微生物工程模板.doc

资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。第二章 生产菌种的来源微生物工程的工业生产水平由三个要素决定, 即: 生产菌种的性能, 发酵及提纯工艺条件和生产设备。富集(enrichment)培养 : 是在目的微生物含量较少时, 根据微生物的生理特点, 设计一种选择性培养基, 创造有利的生长条件, 使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖, 数量增加, 由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种, 以利分离到所需的菌株。利用固体平板的生化反应进行分离方法: 1. 透明圈法在平板培养基中加入溶解性较差的底物, 使培养基混浊; 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈, 圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。分离水解酶产生菌时较多采用, 如蛋白酶、 淀粉酶、 脂肪酶、 核酸酶等。2、 变色圈法对于一些不易产生透明圈产物的产生菌, 可在底物平板中加入指示剂或显色剂, 使目的微生物菌落周围呈现变色圈, 从而能被快速鉴别出来; 3、 生长圈法将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养, 若某菌株能合成平板所需的营养物, 在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈一般见于分离筛选氨基酸、 核苷酸和维生素的产生菌; 工具菌( 指示菌) 是一些相对应的营养缺陷型菌株。4、 抑菌圈法常见于抗生素产生菌的分离筛选, 工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质, 如抗生素等, 便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。第三章 微生物的代谢调控与代谢工程组成酶 : 不依赖于酶底物或类似物的存在而合成的酶 如葡萄糖转化为丙酮酸过程中的各种酶诱导酶: 依赖于某种底物或底物的结构类似物的存在而合成的酶 如大肠杆菌乳糖利用酶葡萄糖效应:培养基中存在葡萄糖能够抑制其它糖的利用, 只有当葡萄糖利用完以后才开始利用其它的糖, 在利用其它糖时有一生长停滞期, 是利用第二种糖的酶合成的时期, 这种酶诱导的阻遏现象称为葡萄糖效应。( 培养基中存在葡萄糖反而抑制葡萄糖产量) 1、 同工酶( isoenzyme) 调节某一分支途径中的第一步反应可由多种酶催化, 但这些酶受不同的终产物的反馈调节. (酶的分子结构不同)2、 协同反馈调节需有一种以上终产物的过量存在方有明显的效果单个终产物过量, 不产生或只产生很小的影响3、 累加反馈调节每一种末端产物过量只能部分抑制或阻遏, 总的效果是累加的4、 增效反馈调节 代谢途径中任一末端产物过量时, 仅部分抑制共同反应中第一个酶的活性, 但两个末端产物同时过量时, 其抑制作用可超过各末端产物产生的抑制作用的总和。5、 顺序反馈调节 分支途径中几个末端产物抑制分支点后面第一个酶, 使分支点产物积累, 结果分支点产物又反馈抑制共同途径中的第一个酶, 最后使整个代谢途径停止。6、 联合激活或抑制调节 由一种生物合成的中间产物参与两个完全独立的、 不交叉的合成途径的控制。这种中间体物质浓度的变化会影响这两个独立代谢途径的代谢速率。代谢工程(Metabolic Engineering)利用生物学原理, 系统分析细胞代谢网络, 并经过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰, 进而完成细胞特性改造的应用性学科。代谢工程的基本过程 : 1) 靶点设计2) 基因操作 3) 效果分析第四章 菌种选育 菌种选育: 应用微生物遗传和变异理论, 用人工方法(或自然)造成变异, 再经过筛选以得到人们所需菌种的过程 。