常见食品过敏原可视芯片检测方法（编制说明）.doc

常见食品过敏原成分检测 可视薄膜生物传感器芯片法 编制说明1 基本信息1.1 标准草案名称中文常见食品过敏原成分检测 可视薄膜生物传感器芯片方法英文Detection of common allergens in food Optical thin-film biochips method1.2 与国际标准和国外先进标准一致程度情况等同修改非等效标准号/英文名称/中文名称/1.3 任务来源批准立项的文件名称和文件号关于下达2012年第一批出入境检验检疫行业标准制（修）订计划项目的通知（国认科201236号）计划编号2012B1421.4 制（修）订情况制订修订替代的标准编号/1.5 起止时间2012年01月2013年10月1.6 起草单位中国检验检疫科学研究院等1.7 起草人陈颖、黄文胜等1.8 专业类别1、食品（化妆品）检验；2、卫生检疫；3、动物检疫；4、植物检疫；5、纺织产品检验；6、轻工产品检验；7、机电产品检验；8、化工、矿产品和金属材料检验；9、管理；10、鉴定；11包装及危险化学品1.9 标准体系表代码1.10 调整情况2 背景情况2.1 目的、意义进入21世纪以来，过敏性疾病发病率显著上升，已成为影响人类健康最常见的全球性疾病。据WHO统计，全世界约25%的人患有过敏性疾病，其中儿童数量最多，并且还以每10年23倍的速度增加，在我国就有2亿多食品过敏原患者。食物过敏已经成为全世界关注的公共卫生热点问题，而且这个问题正呈现出逐渐扩大的趋势，这不仅体现在过敏患者数量上，还体现在食品过敏原的种类上。常见的食品过敏原主要包括鸡蛋、牛奶、花生、大豆、小麦、坚果、鱼和甲壳类等8大类食物及其制品，约有90%的食品过敏是由这8类食物及其制品引起的。食品过敏已被WHO视为一种新的重要的食品安全问题和严重的国际性公共卫生问题。食品过敏至今尚无特效疗法，微量甚至痕量的过敏原即可造成严重的后果。要想预防和减少过敏原对消费者的不良影响，远离含有过敏原的食品不失为一种较好的方法。要达到此目的，在食品标签上标识过敏原的存在是避免过敏患者食入潜在食品过敏原的最有效的途径。尽管食品过敏原的检测分析研究是当今的研究焦点和热点，但是快速、简便、高通量、高灵敏度的多种过敏原同时检测方法仍是食品过敏原检测的瓶颈。目前针对致敏原的检测方法主要还是以蛋白和DNA为检测目标。以致敏蛋白为检测对象的免疫学方法是目前食品中潜在过敏原检测最常用的方法。但由于许多过敏原有着共同的抗原决定簇，受交叉反应影响而导致检测结果呈假阳性，一些深加工食品由于其中的蛋白结构被破坏，也会导致假阴性结果的出现，而对于某些过敏原由于缺乏特异性抗体也无法使用免疫学方法。与免疫学方法相比，核酸方法可通过引物的优化和靶序列的合理选择来克服交叉反应的影响。但是，目前无论是免疫学检测还是核酸检测，通常只能同时检测1种或少量几种过敏原，而在实际检测中，由于过敏原种类多，且大多存在交叉反应，更需要对多种过敏原进行同时筛查检测。作为新型的检测技术，蛋白或基因芯片技术以其高准确性、高灵敏度、高通量的优势逐渐成为食品过敏原研究的热点。但是，这些方法大多操作复杂、价格昂贵、而且都以大型的仪器设备和熟练的专业技能为前提的检测技术，因此并不适合于基层的广泛应用和推广。建立新型高效食品过敏原检测方法（可视薄膜生物传感器芯片法），不但是进出口食品过敏原监测、预警工作的需求，也为我国食品安全法的顺利实施提供可靠的科学支持和坚实的技术保障；同时为破除国外技术壁垒，保护人民身体健康，减少贸易摩擦，促进我国进出口贸易都具有重要的意义。2.2 与国内外相关标准、文献的关系无国内外标准和相关文献。国内外报道空白。3 编制过程3.1 准备阶段（可选项）本项目承担单位主持研发和起草了多项国家标准和检验检疫行业标准，具有较强的过敏原成分检测技术研发实力和权威性，为课题组顺利完成本标准的研制工作打下了坚实的基础。