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第二章 生产菌种的来源
微生物工程的工业生产水平由三个要素决定, 即: 生产菌种的性能, 发酵及提纯工艺条件和生产设备。

富集(enrichment)培养 : 是在目的微生物含量较少时, 根据微生物的生理特点, 设计一种选择性培养基, 创造有利的生长条件, 使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖, 数量增加, 由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种, 以利分离到所需的菌株。

利用固体平板的生化反应进行分离方法:
1. 透明圈法
在平板培养基中加入溶解性较差的底物, 使培养基混浊; 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈, 圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。
分离水解酶产生菌时较多采用, 如蛋白酶、 淀粉酶、 脂肪酶、 核酸酶等。
2、 变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌, 可在底物平板中加入指示剂或显色剂, 使目的微生物菌落周围呈现变色圈, 从而能被快速鉴别出来;
3、 生长圈法
将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养, 若某菌株能合成平板所需的营养物, 在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈
一般见于分离筛选氨基酸、 核苷酸和维生素的产生菌;
工具菌( 指示菌) 是一些相对应的营养缺陷型菌株。
4、 抑菌圈法
常见于抗生素产生菌的分离筛选, 工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质, 如抗生素等, 便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。

第三章 微生物的代谢调控与代谢工程
组成酶 : 不依赖于酶底物或类似物的存在而合成的酶
如葡萄糖转化为丙酮酸过程中的各种酶
诱导酶: 依赖于某种底物或底物的结构类似物的存在而合成的酶
如大肠杆菌乳糖利用酶

葡萄糖效应:培养基中存在葡萄糖能够抑制其它糖的利用, 只有当葡萄糖利用完以后才开始利用其它的糖, 在利用其它糖时有一生长停滞期, 是利用第二种糖的酶合成的时期, 这种酶诱导的阻遏现象称为葡萄糖效应。( 培养基中存在葡萄糖反而抑制葡萄糖产量)

1、 同工酶( isoenzyme) 调节
某一分支途径中的第一步反应可由多种酶催化, 但这些酶受不同的终产物的反馈调节. (酶的分子结构不同)
2、 协同反馈调节
需有一种以上终产物的过量存在方有明显的效果单个终产物过量, 不产生或只产生很小的影响
3、 累加反馈调节
每一种末端产物过量只能部分抑制或阻遏, 总的效果是累加的
4、 增效反馈调节
代谢途径中任一末端产物过量时, 仅部分抑制共同反应中第一个酶的活性, 但两个末端产物同时过量时, 其抑制作用可超过各末端产物产生的抑制作用的总和。
5、 顺序反馈调节
分支途径中几个末端产物抑制分支点后面第一个酶, 使分支点产物积累, 结果分支点产物又反馈抑制共同途径中的第一个酶, 最后使整个代谢途径停止。
6、 联合激活或抑制调节
由一种生物合成的中间产物参与两个完全独立的、 不交叉的合成途径的控制。这种中间体物质浓度的变化会影响这两个独立代谢途径的代谢速率。

代谢工程(Metabolic Engineering)——利用生物学原理, 系统分析细胞代谢网络, 并经过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰, 进而完成细胞特性改造的应用性学科。
代谢工程的基本过程 : 1) 靶点设计2) 基因操作 3) 效果分析

第四章 菌种选育

菌种选育: 应用微生物遗传和变异理论, 用人工方法(或自然)造成变异, 再经过筛选以得到人们所需菌种的过程 。
诱变育种: 就是人为地利用物理或化学等因素, 使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化, 引起突变, 并经过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。

出发菌株的选择:
1) 选择对诱变剂敏感性强、 变异幅度大的菌株作为出发菌株。
2) 最好选用已经过生产选育的自发突变菌株。
3) 采用具有有利性状的菌株作为亲本, 如生长速度快, 营养要求低等。4) 由于有些菌株在发生某一变异后会对其它诱变因素的敏感性提高, 故有时可考虑选择已发生其它变异的菌株作为出发菌株。例如, 在金霉素生产菌的诱变中, 失去( 黄色) 色素的变异菌株作为出发菌株则产量会不断提高。

