第三章细胞破碎..ppt

第三章第三章细细 胞胞 破破 碎碎1第一页，共七十四页。生物分离过程生物分离过程(guchng)(guchng)的一般的一般流程流程本章(bn zhn)内容2第二页，共七十四页。常见(chn jin)的细胞壁结构细胞破碎(p su)技术包涵体的纯化(chn hu)方法本章的主要内容3第三页，共七十四页。概述概述(i sh)不同类型的细胞分泌目标产物的类型：不同类型的细胞分泌目标产物的类型：n动物细胞多分泌到细胞外培养液动物细胞多分泌到细胞外培养液n植物细胞多为胞内产物植物细胞多为胞内产物n微生物（细菌微生物（细菌/酵母酵母/真菌）胞内、胞外真菌）胞内、胞外 对于对于(duy)胞内产物需要收集菌体或细胞进胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。行破碎。4第四页，共七十四页。概述概述(i sh)(大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。氨基酸等目标产物存在于发酵液中。(有些目标产物存在于生物体中。有些目标产物存在于生物体中。l尤尤其其是是由由基基因因工工程程菌菌产产生生(chnshng)的的大大多多数数蛋蛋白质是在细胞内沉积。白质是在细胞内沉积。l脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。5第五页，共七十四页。概概 述述细胞破碎（细胞破碎（cell rupturecell rupture）技术是指利用外力破坏）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。型生化物质（产品）的基础。为了为了(wi le)(wi le)研究细胞破碎，提高其破碎率，有必研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。6第六页，共七十四页。3.1 3.1 细胞壁结构细胞壁结构(jigu)(jigu)对破碎的影响对破碎的影响Z微生物细胞和植物微生物细胞和植物(zhw)(zhw)细胞外层均为细胞壁，细胞壁里细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。Z通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。Z不不同同细细胞胞壁壁的的结结构构和和组组成成不不完完全全相相同同，故故细细胞胞壁壁的的机机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。7第七页，共七十四页。细菌细菌(xjn)(xjn)细胞壁结细胞壁结构构Z几几乎乎所所有有细细菌菌(xjn)(xjn)的的细细胞胞壁壁都都是是由由肽肽聚聚糖糖组组成成，它它是是难难溶溶性性的的聚糖链；聚糖链；Z相相邻邻聚聚糖糖链链上上的的短短肽肽又又交交叉叉相相联联，构构成成了了细细胞胞壁壁的的三三维维网网状状结结构构，包围在细胞周围；包围在细胞周围；Z使细胞具有一定的形状和强度。使细胞具有一定的形状和强度。8第八页，共七十四页。细菌细菌(xjn)(xjn)细胞壁细胞壁结构结构u破碎细菌的主要阻力是来自于破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。的肽键的数量和其交联的程度。u革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。不同。u革革兰兰氏氏阴阴性性(ynxng)(ynxng)菌菌典典型型的的生生物物是是大大肠肠杆杆菌菌，通通过过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。这种细胞生产了很多细胞重组的产物。药物名称药物名称宿主宿主用途用途胰岛素胰岛素大肠杆菌大肠杆菌治疗糖尿病治疗糖尿病人生长激素人生长激素大肠杆菌大肠杆菌治疗侏儒病治疗侏儒病-干扰素干扰素大肠杆菌大肠杆菌治疗毛状细胞白血病等治疗毛状细胞白血病等9第九页，共七十四页。u最最里里层层是是由由葡葡聚聚糖糖的的细细纤纤维维组组成成，它它构构成成(guchng)(guchng)了了细细胞胞壁壁的的刚刚性性骨骨架架，使使细细胞胞具具有有一一定定的的形形状，状，u上面的是一层糖蛋白，上面的是一层糖蛋白，u最最外外层层是是甘甘露露聚聚糖糖，由由1,6-1,6-磷磷酸酸二二酯酯键键连连接接成成网网状状。在在该该层层的的内内部，有甘露聚糖部，有甘露聚糖-酶的复合物。酶的复合物。u破破碎碎酵酵母母细细胞胞壁壁的的阻阻力力主主要要决决定定于于壁壁结结构构交交联联的的紧紧密密程程度度和和它它的厚度。的厚度。10第十页，共七十四页。真菌真菌(zhnjn)(zhnjn)的细胞的细胞壁壁l真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。较少量的蛋白质和脂类。l不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成(guchng)，少数含纤维素。，少数含纤维素。l与与酵酵母母和和细细菌菌的的细细胞胞壁壁一一样样，真真菌菌细细胞胞壁壁的的强强度度和和聚聚合合物物的的网网状状结结构构有有关关，不不仅仅如如此此，它它还还含含有有几几丁丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。11第十一页，共七十四页。l红红面面包包霉霉菌菌细细胞胞壁壁具具有有同同心心圆圆层层状状结结构主要存在三种构主要存在三种(sn zhn)(sn zhn)聚合物聚合物l最最外外层层(a)(a)是是-和和-葡葡聚聚糖糖的的混混合物，合物，l第第2 2层层(b)(b)是糖蛋白的网状结构是糖蛋白的网状结构l第第3 3层层(c)(c)主要是蛋白质，主要是蛋白质，l最内层最内层(d)(d)主要是几丁质。