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乳双歧杆菌联合乳果糖对功能性便秘儿童的疗效及其对肠道菌群的影响分析张爱华代金明顾秀明严华杰曾春云董蔚基金项目:上海市嘉定区卫生健康委员会基金(编号:2019 KY 14)作者单位:201802上海嘉定上海市嘉定区南翔医院儿科通信作者:董蔚，dwzq1234567163 com 摘要 目的分析乳双歧杆菌联合乳果糖对功能性便秘儿童的疗效及其对肠道菌群的影响。方法选取 2019 年 10 月至 2022 年 1 月就诊于上海市嘉定区南翔医院儿科门诊的 61 例功能性便秘(FC)患儿为研究对象，采用随机数字表法分为干预组(31 例)和对照组(30 例)。干预组给予乳双歧杆菌 B6 12 联合乳果糖治疗，对照组仅给予乳果糖治疗。对比分析治疗前后患者的便秘症状是否改善，同时通过 16SrNA 测序结果分析两组治疗前后肠道菌群的改变。结果两组患儿治疗前资料差异均无统计学意义(P 0 05)，但治疗后干预组的治疗有效率大于对照组，差异有统计学意义(P 0 05);干预组治疗前后的菌群多样性的差异有统计学意义(P 0 05);干预组和对照组治疗前后的菌群相对丰度的差异有统计学意义(P 0 05)。结论乳双歧杆菌联合乳果糖治疗儿童 FC 的临床疗效优于常规单一乳果糖治疗，同时使用乳双歧杆菌联合乳果糖有利于儿童 FC 菌群多样性和相对丰度的恢复。关键词 16SrNA 测序;儿童功能性便秘;乳双歧杆菌;乳果糖doi:10.3969/j.issn.1000 0399.2023.03.011功能性便秘(functional constipation，FC)的发生与肠道微生态失衡密切相关。研究1 发现，和健康儿童相比，FC 患儿的肠道菌群多样性下降，菌群组成发生明显改变。正常肠道菌群通过代谢食物、产生气体、降低肠道 pH 值、调节肠道渗透压等方式影响肠道微生态，可促进肠道蠕动、影响肠道平滑肌收缩和增加肠内容物，从而降低 FC 的发生2。国内外多项临床研究3 8 发现，益生菌可明显改善儿童 FC 的临床症状，比如双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等。以往研究较多采用几种益生菌混合使用的方法，通过直接补充肠道有益菌，以达到恢复肠道微生态平衡，修复肠道菌膜屏障，提高肠道定植抗力，抑制条件致病菌的过度生长9。目前，研究微生物群落结构常用 16SrNA 测序方法(16SrNA 位于原核细胞核糖体小亚基上，长度约为1 540 bp)，通过比对细菌16SrNA 序列实现对细菌的物种鉴定10。同时通过分析测序数据获得样品中的各菌群的相对丰度，进行分类、菌群差异等分析11。本研究采用单一补充乳双歧杆菌的方法，探索其对 FC患儿的干预效果;同时使用 16SrNA 测序方法研究治疗前后的肠道菌群变化，旨在为临床治疗方案的改善提供科学依据。1资料与方法1 1一般资料本研究共纳入 61 例 FC 患儿，均在2019 年10 月至2022 年1 月就诊于上海市嘉定区南翔医院儿科门诊。研究采用随机数字表法将研究对象分为干预组(31 例)和对照组(30 例)。干预组中患儿年龄为 6 5 个月 6 岁，平均(2 82 1 65)岁，其中男性14 例，女性 17 例，病程为 2 30 个月，平均(10 58 13 34)月;对照组中患儿年龄 6 5 个月 5 岁 11 个月，平均(2 89 1 62)岁，其中男性 13 例，女性 17 例，病程 2 31 个月，平均(11 13 11 38)月。两组患儿年龄、性别和病程差异无统计学意义(P 0 05)。本研究经上海市嘉定区南翔医院医学伦理委员会批准(No 2019 12)。1 2纳入与排除标准纳入标准:符合罗马诊断标准12 的年龄 0 5 6 岁的 FC 患儿;无已知慢性病和其他消化道疾病;患儿家长同意，并签署知情同意书，并能配合完成治疗与记录。排除标准:患儿近 2周内或试验进行期间使用了抗生素;患儿近 2 周内服用过微生态制剂;胃肠道器质性疾病;未遵守协议或其他原因退出。1 3方法1 3 1治疗方法干预组给予乳双歧杆菌 B6 12892安徽医学第 44 卷第 3 期Anhui Medical Journal2023 年 3 月(科汉森公司，商品编号:100015917266，规格:每 6 滴含菌量10 亿 CFU)和乳果糖口服溶液(雅培公司，批准文号:H20171057，规格:667 mg/mL)联合治疗;对照组则给予乳果糖口服溶液治疗，两组患儿治疗时间均为 4周。治疗方案如下，对照组:口服乳果糖口服溶液，用量及用法为，1 岁，每次5 mL;1 3 岁，每次 75 mL;3 6 岁，每次 10 mL，每日 1 次，加入 20 mL 温开水稀释，早餐前半小时空腹口服。干预组:在乳果糖口服溶液治疗同时口服乳双歧杆菌 Bb 12，用量及用法为，1岁每次 6 滴，1 岁每次 12 滴，每日 1 次，早餐前口服(能配合的患儿，直接滴入口中喂服，不能配合的患儿，采用滴入小匙辅助喂服)。