3.2 分工情况中国检科院农产品中心陈颖研究员主持标准研制工作的进行，负责安排分工、整体策划和协调；黄文胜研究员负责标准品的收集购置和引物设计；王玮负责坚果等样品的筛选工作、研究方法的建立以及方法性能参数优化；吴亚君、韩建勋、傅凯等负责标准方法的室内验证实验；陈颖、黄文胜、邓婷婷负责室外验证相关准备实验以及标准文本和编制说明的撰写。上述工作目前已全部完成。3.3 标准草案编写情况2013.3-7完成标准草案的编写。3.4 征求意见情况（适用于送审稿）3.5 审定情况（适用于报批稿）/3.6 预期的管理目标（适用于规程类标准）或技术指标（适用于方法类标准）4 主要技术内容的确定一、国内外相关的标准要求无。二、测定步骤1材料1.1 供试材料从当地超市购买大豆、花生、小麦、牛、鱼、鸡、虾、腰果，用于分析方法的特异性和灵敏度。从当地超市购买含有、可能含有以及不含上述所有8种过敏原成分的食品11种，用于实际样品的检测试验。1.2 主要试剂除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。1.2.1 检测用引物（对）序列本实验所采用引物和探针详见表1。表中F：表示上游引物；R：表示下游引物；P：表示探针；biotin：表示生物素标记；ALD：表示醛基修饰。表1检测用引物和探针样品引物和探针序列目的基因大豆F: 5GCCCTCTACTCCACCCCCA3R: 5biotin-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT3P: 5ALD-aaaaaaaaaaAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC3大豆Lectin基因花生F: 5CGCAAAGTCAGCCTAGACAA3R: 5biotin-CTTGTCCTGCTCGTTCTCT3P: 5ALD-aaaaaaaaaaGAAGAGCGTGAATTTAGCCCTCGAGGACAGCA3花生Ara h 3基因小麦F: 5TGGTCTCATCCCTCTGGTCAA3R: 5biotin-GCTGCTGAGGAATCTGTGCTA3P: 5ALD-aaaaaaaaaaTGGCCACAAAGCGATTGCCAAGTGATGA3小麦Gliadin基因腰果F: 5TGCCAGGAGTTGCAGGAAGT3R: 5biotin-GCTGCCTCACCATTTGCTCTA3P: 5ALD-aaaaaaaaaaACAGAAGGTGCCGCTGCCAGAA3腰果Ana o 3基因鸡F: 5CCCTCCTCCTTTCATCCTCAT3R: 5biotin-GTCATAGCGGAACCGTGGATA3P: 5ALD-aaaaaaaaaaCTATGAATCCGGGCCTC3鸡线粒体DNA基因牛F: 5GCCATATACTCTCCTTGGTGACA3R: 5biotin-GTAGGCTTGGGAATAGTACGA3P:5ALD-aaaaaaaaaaCACAACTTTTATCACAATCCAGAACTGACACCAAC3牛线粒体DNA基因鱼F: 5ATA ACAGCGCAATCCTCTCCC3R: 5biotin-GCTGCACCATTAGGATGTCCT3P: 5ALD-aaaaaaaaaaTTTACGACCTCGATGTTGGA3鱼16S rRNA基因虾F: 5AAGTCTAGCCTGCCCACTG3R: 5biotin-GTCCAACCATTCATACAAGCC3P: 5ALD-aaaaaaaaaaGACCGTGCGAAGGTAGCATAATCATTAGTCT3虾16S rRNA基因1.2.2十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium bromide, CTAB）。1.2.3三羟甲基氨基甲烷(tris (hydroxymethyl) aminomethane, Tris)。1.2.4乙二胺四乙酸二钠（disodium ethylenediamine tetraacetic acid , Na2EDTA）。