主要是几丁质。红面包霉菌红面包霉菌(mjn)细胞壁的结构示意细胞壁的结构示意图图12第十二页，共七十四页。微生微生物物革兰氏革兰氏阳性细菌阳性细菌革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖(5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30-40%)(30-40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%)脂类脂类(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂类脂类蛋白质蛋白质细胞壁的组成细胞壁的组成(z chn)和结构和结构微生微生物物革兰氏革兰氏阳性细菌阳性细菌革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌酵母菌酵母菌真菌真菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖(5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30-40%)(30-40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%)脂类脂类(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂类脂类蛋白质蛋白质细胞壁的组成细胞壁的组成(z chn)和结构和结构13第十三页，共七十四页。植物植物(zhw)(zhw)细胞壁的结构细胞壁的结构l对对于于已已生生长长结结束束的的植植物物细细胞胞壁壁可可分分为为初初生生壁壁和和次次生生壁壁两两部分。部分。l初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（1 13m3m），），富有弹性。富有弹性。l由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半纤维由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链素和果胶类物质。纤维素是长链D-D-葡聚糖，许多这样的葡聚糖，许多这样的长链形成微纤丝。长链形成微纤丝。l它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械(jxi)(jxi)强度主要强度主要来自于微纤丝。来自于微纤丝。14第十四页，共七十四页。植物植物(zhw)(zhw)次生细胞壁次生细胞壁 某某些些植植物物细细胞胞，当当生生长长停停止止后后，在在细细胞胞质质和和初初生生细细胞胞壁壁之之间间形形成成了了次次生生细细胞胞壁壁。次次生生壁壁一一般般(ybn)(ybn)较较厚厚(4m(4m以上以上)，常有三层组成。，常有三层组成。n在在次次生生壁壁中中，纤纤维维素素和和半半纤纤维维素素含含量量比比初初生生壁壁增增加加很很多多，纤纤维维素素的的微微纤纤丝丝排排列列得得更更紧紧密密和和有有规规则则，而而且且存存在在木木质质素素的沉积。的沉积。因因此此次次生生壁壁的的形形成成提提高高了了细细胞胞壁壁的的坚坚硬硬性性，使使植物细胞具有很高的机械强度。植物细胞具有很高的机械强度。15第十五页，共七十四页。研研 磨磨3.2 3.2 细胞破碎细胞破碎(p su)(p su)技术技术16第十六页，共七十四页。机械机械(jxi)破碎破碎捣碎(do su)法研磨法匀浆法超声法 物理物理(wl)破碎破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎化学破碎有机溶剂：表面活性剂：酸碱酶促破碎酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎受到破坏，而达到细胞破碎细细胞破碎方法及其原理胞破碎方法及其原理17第十七页，共七十四页。一机械(jxi)法机械破碎法又可分为机械破碎法又可分为高压匀浆高压匀浆(yn jin)(yn jin)破碎法破碎法（homogenizationhomogenization）高速珠研磨破碎法（高速珠研磨破碎法（bead grindingbead grinding）超声波破碎法（超声波破碎法（ultrasonicationultrasonication）18第十八页，共七十四页。采用高压采用高压(goy)匀浆器（由高压匀浆器（由高压(goy)泵和匀浆阀组成）。泵和匀浆阀组成）。1.高压高压(goy)匀浆法匀浆法（High-pressure homogenization）细胞悬浮液自高压室针形细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口被迫改变方向从出口(ch ku)管流出。细胞在这一管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历系列高速运动过程中经历了高速剪切、碰撞及压力了高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细胞破碎。骤降，造成细胞破碎。19第十九页，共七十四页。20第二十页，共七十四页。