1 3 2随访指标采用随访表记录治疗期间服药情况、排便频率、大便性状、排便困难、排便伴有腹痛(患儿是否出现哭闹抗拒呼痛等症状)和大小便失禁等情况。采用视觉模拟评分法评估患儿排便恐惧度及家长治疗满意度13。1 4观察指标及疗效标准采用自拟儿童便秘症状自评量表评价两组患儿治疗前、治疗 4 周后的临床症状，量化评分包括排便频率、大便性状、排便困难情况、排便腹痛(家长反馈排便过程中是否存在呼痛及异常哭闹情况)和大小便失禁 5 个条目，分数越低表示症状改善效果越显著。疗效评估标准，有效:治疗后每周排便次数3 次，大便性状改变达到 Bristol 大便分类法14 中粪便类型中第 3 5 型标准;无效:经治疗后临床症状无明显改善，仍符合罗马诊断标准。1 516SrNA 分析菌群种类及结构1 5 1粪便采集两组患儿治疗前及治疗 4 周后来院进行粪便采集，各取约 2 g 的粪便标本置于无菌冻存管中，暂存于 4冰箱中，待当日所有样本取样完成后转移至 80冰箱保存。1 5 2样品 DNA 抽提使用 OMEGA Soil DNA Kit(M5635 02)分 别 提 取 两 组 患 儿 治 疗 前 后 的16SrNA 的基因片段，同时使用超微量分光光度计对DNA 进行定量检测。1 5 316S rNA 扩增子测序使用 TruSeq NanoDNA LT Library Prep Kit 对样本 16SrNA V3 V4 区进行文库构建(引物 338F:5 ACTCCTACGGGAG-GCAGCA 3，806:5 GGACTACHVGGGT WTCTAAT 3)。在 Illumina NovaSeq 机器上使用 No-vaSeq 6000 SP eagent Kit 进行2 250 bp 的双端测序。1 5 4数据处理和分析通过基因测序技术获取16SrNA 序列信息，再进行生物信息学分析，鉴定出样本中肠道菌群的种类，进而分析患儿治疗前后肠道菌群的种类变化。基于 DADA215 的 16S 扩增子分析流程对测序数据进行处理。经过拼接和去冗余得到100%一致性的分类操作单元(operational taxonomic u-nits，OTU)。将实验所得数据与 Silva 数据库(v138，https:/www arbsilva de/)进行比对获得菌群分类信息。根据 OTU 聚类结果，得到序列的菌群信息和菌群的丰度分布;同时可进行 Alpha 多样性、Beta 多样性和菌群分布等分析，而后根据两组菌群信息进行主坐标分析(PCoA 分析)。PCoA 分析方法可用来研究样本群落组成的相似性或相异性，使得数据投影的第一大方差在第一坐标，同时第二大方差在第二坐标上;一个坐标点代表一个菌群的相对丰度，曲线连接的两个点分别代表同一样本治疗前和后，曲线越长则说明差异越大16 17。香侬指数(Shannon)是基于样品的所有OUT 丰度和均匀度以及其物种的注释信息计算的，是度量物种 Alpha 多样性的指标之一，Shannon 指数越大说明样品中的菌群种类越丰富，多样性水平越高。1 6统计学方法使用 SPSS 22 0 进行统计分析，正态分布计量资料用 x s 表示，两组间均数比较采用独立样本 t 检验或配对 t 检验;计数资料以百分比表示，组间比较采用 2检验;组间样本菌群分布差异用 PE-MANOVA 分析;相对丰度比较应用 Wilcoxon 符号秩和检验。以 P 0 05 为差异有统计学意义。2结果2 1两组患儿治疗前后临床症状量化评分比较两组患儿治疗前临床症状量化评分差异无统计学意义(P 0 05);治疗 4 周后临床症状量化评分变化幅度，干预组大于对照组，差异有统计学意义(P 0 05)。见表 1。表 1两组患儿治疗前后临床症状量化评分比较(x s，分)组别例数治疗前治疗后差值干预组312239 411703 70415 35 736对照组302240 3761647 7 21593 567t 值001351675586P 值099000010001注:与治疗前比较，P 005。2 2两组患儿治疗有效率比较干预组有效率为83 9%(26/31)，对照组为 60 0%(18/30)，差异有统计学意义(2=4 322，P=0 036)。2 316SrNA 测序结果2 3 1治疗前后 Alpha 多样性比较干预组治疗前后的香侬指数分别为(3 847 0 719)、(3 582 992第 44 卷第 3 期安徽医学2023 年 3 月Anhui Medical Journal0 934)，对照组分别为(3 828 0 599)、(3 948 0 582)。应用配对 t 检验对干预组的 31 个样本治疗前后的 Shannon 指数进行检验，差异有统计学意义(t=2 339，P=0 026)，其中 23 组在乳双歧杆菌与乳果糖联用治疗后的菌群多样性均有降低;同样对照组的 30 个便秘患者治疗前后样本分析，差异均无统计学意义(t=0 774，P=0 445)。