1.2.5氯化钠（NaCl）。1.2.6三氯甲烷（氯仿）。1.2.7异丙醇。1.2.8 无水乙醇。1.2.9 70%乙醇。1.2.10酸处理的酪蛋白（acid-treated casein, ATC）。1.2.11柠檬酸三钠（C6H5Na3O72H2O）。1.2.12十二烷基硫酸钠（SDS）。1.2.13辣根过氧化酶抗体 （HRP-antibody）。1.2.14四甲基联苯胺（TMB）。1.2.15 CTAB提取缓冲液：20 g/L CTAB, 1.4 mol/L NaCl, 0.1 mol/L Tris-HCl, 0.02 mol/L Na2EDTA, pH8.0。1.2.16 CTAB沉淀液：5 g/L CTAB, 40 mmol/L NaCl。1.2.17 蛋白酶K溶液：20 mg/mL。1.2.18 1.2mol/L NaCl溶液：1.2 mol/L。1.2.19 TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0。1.2.20 PCR反应混合液：HotMaster Taq DNA 聚合酶（5 U/L）、超纯dNTPs （各2.5 mmol/L）、 10Multi Hotstart Buffer （含20 mmol/L Mg2+）。1.2.21 1PBS缓冲液：称取8.0 g NaCl，0.2 g KCl，0.27 g KH2PO4和1.42 g Na2HPO4，溶于800 mL 去离子水中，充分搅拌均匀，用浓HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加去离子水定容至1 L。1.2.22 20SSC溶液：3.0 mol/L NaCl, 0.3 mol/L C6H5Na3O7。1.2.23芯片杂交缓冲液：30 mL 20SSC溶液和12 mL ATC（5%, w/v）溶液，加去离子水定容至120 mL。1.2.24 SDS溶液：1 mg/mL。1.3 仪器和设备PCR扩增仪。离心机：最大离心力16000 g。微量移液器：2.5 L、10 L、100 L、200 L、1000 L。冰箱：2C8C，-20C。高压灭菌器。精密烘箱。组织研磨器。涡旋震荡器。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。pH计。天平：感量0.01 g。2 方法2.1 样品处理称取待测样品10 g，用洁净研钵或合适的粉碎装置将样品充分研磨混匀。2.2食品过敏原基因组DNA的提取2.2.1 CTAB方法（1）称取100 mg已制备好的样品于2 mL离心管中，加入1.5 mL CTAB 提取缓冲液和10 L蛋白酶K溶液（20 mg/mL），振荡均匀，65C振荡孵育30 min；（2）将上述裂解物于12000 rpm离心10 min，小心转移上清液至新的2 mL离心管中；加入750 L三氯甲烷后用力振荡，12000 rpm离心15 min；（3）吸取上清液至一新的2 mL离心管中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，振荡均匀，室温静置1 h后，12000 rpm离心15 min，弃去上清液；（4）加入350 L 1.2 mol/L NaCl溶液将沉淀充分悬浮，再加入350 L三氯甲烷，涡旋振荡混匀，12000 rpm离心10 min；（5）吸取上清液至一新的1.5 mL离心管中，加入0.8倍体积异丙醇，-20C静置1 h，12000 rpm离心10 min，弃去上清夜；（6）用70%乙醇溶液洗涤沉淀2至3次后，12000 rpm离心10 min；（7）弃去上清液，晾干；加100 L TE溶液（或灭菌水）溶解沉淀DNA，立即使用或-20C保存备用。2.2.2其他方法待测样品DNA的提取也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。