人教版教学定稿动物细胞融合与单克隆抗体.pptx

如果将奶牛的细胞与植物细胞杂交，得到绿色的小奶牛，那岂不是只要晒晒太阳就可以挤出牛奶吗？动物细胞也能融合吗？一、动物细胞融合一、动物细胞融合 细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合两个细胞正在融合 受精作用受精作用 思考：思考：思考：思考：1 1、什么叫动物细胞融合？、什么叫动物细胞融合？、什么叫动物细胞融合？、什么叫动物细胞融合？2 2、促进细胞融合的、促进细胞融合的、促进细胞融合的、促进细胞融合的方法方法方法方法有哪些有哪些有哪些有哪些?3 3、细胞融合技术最大的、细胞融合技术最大的、细胞融合技术最大的、细胞融合技术最大的优点优点优点优点是什么？是什么？是什么？是什么？4 4、植物体细胞杂交与动物细胞融合、植物体细胞杂交与动物细胞融合、植物体细胞杂交与动物细胞融合、植物体细胞杂交与动物细胞融合 有哪些有哪些有哪些有哪些异同异同异同异同？物理法物理法物理法物理法化学法化学法化学法化学法生物法生物法生物法生物法电场法电场法电场法电场法(效率高、伤害小、易操作效率高、伤害小、易操作效率高、伤害小、易操作效率高、伤害小、易操作)（离心、振动、电刺激）（离心、振动、电刺激）（离心、振动、电刺激）（离心、振动、电刺激）聚乙二醇（聚乙二醇（聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）灭活的病毒灭活的病毒灭活的病毒灭活的病毒（灭活的仙台病毒）（灭活的仙台病毒）（灭活的仙台病毒）（灭活的仙台病毒）链接链接链接链接:病毒促融细胞病毒促融细胞病毒促融细胞病毒促融细胞灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞膜连接细胞融合，形成杂种细胞细胞融合，形成杂种细胞主要用于制备单克隆抗体获得杂种植株主要用途物理、化学方法（同左）灭活的病毒物理（离心、振动、电刺激）化学（聚乙二醇）诱导方法使细胞分散后诱导细胞融合去除细胞壁后诱导原生质体融合 细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞全能性细胞融合的原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较2.动物细胞融合的概念 动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程，融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞称为杂交细胞杂交细胞。提问？1.抗体是由何种细胞产生的？效应B细胞（浆细胞）。2.一个淋巴细胞(浆细胞)能分泌多种抗体吗？每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。3.一种抗原侵入机体之后，引起机体免疫反应产生的抗体只有一种吗？动物在免疫反应过程中，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上。4.简述获得抗体的传统途径？抗原 动物体 抗体 抗原不纯 抗体不纯二、单克隆抗体二、单克隆抗体刺激浆细胞6.如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？体外培养单个淋巴细胞，提取分泌的抗体7.体外培养淋巴细胞能无限增殖吗?怎样解决这个问题？5.这种方法获得的抗体有什么缺陷？产量低，纯度低，特异性差一个一个一个一个B B B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞只分泌一种特异性抗体只分泌一种特异性抗体只分泌一种特异性抗体只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖能无限增殖能无限增殖能无限增殖杂交瘤细胞杂交瘤细胞既能分泌一种特异性抗体既能分泌一种特异性抗体既能分泌一种特异性抗体既能分泌一种特异性抗体又能无限增殖又能无限增殖又能无限增殖又能无限增殖19751975年英国科学家年英国科学家年英国科学家年英国科学家米尔斯坦米尔斯坦米尔斯坦米尔斯坦和和和和柯勒柯勒柯勒柯勒设想：设想：设想：设想：B B淋巴细胞的淋巴细胞的特点：特点：B B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。生抗体。动物体内的动物体内的B B淋巴细胞可以产生百淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。具有特异性免疫作用。每一个每一个B B淋巴细胞只能产生一种特淋巴细胞只能产生一种特异性抗体。异性抗体。单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程专一专一抗体抗体检验检验阳性阳性单克隆抗体单克隆抗体 注射抗原注射抗原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合细胞融合杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔筛选筛选创始人：米尔斯坦创始人：米尔斯坦创始人：米尔斯坦创始人：米尔斯坦杂交杂交杂交杂交细胞细胞细胞细胞灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段灭活的病毒等手段小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞B B淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞淋巴细胞经免疫经免疫经免疫经免疫的小鼠的小鼠的小鼠的小鼠提取提取杂交瘤杂交瘤杂交瘤杂交瘤细胞细胞细胞细胞第一次筛选第一次筛选第一次筛选第一次筛选用特定的用特定的选选择性培养基择性培养基第二次筛选第二次筛选第二次筛选第二次筛选能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件能产生特定抗体、培养条件下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞下能无限增殖的杂交瘤细胞体外培养体外培养体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔提取单克隆抗体提取单克隆抗体提取单克隆抗体提取单克隆抗体整个制备过程为何要经过两次筛选整个制备过程为何要经过两次筛选?第一次筛选得到杂交瘤细胞（多种），第一次筛选得到杂交瘤细胞（多种），第二次需先在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤第二次需先在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始培养，然后再筛选出细胞的情况下开始培养，然后再筛选出能产生特异性能产生特异性抗体的细胞群。抗体的细胞群。