶有E coli DNA连接酶和T4DNA连接酶，上图中割后的DNA片段可以用E colim\连接酶连接,上图中
DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是.
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中

保证质粒在受体细胞中
；质粒DNA分子上有.
，便于
外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛 选出含质粒载体的宿主细胞，方法是.
（4）表达载体含有启动子，启动子是指O 答案（l）£vR I、EcoR I、Psil、Sma I 和 EccRV （2）磷酸二酯键（3）自我复制 一至多个限制酶切割位点用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质 粒载体的宿主细胞（4）位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的 部位，能驱动转录过程
解析（1）限制酶EcoR I和Pst I切割形成的是黏性末端，限制酶Sma I和EcoRV切割形成的是平末端，Ecoli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之 间的磷酸二酯键连接起来，而TiDNA连接酶来源于「噬菌体，可用于连接黏性末端和平末 端，但连接效率较低。因此图中EcoR I和切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E coli DNA 连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶Sma I和EcoR V切割后的DNA 片段(平末端)也可以用T4DNA连接酶连接。
⑶质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保 证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶的酶切位点，便于目 的基因的芋入。质粒上的标记基因是为了签定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用 含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。
(4)启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的 部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得需要的蛋白质。
2. (2021-山东，25)人类丫基因启动了上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位 点结合BCL11A蛋白后，丫基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对丫基因 表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了丫基因上游不同长度的 片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如下图。
调控序列 及启动子
'基因
R I
Xho I Mun I 'Sail 终止子
注：
F1~F7、R:引物
P:雄性激素诱导下发 挥作用的启动子
限制酶识别序列及 切割位点：
Mun \ : C AATTG
载体的部终止荧光蛋 BCLUA 分结构子白基因 P基因
\ \ /
Xho \ : C TCGAG
EcoR 1 : G AATTC
Sall : G TCGAC
Nhe I EcoR I Muii I EcoR I Xlu)I 终止子
Nhe I : G CTAGC

,在R末端添加
的序列所对应的限制酶是.
。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程
为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别
序列。据图可知，在F1〜F7末端添加的序列所对应的限制酶是.

共需要种酶.
(1) 将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1〜F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7 与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是o
(2) 向培养液中添加适量的雌性激素，含F1〜F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5〜F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。假设丫基因上游调控序列上与引物序列所对应的 位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCLIIA蛋白结合位点位T，理由是 答案（l）Sfl/I EcoR I 6 （2）F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 （3）引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1〜F4 与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游（右侧）；F5〜 F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游（左侧），所 以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
解析（1）据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，那么含有 启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R 端与荧光蚤白基因中限制酶识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指 导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被 限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有〃【和 Xho I的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能，被限制酶Mun I和X/少I所识 别，故应该选用添加限制酶EcoR I和限制酶Sal]识别序列，由图可知，限制酶Mun I识 别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR I识别并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序 列所对应的限制酶是EcoR [,在F1〜F7末端添加的序列所对应的限制酶是SWI;荧光蛋 白基因中含有限制酶EcoR I的识别位点，故对载体使用限制酶Mim I和X/?。【切割。综上 所述，对载体使用限制酶Mun I和Xho I切割，对扩增后的产物用限制酶EcoR I和限制酶 Sell识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使 用酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶， 分别是Taq酶、限制晦EcoR I、限制酶Sal I、限制酶Mun I、限制酶Xho I、DNA连接 酶。（2）受体细胞中已经除去BCLIIA基因，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需 要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蚤白基因的转录过程；含F1〜F6与R扩增 产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，那么可 能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。（3）向培养液中添加适量的 雌性激素，此时重组载体上的BCL1IA基因表达，产生BCL1IA蛋白，BCL11A蛋白与 BCL11A蚤白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含F1〜F4与R扩增产物的受体 细胞不再有荧光，那么说明BCL11A蛋白的结合位点在引物F4与引物R之间的序列上；含 F5〜F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，那么说明BCL11A蛋白结合位点在引物F5的上 游序列，故据此结果可推测，BCL11A蚤白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应 序列之间的区段上。
【思维延伸一填充（1）（2019-全国I , 38节选）在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反响体系中的模板DNA 解链为单链的条件是加热至90〜95_°C。在PCR反响中使用酶而不使用大肠杆菌DNA 聚合酶的主要原因是7^/酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活。
（2）（2018-江苏，32节选）为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的匚端加上 限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是使DNA 片段能定向插入表达载体，减少自连。
（3）（2018-海南，31节选）用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜受伤的（填“受伤的”或“完好 的”）叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，选用这种叶片的理由是叶片伤口处的细胞释放出 大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞。
（4）（2016-全国I , 40节选）某一质粒载体如下图，外源DNA插入到氨节青霉素抗性基因 （而泌）或四环素抗性基因（切）中会导致相应的基因失活。有人将此质粒载体用BamW I酶切 后，与用BamW I W切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反响，用得到的混 合物直接转化大肠杆菌。如果用含有氨节青霉素的培养基进行筛选，在上述处理后大肠杆菌 细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是二者均不含有氨 节青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长;并且含有质粒载体和含有插入了目的基因的重 组质粒的细胞也是不能区分的，其原因是二者均含有氨节青霉素抗原基因，在该培养基上均 能生长。在上述筛选的基础上，假设要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌 落，还需使用含有四环素的固体培养基。

（5）（2017-全国I], 38节选）假设要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直 接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子（答 出两点即可）。
（6）（2017-全国I, 38节选）某同学从人的基因组文库中获得了基因A（有内含子），以大肠杆 菌作为受体细胞却未得到蛋白A,其原因是基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录 产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A。
（7）（2017-全国【I, 38节选）假设获得的转基因植株（目的基因——几丁质酶基因已经整合到植物 的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法那么分析，其可能的原因是目的基因的转 录或翻译异常。
（8）（2019.海南，31节选）人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质（Y）,天然的Y通 常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氮基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性， 假设要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是找到第6位氨基 酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的减基。
邑题组集训题组一基因工程
1. （2021-广东，22）非细胞合成技术是•种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体 系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了 4 步酶促反响的非细胞合成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期 解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
a-«1聚博磷酸葡萄阈酸化储槽变位他
6■磷酸-偏茄瓯
国酸盐
磷酸肌醉
1-磷酸-葡箭槌
1 ■磷酸■肌痔回答以下问题:
（1）研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因 的方法还有。（答出两种即可） ⑵高质量的DNA模板是成功扩增出日的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时 必须除去蛋白，方法有。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL2I作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种醉的表达。
表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件卜，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反响体系。假设这些酶最适反响条件不同，可能导致的结果是。
在分子水平上，可以通过改变，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
答案（1）从基因文库中获取、人工合成法（2）盐析法、酶解法或高温变性（3）感受态 抗 原一抗体杂交技术（4）有的酶失活而使反响中断基因的碱基序列解析（2）在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、 高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。（3）表达载体转 化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞，即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞， 易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因（目的基因）成功表达的产物酶蛋白的化学 本质是蛋白质，常用抗原一抗体杂交技术进行检测。
2. 如图是利用工程菌（大肠杆菌）生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制 酶Psrl、EcoRl和H小dill的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而如泌■表 示氨节青霉素抗性基因，么/表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：