见图 1。应用独立样本的 t 检验分别对干预组和对照组治疗前后的 Shan-non 指数进行检验，两组检验结果显示均无统计学意义(t治疗前=0 054，P治疗前=0 957;t治疗后=1 842，P治疗后=0 071)。见图 2。注:A 为对照组，B 为干预组;横坐标中“0”和“28”分别代表第 0 天与第 28 天;ns 表示差异无统计学意义。图 1干预组与对照组患儿治疗前后 Shannon 指数比较注:A 为治疗前，B 为治疗后;A1 为干预组，A2 为对照组;ns 表示差异无统计学意义。图 2两组患儿治疗前后 Shannon 指数比较不同菌种相对丰度方面，应用 Wilcoxon 符号秩和检验分别对干预组和对照组治疗前后的黄杆菌科(fla-vobacteriaceae)、纱丽杆菌科(xanthobacteraceae)和罗丹诺杆菌科(rhodanobacteraceae)的相对丰度进行检验，结果显示对照组中 3 个菌种存在差异有统计学意义(VF=125，PF=0 003;V=9，P=0 007;VX=1，PX=0 001)，干预组中黄杆菌科(flavobacteriaceae)治疗前后差异有统计学意义(V=20，P=0 024)，见图3。同时，应用 Wilcoxon 符号秩和检验分别对治疗前后的干预组和对照组中 3 种菌群的相对丰度进行检验，结果显示，治疗前的黄杆菌科(flavobacteriaceae)在干预组和对照组间差异有统计学意义(W=280，P 0 001)，治疗后 3 种菌群在干预组和对照组间差异有统计学意义(WF=644 5，PF 0 001;W=304，P0 001;WX=1，PX0 001)。见图 4。注:A1 为干预组，A2 为对照组;横坐标中“0”和“28”分别代表第 0 天与第 28 天;ns 表示差异无统计学意义。图 3干预组与对照组患儿治疗前后菌群丰度比较注:A1 为干预组，A2 为对照组;“0”和“28”分别代表第 0天与第 28 天;ns 表示差异无统计学意义。图 4干预组与对照组患儿治疗前后菌群丰度比较2 3 2治疗前后 Beta 多样性比较PCoA 分析方法中曲线的长短和聚集程度显示部分人群肠道菌群稳定性较高，一部分人群在治疗前后差异很小，而另一部分人群则在治疗前后发生菌群结果的重大变化;应用PEMANOVA16 对干预组和对照组治疗前后的菌群相对丰度差异进行分析，发现差异有统计学意义(F=1 874，P=0 014)，且干预组(A1)在 PC1 轴上曲线变化幅度较大，见图 5。应用 PEMANOVA 检验方法对干预组治疗前后的菌群相对丰度差异进行分析，显示差异无统计学意义(F=0 569，P=0 948)，见图 6A。运用同样方法对对照组在治疗前后的菌群相对丰度进行分析，同样差异无统计学意义(F=0 531，P=0 976)。见图 6B。003张爱华等:乳双歧杆菌联合乳果糖对功能性便秘儿童的疗效及其对肠道菌群的影响分析第 44 卷第 3 期2023 年 3 月注:A1 为干预组，A2 为对照组。图 5干预组与对照组患儿治疗前后 Beta 多样性比较注:A 为干预组，B 为对照组。图 6干预组与对照组患儿治疗前后 Beta 多样性比较2 3 3菌群结构组成分析为分析各样本的菌群组成，选取平均相对丰度大于 1%的菌属作为代表菌属，分别构建每个患儿治疗前后的菌群结构，不同颜色代表不同菌属，面积大小代表在该样本中该菌属所占比例。由治疗前后的菌群结构分布可知，多数患者的菌群结构存在较大的改变。见图 7。注:A 为干预组，B 为对照组。图 7干预组与对照组患儿治疗前后菌群结构比较3讨论儿童 FC 的发生、发展与肠道菌群失调密切相关。乳双歧杆菌能够有效调节人体肠道菌群平衡，酸化肠道，提高肠道渗透性和刺激肠道蠕动19。本研究使用乳双歧杆菌联合乳果糖口服溶液的治疗方案可同时发挥益生菌和益生元的双重作用，既发挥了益生菌的生理活性，又可以选择性地刺激肠道内有益菌生长，改善FC 患儿肠道菌群结构，从而使便秘症状得以改善。通过对比乳双歧杆菌 B6 12 联合乳果糖口服溶液和乳果糖口服溶液两组治疗后的临床疗效，结果显示乳双歧杆菌联合乳果糖口服溶液干预组患儿的临床症状的改善程度优于对照组，临床总有效率显著提高(83 9%比 60%)。本研究通过将统计学数据与高通量实验数据联合分析的方式，对两组患儿治疗前后肠道菌群的多样性变化和肠道菌群结构进行分析。儿童 FC 可能会造成肠道菌群失调20，Alpha 多样性分析的结果显示，治疗前两组的菌群多样性没有差异，说明两组的可比性较好，组间的平衡性较好;治疗前后干预组的菌群多样性有所下降，差异具有统计学意义，说明在缓解症状的同时能改善肠道菌群结构，干预组多样性的降低可能是由于肠道菌群处于动态恢复期。通过分析各菌种的相对丰度发现:治疗后，两组的菌种相对丰度存在显著性差异。