2.2.3 DNA浓度的测定取适量DNA溶液原液加灭菌水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260 nm和280 nm处的吸收值。DNA的浓度按照公式1计算。OD260/ OD 280比值在1.71.9之间时，适宜于PCR扩增。C=OD260N50（1）式中：CDNA浓度（g/mL）OD 260260 nm处的吸光值N核酸稀释倍数2.3 多重PCR扩增2.3.1多重PCR反应体系反应体系A总体积为25 L，其中含：样品DNA模板4 L，大豆引物对（10 mol/L）各0.2 L，花生引物对（10 mol/L）各0.4 L，小麦引物对（10 mol/L）各0.4 L，腰果引物对（10 mol/L）各0.2 L，HotMaster Taq DNA 聚合酶（5 U/L）0.2 L，超纯dNTPs（各2.5 mmol/L）1 L，10Multi Hotstart Buffer （含20 mmol/L Mg2+）2.5 L，水补足至总体积25 L。反应体系B总体积为25 L，其中含：样品DNA模板4 L，牛引物对（10 mol/L）各0.2 L，虾引物对（10 mol/L）各1.2 L，鱼引物对（10 mol/L）各0.2 L，鸡引物对（10 mol/L）各0.16 L，HotMaster Taq DNA 聚合酶（5 U/L）0.2 L，超纯dNTPs（ 各2.5 mmol/L）1 L，10Multi Hotstart Buffer （含20 mmol/L Mg2+）2.5 L，水补足至总体积25 L。2.3.2多重PCR反应参数95C预变性15 min，94C变性30 s，58C退火30 s，72C延伸20 s；35个循环；循环完成后72C，5 min充分延伸。PCR反应条件随仪器和试剂不同可略有改变。2.4 可视薄膜生物传感器芯片检测（1）预杂交：小心加入90 L杂交缓冲液于芯片盒里，使芯片完全浸在杂交缓冲液中，45C孵育5 min。（2）PCR产物变性：将2 L PCR产物用灭菌水稀释至10 L，混匀稍微离心后，95C变性3 min。（3）杂交：将变性的PCR产物立即移至杂交缓冲液中，吸打混匀且防止出现气泡，45C孵育10 min。（4）冲洗：吸出杂交缓冲液，加入200 L 0.1SSC溶液于芯片盒里，轻微地用移液枪反复吸打液体3至5次，如此冲洗2至3次后，用灭菌水洗涤3次，后用干燥气流吹干芯片表面。（5）抗体结合：加入100 L辣根过氧化酶抗体溶液于芯片盒里，使芯片完全浸在HRP抗体溶液里，室温放置5 min。（6）冲洗：吸出抗体溶液，加入200 L 0.1SSC溶液于芯片盒里，轻微地用移液枪反复吸打液体3至5次，如此冲洗2至3次后，用灭菌水洗涤3次，后用干燥气流吹干芯片表面。（7）底物显色：加入100 L四甲基联苯胺（TMB）底物显色液，使芯片浸在TMB底物显色液里，室温避光放置5 min。（8）冲洗：吸出TMB底物显色液，加入200 L 灭菌水于芯片盒里，轻微地用移液枪反复吸打液体3至5次，如此冲洗2至3次后，用干燥气流吹干芯片表面。（9）观察结果，照相。三、方法灵敏度要求目前国内外针对食品过敏原成分检测方法灵敏度没有统一要求。分子生物学方法灵敏度一般超过实际产品检测需求。本方法绝对检测灵敏度为0.1 pg/L DNA，实际灵敏度为0.001%（w/w）。四、提供的图谱4.1 DNA提取效果 图1 食品过敏原单重PCR方法扩增结果1. 大豆（118bp）；2. 小麦（96 bp）；3. 花生（78 bp）；4. 腰果（67 bp）；5. 牛（271 bp）；6. 虾（109 bp）；7. 鱼（86 bp）；8. 鸡（62 bp）；B. 空白对照（ddH2O）；M. 50 bp DNA Ladder Marker。