诱变剂: 凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素, 统称诱变剂。
一般采用生理状态一致的单细胞或单孢子悬液进行诱变处理的原因: 1.分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂。2.可避免长出不纯的菌落。

第五章 菌种保藏的原理和方法
美国的标准菌种保藏所( ATCC, American Type Culture Collection, Rockvill, Maryland, USA)
美国农业部农业研究服务部( ARS)
英国国立标准菌种保藏所( NCTC, National Collection of Type Culture) 。
荷兰霉菌中心保藏所( CBS)
日本大阪发酵研究所
中国科学院微生物研究所的普通微生物菌种保藏管理中心( CCGMC)
武汉大学的中国典型培养物保藏中心( CCTCC) 。

衰退( degeneration) : 在微生物的生长过程中, 由于变异的存在, 使原有的优良性状发生负变, 即菌种的衰退。
复壮(rejuvenation): 狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下, 经过纯种分离和生产性能测定等方法, 从衰退的群体中找出未衰退的个体, 以达到恢复该菌原有典型性状的措施; 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、 进行纯种的分离和生产性能测定工作, 以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变( 正变) 不断地从生产中选种

真空冷冻干燥保藏法( 整个过程, 注意事项)
1.安瓿管的处理。安瓿管的内径一般为8～10mm, 长度不小于100mm。先用毛细管加入洗涤液浸泡过夜, 再用蒸馏水洗干净后烘干, 瓶口加棉花塞好, 并用纸包上, 121℃灭菌30min, 取出在60℃烘箱中干燥备用。
2.保护剂。其作用是保持菌种细胞的生命状态, 尽量减少冷冻干燥时对微生物引起的冻结损伤。保护剂还能够起支持作用, 使微生物疏松地固定在上面。保护剂可采用低分子和高分子化合物, 如氨基酸、 有机酸、 糖类、 蛋白质、 多糖等。常见的有脱脂牛奶和血清。如马血清或马血清加入7.5%的葡萄糖。保护剂用之前采用适当的方法灭菌。
3.菌悬液制备。应该用最适的培养条件( 如培养基、 温度、 培养时间等) 培养菌种, 以获得良好的培养物用于长期保藏。培养时间应掌握在生长后期, 因为对数生长期的细胞对冷冻干燥的抵抗力较弱; 产孢子微生物须适当延长培养时间以期获得成熟的孢子。一般细菌培养24～48h, 酵母72h, 放线菌和丝状真菌7～10d以上。操作时, 在无菌条件下先将水量保护剂加入斜面, 轻轻刮下菌苔或孢子, 制成菌悬液。用毛细滴管取0.1～0.2ml菌悬液加进灭好菌的安瓿管中, 塞好棉花塞。
4.冷冻干燥。冷冻温度达-15℃～-30℃即可。装入菌悬液的安瓿管应尽快冷冻, 以防菌体沉淀为不均匀的菌悬液以及微生物的再次生长或萌发孢子。达到冷冻温度后, 立即启动真空泵, 在15min内使真空度达到66.661Pa。真空度上升至13.3322Pa以上, 能够升高温度至20～30℃。此时由于升华还在继续, 样品不会融化。干燥完毕后, 关闭真空泵, 排气, 取出安瓿管在多孔管道上再抽真空并封口。
5.安瓿管的保藏
有机氮源: 工业上常见的有机氮源都是一些廉价的原料, 花生饼
粉、 黄豆饼粉、 棉子饼粉、 玉米浆、 玉米蛋白粉、 蛋
白胨、 酵母粉、 鱼粉、 蚕蛹粉、 尿素、 废菌丝体和酒
糟。
生理酸性物质: 无机氮源被菌体作为氮源利用后, 培养液中就留下了酸性或碱性物质, 这种经过微生物生理作用( 代谢) 后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质, 如硫酸铵等。
生理碱性物质: 若菌体代谢后能产生碱性物质, 则此种无机氮源称为生理碱性物质, 如硝酸钠。