干预组治疗前后的黄杆菌科丰度有差异，对照组治疗前后的黄杆菌科、纱丽杆菌科以及罗丹诺杆菌的丰度均有显著性差异，其中黄杆菌科与纱丽杆菌科为条件致病菌，关于罗丹诺杆菌科的研究不多，说明通过乳双歧杆菌补充有益菌后，条件致病菌的生长受到抑制，肠道菌群的恢复更加有利21。Beta 多样性分析的结果显示，干预组和对照组治疗前后的菌群结构的差异具有统计学意义。菌群结构分析结果显示，多数样本在治疗前后菌群的变化很大，与 Beta 多样性分析的结果一致。乳双歧杆菌与乳果糖联用有利于促进肠道菌群恢复，进而可以改善患儿便秘情况。16SrNA 常用于微生物检测和分类鉴定，同时具有保守性和变异性，仅存在于细菌染色体基因组中，不存在于病毒、真菌等非原核细胞生物体中;16SrNA 基因序列分析技术具有高灵敏度和特异性的特点22。本研究应用 16SrNA 基因序列分析技术对肠道菌群进行聚类分析，将临床疗效与基因数据分析结果联合分析，进一步了解肠道菌群对疾病发生发展的影响。综合已有研究结果和本研究数据表明乳双歧杆菌和乳果糖口服溶液联用有望为儿童 FC 的治疗提供更多选择。由于本次研究样本量偏小，治疗观察周期仅4 周，未能对该方案长期使用效果进行评估。长期治疗效果及其肠道菌群的改变有待于进一步探索。参考文献 1 DE MEIJ T G，DE GOOT E F，ECK A，et al Character-ization ofmicrobiota in children with chronic functional con-stipation J PLoS One，2016，11(10):e0164731 2 TIAN Y，ZUO L，GUO Q，et al Potential role of fecal mi-crobiota in patients with constipationJ/OL Therap AdvGastroenterol(2020 10 31)2022 05 14 https:/journals sagepub com/doi/10 1177/1756284820968423103第 44 卷第 3 期安徽医学2023 年 3 月Anhui Medical Journal 3 BANASZKIEWICZ A，SZAJEWSKA H Ineffectiveness of Lac-tobacillus GG as an adjunct to lactulose for the treatment ofconstipation in children:a double blind，placebo controlledrandomized trial J J Pediatr，2005，146(3):364 369 4 BU L N，CHANG M H，NI Y H，et al Lactobacillus caseirhamnosus Lcr35 in children with chronic constipationJ Pediatr Int，2007，49(4):485 490 5KHODADAD A，SABBAGHIAN M ole of synbiotics inthe treatment of childhood constipation:a double blind ran-domized placebo controlled trial J Iran J Pediatr，2010，20(4):387 392 6 TABBES M M，CHMIELEWSKA A，OSEBOOM M G，etal Fermented milk containing Bifidobacterium lactis DN 173010 in childhood constipation:a randomized，double blind，controlled trial J Pediatrics，2011，127(6):e1392 1399 7 SANEIAN H，TAVAKKOL K，ADHAMIAN P，et al Com-parison of Lactobacillus Sporogenes plus mineral oil and min-eral oil alone in the treatment of childhood functional consti-pation J es Med Sci，2013，18(2):85 88 8SADEGHZADEH M，ABIEEFA A，KHOSHNEVISASLP，et al The effect of probiotics on childhood constipation:a randomized controlled double blind clinical trialJ/OL Int J Pediatr(2014 04 09)2022 05 16 https:/www hindawi com/journals/ijpedi/2014/937212/DOI:10 1155/2014/937212 9 