从图1可以看出，空白对照未出现扩增条带，说明整个PCR反应体系未出现污染；PCR扩增产物大小与实验设计相符，8对引物分别在271bp（牛）、118 bp（大豆）、109 bp（虾）、96 bp（小麦）、86 bp（鱼）、 78 bp（花生）、67 bp（腰果）和62 bp（鸡）处均出现清晰明亮的特异性扩增条带，这也说明CTAB法提取DNA的质量满足PCR反应需求。4.2 可视薄膜生物传感器芯片法4.2.1特异性从图2可见，阳性对照点全部明确地显示出来，且都依照实验预先设计的排列成十字型图案，而每组实验中的目的探针也均都呈现出明显的信号，可以与背景明确清晰的区分开。同一张芯片上其他的非目的探针位点则完全与背景一致，没有任何信号。芯片中29上探针位点的颜色变化，分别代表了本实验成功地检测出腰果、花生、小麦、大豆、鸡、鱼、虾、牛等8种食品过敏原成分。通过结果还可看出，芯片杂交反应后的芯片背景非常干净，没有发现能影响实验结果的背景污染，背景与杂交信号的反差异常明显，凭借肉眼可以轻易地区分杂交信号。本实验所采用的探针都能有效地与对应的过敏原PCR产物杂交，杂交信号明显，与实验的预期完全符合。在PCR产物特异性和探针特异性的双重保障下，8种食品过敏原都显示出较好的特异性，没有假阳性结果的出现。多组分食品过敏原的可视芯片特异性检测结果见图3。从图中可观察到，十字型图案的阳性对照位点的杂交信号非常清晰，目的探针位点的信号明显，可以与背景清晰地区分，而其他非目的探针位点则没有任何信号。芯片中特异性探针杂交位点的颜色变化，显示出可视芯片能够实现对多组分食品过敏原的特异性检测。从该实验结果还可得出，多重PCR扩增产物与芯片上目的探针的结合，与预期设想一致，杂交信号明显，未出现目的基因扩增产物和与特异性探针的杂交反应受到其他扩增产物或探针的干扰现象，这也保障了可视芯片高通量检测的准确性。图2单组分食品过敏原的芯片特异性实验结果1. 空白对照（ddH2O）；2. 腰果；3. 花生；4. 小麦；5. 大豆；6. 鸡；7. 鱼；8. 虾；9. 牛。图3多组分食品过敏原的芯片特异性实验结果1. 空白对照（ddH2O）；2. 腰果；3. 虾；4. 牛和虾；5. 牛、虾和鱼；6. 牛、虾、鱼和鸡；7. 大豆和腰果；8. 大豆、腰果和小麦；9. 大豆、腰果、小麦和花生。4.2.2 灵敏度由于各种食品过敏原所含有蛋白和脂类等物质组分不同，DNA提取、PCR扩增以及核酸杂交的效果也不尽相同，为验证芯片的检测灵敏度，本研究分别选用操作难度较大的腰果作为研究对象。（1）绝对灵敏度实验将提取的腰果DNA溶液用核酸蛋白分析仪测定浓度后，用灭菌水稀释成7个梯度。将腰果PCR扩增产物分别与芯片进行杂交反应，结果表现出与样品DNA浓度梯度相对应的变化，即特异性结合位点信号随DNA浓度的降低而不断变弱，颜色也依次由蓝色逐渐变为褐色。在腰果DNA浓度为0.01 pg/L时，特异性结合位点无杂交信号的产生；而在DNA浓度为0.1 pg/L时，芯片产生了较弱的杂交信号；而当DNA浓度大于100 pg/L时，芯片的杂交信号强度与阳性对照基本一致（图4）。芯片检测腰果的绝对灵敏度结果的检测限均可达到0.1 pg/L。（2）实际灵敏度实验将腰果样品加入到小麦粉中制成含有10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%和0.0001%（w/w）腰果成分的样品，采用CTAB方法提取样品DNA。将腰果PCR扩增产物分别与芯片进行杂交反应。图5显示，当腰果含量为0.0001%（w/w）时，芯片上的特异性结合位点无杂交信号的产生；而在腰果含量为0.001%（w/w）时，芯片仅产生微弱的杂交信号，芯片上杂交位点的颜色显示为褐色；而当腰果含量达到0.1%（w/w）时，即可产生与阳性对照强度相当的杂交信号，杂交位点的颜色也相应地增强为蓝色。芯片检测腰果的实际灵敏度结果的检测限均可达到0.001%（w/w）。由于检测技术以及引物和探针的差异性，芯片检测灵敏度与其他生物学检测技术相比提高了约10倍左右。图4 可视薄膜生物传感器芯片的绝对灵敏度检测结果1. 10 ng/L DNA；2. 