高压高压(goy)(goy)匀浆器的种类匀浆器的种类高压匀浆器的种类高压匀浆器的种类(zhngli)(zhngli)较多较多：pWABWAB公司的公司的AVP Gaulin 31MRAVP Gaulin 31MR型型pBran and luebbe Bran and luebbe 公司公司SHL40SHL40型型p意大利意大利Niro SoaviNiro Soavi高压高压(goy)匀浆机匀浆机21第二十一页，共七十四页。高压匀浆高压匀浆(yn jin)(yn jin)法使用时注意事项法使用时注意事项u高压匀浆器的操作温度上升约高压匀浆器的操作温度上升约-/10MPa/10MPa为了控制为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在度调节在2020左右。左右。u可可以以(ky)(ky)采采用用单单次次通通过过匀匀浆浆器器或或多多次次循循环环通通过过等等方方式。式。u在在工工业业规规模模的的细细胞胞破破碎碎中中，对对于于酵酵母母等等难难破破碎碎的的及及浓浓度度高高或或处处于于生生长长静静止止期期的的细细胞胞，常常采采用用多多次次循循环环的的操操作方法。作方法。22第二十二页，共七十四页。高压匀浆法适用高压匀浆法适用(shyng)(shyng)的范的范围围大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法(fngf)高压匀浆法适用的范围：高压匀浆法适用的范围：n酵母和大多数细菌细胞的破碎；酵母和大多数细菌细胞的破碎；n料液细胞浓度可以很高，料液细胞浓度可以很高，20%20%左右。左右。不宜使用高压匀浆法。不宜使用高压匀浆法。易造成堵塞的团状或丝状真菌，易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包涵体的基因工程菌（因包涵体坚硬，易损伤匀浆含有包涵体的基因工程菌（因包涵体坚硬，易损伤匀浆阀）阀）23第二十三页，共七十四页。l升高压力有利于破碎，升高压力有利于破碎，减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。在工业生产中，通常采用的压力为在工业生产中，通常采用的压力为555570Mpa70Mpa。l破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同大肠杆菌的细胞比酵母大肠杆菌的细胞比酵母(jiom)(jiom)细胞容易破碎，细胞容易破碎，生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。破碎。影响高压匀浆器细胞影响高压匀浆器细胞(xbo)破碎因素破碎因素24第二十四页，共七十四页。高压匀浆高压匀浆(yn jin)(yn jin)法法-X-X-挤压器挤压器l改进的高压方法：将浓缩的菌体悬液冷却至改进的高压方法：将浓缩的菌体悬液冷却至-25-25至至-30-30形成冰晶体，利用形成冰晶体，利用500MPa500MPa以上的高压冲击，冷以上的高压冲击，冷冻冻(lngdng)(lngdng)细胞从高压阀小孔中挤出。细胞从高压阀小孔中挤出。l细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋在冰中细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋在冰中的细胞变形所引起的。的细胞变形所引起的。l主要用于实验室中。主要用于实验室中。l优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高程度低以及活性的保留率高l对冷冻一融解敏感的生化物质不适用。对冷冻一融解敏感的生化物质不适用。25第二十五页，共七十四页。2）珠磨法 bead millu珠磨是常用的方法u细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于径小于1mm1mm）一起快速搅拌或研）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。碎，释放出内含物。u在工业规模的破碎中，常采用在工业规模的破碎中，常采用(ciyng)(ciyng)高速珠磨机高速珠磨机WSK卧式高效(o xio)全能珠磨机26第二十六页，共七十四页。高速珠磨机(m j)工作原理l磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；l细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料(mlio)(mlio)滚动引起滚动引起l在出口处，旋转园盘和出口平在出口处，旋转园盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻挡玻板之间的狭缝很小，可阻挡玻璃小珠，使不被料液带出。璃小珠，使不被料液带出。l由于操作过程中会产生热量，由于操作过程中会产生热量，故磨室还装有冷却夹套，以冷故磨室还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。却细胞悬浮液和玻离小珠。27第二十七页，共七十四页。Netzsch LM-20型珠磨机(m j)A-具有冷却夹套的圆筒形磨室B-具有冷却装置的搅拌轴和圆盘C-环形(hun xn)震动侠缝分离器D-变速马达1和2料液进出口3和4 搅拌冷却剂进出口5和6磨室冷却剂进出口l园盘以两种位置交错地安装在轴上，l一种处于径向(jn xin)，一种与轴倾斜，l径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘则产生轴向运动。l由于交错的运动，提高了破碎效率。28第二十八页，共七十四页。