SANCHEZ B，DELGADO S，BLANCO MIGUEZ A，et alProbiotics，gut microbiota，and their influence on host healthand disease J/OL Mol Nutr Food es，2017，61(1):1600240(2016 10 10)2022 05 17 https:/on-linelibrary wiley com/doi/10 1002/mnfr 201600240 10 马超，贺毅，孙作厘，等 基于 16SrNA 技术分析石珍安神汤对脱髓鞘小鼠肠道菌群多样性的影响 J 首都医科大学学报，2020，41(1):64 70 11 CAPOASO J G，KUCZYNSKI J，STOMBAUGH J，et alQIIME allows analysis of high throughput community se-quencing data J Nature Methods，2010，7(5):335 336 12 MAC A B，SAMUEL N，CHISTOPHE F，et al 儿童功能性胃肠病罗马标准J 中华儿科杂志，2017，55(1):4 14 13 WEGH CAIE A M，HEMES GEBEN D A，SCHOTE-MAN MAGIET H C，et al The Modified Bristol StoolForm Scale:a reliable and valid tool to score stool consisten-cy in dutch(non)toilet trained toddlersJ J PediatrGastroenterol Nutrit，2021，73(2):210 216 14 LANE M M，CZYZEWSKI D I，CHUMPITAZI B P，et aleliability and validity of a modified bristol stool form scalefor children J J Pediatr，2011，159(3):437 441 15 CALLAHAN B J，MC MUDIE P J，OSEN M J，et alDADA2:high resolution sample inference from Illuminaamplicon data J Nat Methods，2016，13(7):581 583 16 YANG Z，GUO，XU X，et al Enhanced methane pro-duction via repeated batch bioaugmentation pattern of en-riched microbial consortiaJ Bioresour Technol，2016，216:471 477 17 CHECINSKA A，POBST A J，VAISHAMPAYAN P，et alMicrobiomes of the dust particles collected from the interna-tional space station and spacecraft assembly facilitiesJ Microbiome，2015，3:50 18 KELLY B J，GOSS，BITTINGE K，et al Power andsample size estimation for microbiome studies using pair-wise distances and PEMANOVA J Bioinformatics，2015，31(15):2461 2468 19 BA Z Y，LEE Y J，MENG H C，et al Effects on the deliv-ery efficacy of bifidobacterium animalis subsp lactis BB 12on fecal microbiota，gut transit time，and short chain fattyacids in healthy young adults J mSphere，2021，6(4):e0008421 20 王放，薛今俊 儿童功能性便秘不同严重程度肠道菌群特点及胃肠激素水平变化J 中国现代医生，2022，60(11):73 75，94 21 郭增，刘春强，黄业保，等 功能性便秘与肠道菌群的关系及相关治疗的研究进展J 湖南中医杂志，2021，37(10):210 212 22 徐爱蕾，黄毅，王为 16SrNA 基因序列分析技术在肠道菌群检测中的应用进展J 临床消化病杂志，2015，27(3):186 189(2022 09 01 收稿)(本文编校:张迪，崔月婷)203张爱华等:乳双歧杆菌联合乳果糖对功能性便秘儿童的疗效及其对肠道菌群的影响分析第 44 卷第 3 期2023 年 3 月