1 ng/L DNA；3. 100 pg/L DNA；4. 10 pg/L DNA；5. 1 pg/L DNA；6. 0.1 pg/L DNA； 7. 0.01 pg/L DNA ； 8. 空白对照（ddH2O）。图5 可视薄膜生物传感器芯片的实际灵敏度检测结果1. 10% 腰果；2. 1% 腰果；3. 0.1% 腰果；4. 0.01% 腰果；5. 0.001% 腰果；6. 0.0001% 腰果；7. 空白对照（ddH2O）。4.2.3实际样品检测结果检测了从当地超市购买的含有、可能含有以及不含上述所有8种过敏原成分的11份样品。将扩增11种市售食品中大豆等8种食品过敏原成分的多重PCR扩增产物分别与芯片进行杂交反应。通过比对芯片检验结果与11种市售食品过敏原成分的标签标识后发现，芯片检测11种市售食品的结果与食品过敏原成分的标签标识相符合（图6）。图6 市售食品中大豆等8种过敏原成分的芯片检测结果1. 白巧克力草莓燕麦条（检出腰果、小麦和牛成分）；2. 香酥巧克力（检出小麦、大豆和牛成分）；3. 意大利面（检出小麦和牛成分）；4. 黑巧克力（检出大豆、鸡和牛成分）；5. 豆豉鲮鱼（检出小麦、大豆和鱼成分）；6. 芝麻菜香饼干（检出小麦成分）；7. 香脆燕麦饼干（检出小麦、大豆和牛成分）；8. 巧克力蛋卷（检出小麦、大豆、鸡和牛成分）；9. 全麦加钙营养饼（检出小麦、大豆和牛成分）；10. 榛子薄脆饼（检出小麦成分）；11. 棍形面包（检出小麦成分）；B. 空白对照（ddH2O）。4.2.4免疫学方法验证为了进一步验证芯片检测结果的准确性，采用市面上已有的食品过敏原ELISA试剂盒（ R-Biopharm和 Neogen公司）和过敏原腰果快速检测条（ R-Biopharm公司）分别对11种市售食品中食品过敏原成分进行检测。通过比对表2中芯片检测和免疫学检测结果可知，除去鱼因无商业化ELISA检测试剂盒未得到检测之外，两种方法在检测11种市售食品中其他过敏原成分时检测结果相同均呈阳性。由大量的实际应用结果可见，本实验建立的可视薄膜生物传感器芯片方法在食品过敏原成分高通量检测中具有较好的应用价值。5 验证情况（适用于方法类标准）5.1 验证单位情况验证单位验证人员验证时间首都师范大学白素兰2013年09月05日中国农业大学吴继红2013年09月03日山东出入境检验检疫局高宏伟2013年09月06日上海出入境检验检疫局李想2013年09月05日辽宁出入境检验检疫局郑秋月2013年09月03日5.2 验证过程上述五家验证单位按照本项目研制的8种过敏原成分特异性芯片检测方法，对其稳定性、灵敏度和特异性进行了验证。稳定性验证选取了8种过敏原成分各4份阳性样品进行3次重复试验；灵敏度验证选取了8种过敏原成分含量分别为2 %、0.5 %和0.1 %的样品进行2次重复试验；特异性验证选取了腰果、花生、小麦、大豆、鸡、虾、牛等样品进行2次重复试验；每个试验均设置阴、阳性和空白对照。5.3 验证数据分析验证结果显示，本项目研制的8种过敏原成分特异性芯片检测方法，定性检测低限为0.1 %，检测的稳定性达到100 %，特异性达到100 %。5.4 验证评价证试验表明，本项目研制的8种过敏原成分特异性芯片检测方法具有快速、简便、灵敏的特点，无需使用大型仪器设备，适用于食品中常见8种过敏原成分的快速筛查检测，适合在基层实验室推广应用。5.5 其他应说明的情况6 附加说明（可选项）6.1 宣贯标准的建议6.2 修订和废除现行有关标准的建议6.3 作为强制性标准或推荐性的建议6.4 其他需要说明的情况6.5 参考文献联系人陈颖联系电话[phone]电子邮箱yqychen注1：本模版表的共性部分为第1章、第2章、第4章和第6章。注2：3.4适用于标准草案送审稿，3.5适用于标准草案报批稿，3.6中预期的管理目标适用于规程类标准，3.6中技术指标适用于方法类标准，第5章适用于方法类标准编制说明的编写。注3：3.1和第6章为可选项，其余为必填项。编写日期：2012年06月20日