诱变育种: 就是人为地利用物理或化学等因素, 使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化, 引起突变, 并经过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。出发菌株的选择: 1) 选择对诱变剂敏感性强、 变异幅度大的菌株作为出发菌株。2) 最好选用已经过生产选育的自发突变菌株。3) 采用具有有利性状的菌株作为亲本, 如生长速度快, 营养要求低等。4) 由于有些菌株在发生某一变异后会对其它诱变因素的敏感性提高, 故有时可考虑选择已发生其它变异的菌株作为出发菌株。例如, 在金霉素生产菌的诱变中, 失去( 黄色) 色素的变异菌株作为出发菌株则产量会不断提高。诱变剂: 凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素, 统称诱变剂。一般采用生理状态一致的单细胞或单孢子悬液进行诱变处理的原因: 1.分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂。2.可避免长出不纯的菌落。第五章 菌种保藏的原理和方法美国的标准菌种保藏所( ATCC, American Type Culture Collection, Rockvill, Maryland, USA) 美国农业部农业研究服务部( ARS) 英国国立标准菌种保藏所( NCTC, National Collection of Type Culture) 。荷兰霉菌中心保藏所( CBS) 日本大阪发酵研究所中国科学院微生物研究所的普通微生物菌种保藏管理中心( CCGMC) 武汉大学的中国典型培养物保藏中心( CCTCC) 。 衰退( degeneration) : 在微生物的生长过程中, 由于变异的存在, 使原有的优良性状发生负变, 即菌种的衰退。复壮(rejuvenation): 狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下, 经过纯种分离和生产性能测定等方法, 从衰退的群体中找出未衰退的个体, 以达到恢复该菌原有典型性状的措施; 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、 进行纯种的分离和生产性能测定工作, 以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变( 正变) 不断地从生产中选种 真空冷冻干燥保藏法( 整个过程, 注意事项) 1.安瓿管的处理。安瓿管的内径一般为810mm, 长度不小于100mm。先用毛细管加入洗涤液浸泡过夜, 再用蒸馏水洗干净后烘干, 瓶口加棉花塞好, 并用纸包上, 121灭菌30min, 取出在60烘箱中干燥备用。2.保护剂。其作用是保持菌种细胞的生命状态, 尽量减少冷冻干燥时对微生物引起的冻结损伤。保护剂还能够起支持作用, 使微生物疏松地固定在上面。保护剂可采用低分子和高分子化合物, 如氨基酸、 有机酸、 糖类、 蛋白质、 多糖等。常见的有脱脂牛奶和血清。如马血清或马血清加入7.5%的葡萄糖。保护剂用之前采用适当的方法灭菌。 3.菌悬液制备。应该用最适的培养条件( 如培养基、 温度、 培养时间等) 培养菌种, 以获得良好的培养物用于长期保藏。培养时间应掌握在生长后期, 因为对数生长期的细胞对冷冻干燥的抵抗力较弱; 产孢子微生物须适当延长培养时间以期获得成熟的孢子。一般细菌培养2448h, 酵母72h, 放线菌和丝状真菌710d以上。操作时, 在无菌条件下先将水量保护剂加入斜面, 轻轻刮下菌苔或孢子, 制成菌悬液。用毛细滴管取0.10.2ml菌悬液加进灭好菌的安瓿管中, 塞好棉花塞。4.冷冻干燥。冷冻温度达-15-30即可。装入菌悬液的安瓿管应尽快冷冻, 以防菌体沉淀为不均匀的菌悬液以及微生物的再次生长或萌发孢子。达到冷冻温度后, 立即启动真空泵, 在15min内使真空度达到66.661Pa。真空度上升至13.3322Pa以上, 能够升高温度至2030。此时由于升华还在继续, 样品不会融化。干燥完毕后, 关闭真空泵, 排气, 取出安瓿管在多孔管道上再抽真空并封口。5.安瓿管的保藏有机氮源: 工业上常见的有机氮源都是一些廉价的原料, 花生饼 粉、 黄豆饼粉、 棉子饼粉、 玉米浆、 玉米蛋白粉、 蛋 白胨、 酵母粉、 鱼粉、 蚕蛹粉、 尿素、 废菌丝体和酒 糟。