前体指某些化合物加入到发酵培养基中, 能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去, 而其自身的结构并没有多大变化, 可是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。
培养基的类型 孢子培养基 种子培养基 发酵培养基
影响发酵温度的因素: 1) 菌种特性 2) 培养基 ( 成分及配比) 3) 发酵阶段4) 搅拌类型及搅拌速度5) 通气速度 ( 影响Q蒸发和Q显) 6) 罐内外的温差
引起发酵液中pH变化的因素: 发酵过程中pH的变化取决于微生物的种类、 培养基的组成和发酵条件。
在菌体代谢过程中, 菌体本身有建成其生长最适pH的能力, 但外界条件发生较大变化时, pH将会不断波动。
引起pH下降的因素:
( 凡是导致酸性物质生成或释放及碱性物质消耗的发酵, 其pH都会下降)
1) 培养基中碳氮比例不当, 碳源过多, 特别是葡萄糖过量, 或者中间补糖过多加之溶解氧不足, 致使有机酸大量积累而pH下降。
2) 消泡油加得过多
3) 生理酸性物质的存在, 氨被利用, pH下降
引起pH上升的因素:
( 凡是导致碱性物质生成或释放及酸性物质消耗的发酵, 其pH都会下降)
1) 培养基中碳氮比例不当, 氮源过多, 氨基氮释放, 使pH上升。
2) 生理碱性物质存在
3) 中间补料中氨水或尿素等碱性物质的加入过多使pH上升。

溶解氧( DO; Dissolved Oxygen)

C* ---与1个大气压空气相平衡的水中氧的饱和浓度, mol/m3
摄氧率( OUR; Oxygen Utilization Ratio)

------ 单位时间内单位体积培养液中微生物摄取氧的量。记作 rO2 (mmol/L·h)
比耗氧速率-----相对于单位质量的干菌体在单位时间内所消耗的氧量。也称呼吸强度; 用QO2表示 (mmol O2 /g ·h)

QO2随[DO]的增加而升高; 当[DO]增加
到一定值时, QO2不再增加

临界溶氧浓度
-----当不存在其它限制性基质时, 如果溶氧浓度高于某定值, 细胞的比耗氧速率保持恒定; 如果溶氧浓度低于该值, 细胞的比耗氧速率就会大大下降; 则该值即为临界溶氧浓度。[DO]cri

在稳定情况下, 氧分子从气体主体扩散到液体主体的传递速率可表示为
OTR = KL a ( C* －CL )
OTR — 单位体积培养液中的氧传递速率, mol/(m3·s)
a — 比表面积, m2/m3
KL —以氧浓度为推动力的传递系数, m/s
牛顿型流体
1) 服从牛顿黏性定律;
2) 剪应力与剪切速率之间呈直线关系; 直线的斜率即为黏度m ;
3) 黏度m 只是温度的函数, 与流变状态无关, 因此是一常数。

拟塑性流体
主要特征是黏度随着剪应速率的增高而降低
流体的剪应力与剪切速率间不呈直线关系, 而呈凸形曲线关系, 表明剪切速率的增加, 剪应力的增加随之减小, 即增加流速会降低流体的粘性阻力。
影响泡沫的因素
1） 与通气量、 通气速度和搅拌速度等有关
2） 与所用培养基的成分有关
3） 与培养基的灭菌方法、 灭菌温度和时间有关
发酵工业用的传感器应满足的要求
1)传感器能经受高压蒸汽灭菌;
2)传感器及其二次仪表具有长期稳定性;
3)最好能在过程中随时校正;
4)探头材料不易老化, 使用寿命长;
5)探头安装使用和维修方便;
6)解决探头敏感部位被物料(反应液)粘住、 堵塞问题;
7)价格合理, 便于推广应用。
PID控制
当负荷不稳定时, 可采用比例( P) 、 积分( I) 、 微分( D) 控制算法, 即PID控制。
P、 I、 D控制器的控制信号, 分别正比于被控过程的输出量与设定点的偏差、 偏差相对于时间的积分和偏差的变化速率。

纯种发酵( 单菌或杂菌) : 菌种以外的微生物都被视为杂菌
所谓染菌: 是指在发酵培养基中侵入了有碍生产的其它微生物。