由于该细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所由于该细胞群是单个杂交瘤细胞克隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强的单以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强的单克隆抗体。这里的克隆抗体。这里的单克隆单克隆确有确有单个细胞单个细胞克隆的含义，克隆的含义，只不过克隆的不是只不过克隆的不是B B淋巴细胞，而是淋巴细胞，而是杂交瘤细胞杂交瘤细胞。知识拓展：知识拓展：知识拓展：知识拓展：如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？融合后的细胞经融合后的细胞经融合后的细胞经融合后的细胞经选择性培养基选择性培养基选择性培养基选择性培养基培养后，培养后，培养后，培养后，能存活能存活能存活能存活的的的的细胞就是细胞就是细胞就是细胞就是杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能但这些杂交瘤细胞并非都是能但这些杂交瘤细胞并非都是能但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用分泌所需抗体的细胞，通常用分泌所需抗体的细胞，通常用分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法有限稀释法有限稀释法有限稀释法”来选择。来选择。来选择。来选择。将杂交瘤细胞稀释将杂交瘤细胞稀释将杂交瘤细胞稀释将杂交瘤细胞稀释，用，用，用，用多孔细胞培养板培养多孔细胞培养板培养多孔细胞培养板培养多孔细胞培养板培养，使每孔，使每孔，使每孔，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔检测各孔检测各孔检测各孔上清液中细胞分泌的抗体上清液中细胞分泌的抗体上清液中细胞分泌的抗体上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法）（常用酶联免疫吸附试验法）（常用酶联免疫吸附试验法）（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。，那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3 34 4次，次，次，次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。即为杂交瘤细胞的克隆化培养。即为杂交瘤细胞的克隆化培养。即为杂交瘤细胞的克隆化培养。植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合细胞融合原理细胞融合原理细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞融合的方法细胞融合的方法去除细胞壁后诱导去除细胞壁后诱导原生质体融合原生质体融合使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合诱导方法诱导方法物理（离心、振荡、物理（离心、振荡、电刺激）电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒用途用途获得杂种植株获得杂种植株制备单克隆抗体制备单克隆抗体思考：思考：1、本过程利用了哪些原理？、本过程利用了哪些原理？免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？细胞融合？这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体特异性强、纯度高、灵敏度高，特异性强、纯度高、灵敏度高，特异性强、纯度高、灵敏度高，特异性强、纯度高、灵敏度高，产量大、容易标准化生产。产量大、容易标准化生产。产量大、容易标准化生产。产量大、容易标准化生产。单克隆抗体的优点单克隆抗体的优点单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用vv、可用于作为诊断试剂：、可用于作为诊断试剂：、可用于作为诊断试剂：、可用于作为诊断试剂：vv 有准确，高效，简易、快速的优点有准确，高效，简易、快速的优点有准确，高效，简易、快速的优点有准确，高效，简易、快速的优点vv、可用于疾病治疗、可用于疾病治疗、可用于疾病治疗、可用于疾病治疗vv、可用于运载药物、可用于运载药物、可用于运载药物、可用于运载药物 （作为运载对应疾病的药物的（作为运载对应疾病的药物的（作为运载对应疾病的药物的（作为运载对应疾病的药物的“生物导弹生物导弹生物导弹生物导弹”。）。）。）。）“生物导弹生物导弹生物导弹生物导弹”单克隆抗体药物单克隆抗体药物单克隆抗体药物单克隆抗体药物知识结构两个过程动物细胞培养过程单克隆抗体制备过程三个“一”一个诱导细胞融合的新方法 灭活的病毒一个新细胞杂交瘤细胞一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势三.思考与探究1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？2.制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？提示：植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合。提示：哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的B淋巴细胞，B淋巴细胞 能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种B淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的B淋巴细胞大量增殖。B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。教学参考教学参考1.已成功的动物细胞融合实例还有哪些？生物种类 细胞来源 成功年代 酵母菌鸡 原生质体血红细胞 1975年人胡萝卜 腹水癌细胞原生质体 1976年人小鼠 纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞 1978年要知道更多的实例，需经常查阅更多科研报道。2.为什么不用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？就目前常用的细胞融合方法来看，不管是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含B淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。3.如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行34次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。n多孔细胞培养板