生理酸性物质: 无机氮源被菌体作为氮源利用后, 培养液中就留下了酸性或碱性物质, 这种经过微生物生理作用( 代谢) 后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质, 如硫酸铵等。生理碱性物质: 若菌体代谢后能产生碱性物质, 则此种无机氮源称为生理碱性物质, 如硝酸钠。前体指某些化合物加入到发酵培养基中, 能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去, 而其自身的结构并没有多大变化, 可是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。培养基的类型 孢子培养基 种子培养基 发酵培养基影响发酵温度的因素: 1) 菌种特性 2) 培养基 ( 成分及配比) 3) 发酵阶段4) 搅拌类型及搅拌速度5) 通气速度 ( 影响Q蒸发和Q显) 6) 罐内外的温差 引起发酵液中pH变化的因素: 发酵过程中pH的变化取决于微生物的种类、 培养基的组成和发酵条件。在菌体代谢过程中, 菌体本身有建成其生长最适pH的能力, 但外界条件发生较大变化时, pH将会不断波动。引起pH下降的因素: ( 凡是导致酸性物质生成或释放及碱性物质消耗的发酵, 其pH都会下降) 1) 培养基中碳氮比例不当, 碳源过多, 特别是葡萄糖过量, 或者中间补糖过多加之溶解氧不足, 致使有机酸大量积累而pH下降。2) 消泡油加得过多3) 生理酸性物质的存在, 氨被利用, pH下降引起pH上升的因素: ( 凡是导致碱性物质生成或释放及酸性物质消耗的发酵, 其pH都会下降) 1) 培养基中碳氮比例不当, 氮源过多, 氨基氮释放, 使pH上升。2) 生理碱性物质存在3) 中间补料中氨水或尿素等碱性物质的加入过多使pH上升。溶解氧( DO; Dissolved Oxygen)C* -与1个大气压空气相平衡的水中氧的饱和浓度, mol/m3摄氧率( OUR; Oxygen Utilization Ratio) - 单位时间内单位体积培养液中微生物摄取氧的量。记作 rO2 (mmol/Lh)比耗氧速率-相对于单位质量的干菌体在单位时间内所消耗的氧量。也称呼吸强度; 用QO2表示 (mmol O2 /g h)QO2随DO的增加而升高; 当DO增加 到一定值时, QO2不再增加临界溶氧浓度 -当不存在其它限制性基质时, 如果溶氧浓度高于某定值, 细胞的比耗氧速率保持恒定; 如果溶氧浓度低于该值, 细胞的比耗氧速率就会大大下降; 则该值即为临界溶氧浓度。DOcri在稳定情况下, 氧分子从气体主体扩散到液体主体的传递速率可表示为OTR = KL a ( C* CL )OTR 单位体积培养液中的氧传递速率, mol/(m3s) a 比表面积, m2/m3 KL 以氧浓度为推动力的传递系数, m/s牛顿型流体1) 服从牛顿黏性定律; 2) 剪应力与剪切速率之间呈直线关系; 直线的斜率即为黏度m ; 3) 黏度m 只是温度的函数, 与流变状态无关, 因此是一常数。拟塑性流体主要特征是黏度随着剪应速率的增高而降低流体的剪应力与剪切速率间不呈直线关系, 而呈凸形曲线关系, 表明剪切速率的增加, 剪应力的增加随之减小, 即增加流速会降低流体的粘性阻力。影响泡沫的因素1） 与通气量、 通气速度和搅拌速度等有关2） 与所用培养基的成分有关3） 与培养基的灭菌方法、 灭菌温度和时间有关发酵工业用的传感器应满足的要求1)传感器能经受高压蒸汽灭菌; 2)传感器及其二次仪表具有长期稳定性; 3)最好能在过程中随时校正; 4)探头材料不易老化, 使用寿命长; 5)探头安装使用和维修方便; 6)解决探头敏感部位被物料(反应液)粘住、 堵塞问题; 7)价格合理, 便于推广应用。PID控制当负荷不稳定时, 可采用比例( P) 、 积分( I) 、 微分( D) 控制算法, 即PID控制。P、 I、 D控制器的控制信号, 分别正比于被控过程的输出量与设定点的偏差、 偏差相对于时间的积分和偏差的变化速率。纯种发酵( 单菌或杂菌) : 菌种以外的微生物都被视为杂菌所谓染菌: 是指在发酵培养基中侵入了有碍生产的其它微生物。