3）超声波破碎(p su)l超声波破碎法（超声波破碎法（Ultrasonication)Ultrasonication)利用超声波振荡器利用超声波振荡器发射的发射的15-25kHz15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。的超声波探头处理细胞悬浮液。l超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。种型式，一般破碎效果后者比前者好。l超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度(nngd)(nngd)和和超声波的声频、声能有关。超声波的声频、声能有关。29第二十九页，共七十四页。超声波破碎(p su)的机理JY92-II D超声波超声波细胞胞(xbo)粉碎机粉碎机(一般认为在超声波作用下液体发生空化作用一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation),cavitation),(液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而(cng(cng r)r)使细胞破碎。使细胞破碎。(操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。冷却的容器中进行。30第三十页，共七十四页。超声波破碎(p su)的适用范围超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，一般杆菌比球菌易破碎，G-G-细菌比细菌比G+G+细菌易破碎，细菌易破碎，对酵母菌的效果对酵母菌的效果(xiogu)(xiogu)较差。较差。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。性物质失活。超声波破碎的有效能量利用率极低超声波破碎的有效能量利用率极低由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用在实验室小规模细胞破碎中常用在实验室小规模细胞破碎中常用在实验室小规模细胞破碎中常用。31第三十一页，共七十四页。技术技术原理原理效果效果 成本成本举例举例匀浆法匀浆法(孔型孔型)须使细胞通过的小须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪孔，使细胞受到剪切力而破碎切力而破碎剧烈剧烈 适中适中细胞悬浮液大规模细胞悬浮液大规模处理处理珠磨破碎珠磨破碎法法细胞被玻璃珠或铁细胞被玻璃珠或铁珠捣碎珠捣碎剧烈剧烈 便宜便宜细胞悬浮液和植物细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理细胞的大规模处理超声波法超声波法用超声波的空穴作用超声波的空穴作用使细胞破碎用使细胞破碎适中适中 昂贵昂贵细胞悬浮液小规模细胞悬浮液小规模处理处理研磨法研磨法细胞被研磨物磨碎细胞被研磨物磨碎适中适中 便宜便宜匀浆法匀浆法(片型片型)细胞被搅拌器劈碎细胞被搅拌器劈碎适中适中 适中适中动物组织及动物细动物组织及动物细胞胞不同(b tn)机械破碎方法的比较32第三十二页，共七十四页。非机械破碎非机械破碎(p su)(p su)方法方法酶溶破碎法（酶溶破碎法（enzyme lysisenzyme lysis）化学化学(huxu)(huxu)破碎法（破碎法（chemical treatmentchemical treatment）去垢剂破碎法（去垢剂破碎法（detergentsdetergents）渗透压冲击破碎法（渗透压冲击破碎法（osmotic shockosmotic shock）冻融破碎法（冻融破碎法（freezing and thawingfreezing and thawing）33第三十三页，共七十四页。二二 非机械非机械(jxi)(jxi)法法非机械方法很多1 酶解2 化学法溶胞3 物理法n渗透压冲击n冻结和融化n干燥(gnzo)法其中酶法和化学法溶胞应用最广。二34第三十四页，共七十四页。1 酶解（酶溶法 Enymatic lysis)酶解是利用溶解细胞壁的酶处理(chl)菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。1）外加酶法常用的溶酶常用的溶酶溶菌酶、溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、蛋白酶、甘露糖酶、甘露糖酶、糖苷酶、糖苷酶、肽键内切酶、肽键内切酶、壳多糖酶等壳多糖酶等35第三十五页，共七十四页。外加(wiji)酶法n酶解法的特点酶解法的特点(tdin)(tdin)是专一性强，因此在选择酶系统时，必是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。须根据细胞的结构和化学组成来选择。n溶菌酶（溶菌酶（lysozyme)lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的-1,4-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂剂EDTAEDTA一起使用。一起使用。n放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，分，所以也能采用溶菌酶，n酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。n植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。裂解。36第三十六页，共七十四页。外加(wiji)酶法有时有时(yush)(yush)采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。时需确定相应的次序。对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。37第三十七页，共七十四页。酶解法(ji f)的特点 优点：n发生酶解的条件温和(wnh)n能选择性地释放产物n胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整缺点：缺点：溶酶价格高，溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶)产物抑制产物抑制(yzh)(yzh)的存在。的存在。38第三十八页，共七十四页。酶解-自溶作用(zuyng)l 自溶作用是酶解的另一种方法，自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自身产利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。l在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。l自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲液），自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。以达到自溶目的。l缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大液粘度增大(zn d)，过滤速度下降。，过滤速度下降。39第三十九页，共七十四页。某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透(shntu)性），从而使胞内物质有选择地渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透(shntu)出来。出来。2 化学化学(huxu)渗透法渗透法（Chemical permeation）该法取决于化学试剂的类型以及该法取决于化学试剂的类型以及(yj)细胞壁膜的结构与组成。细胞壁膜的结构与组成。40第四十页，共七十四页。n酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。n碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。成本低，反应激烈成本低，反应激烈(jli)(jli)，不具选择性。，不具选择性。（1）酸、碱处理）酸、碱处理(chl)法法41第四十一页，共七十四页。细胞破碎常用的表面活性剂：细胞破碎常用的表面活性剂：十二烷基十二烷基(wn j)(wn j)硫酸钠（硫酸钠（SDSSDS，阴离子型）；。，阴离子型）；。非离子型如非离子型如Triton X-100Triton X-100和吐温（和吐温（TweenTween）等）等对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。（2 2）表面）表面(biomin)(biomin)活性剂活性剂无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性是两性(lingxng)的，既能和水作用也能和脂作用，的，既能和水作用也能和脂作用，能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解增加或溶解42第四十二页，共七十四页。能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质(wzh)(wzh)被释放出来。被释放出来。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 （3 3）有机溶剂）有机溶剂（4 4）EDTAEDTA螯合剂螯合剂处理处理G-G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用。细菌，对细胞壁外层有破坏作用。G-G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子CaCa2+2+或或MgMg2+2+结合脂多糖和蛋白结合脂多糖和蛋白质来维持质来维持(wich)(wich)，一旦，一旦EDTAEDTA将将CaCa2+2+或或MgMg2+2+螯合，大量的脂多糖分子将螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。43第四十三页，共七十四页。u通用性差；通用性差；u时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%50%；u有些化学试剂有毒。有些化学试剂有毒。u化学试剂的加入常会给随后化学试剂的加入常会给随后(suhu)(suhu)产物的纯化带来困难，产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度并影响最终产物纯度化学化学(huxu)渗透法特点：渗透法特点：缺点缺点(qudin)l对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；滞留在胞内；l细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。进一步提取。优点优点44第四十四页，共七十四页。3 3 物理物理(wl)(wl)法法u渗透压冲击渗透压冲击(chngj)法法u冻结冻结-融化法融化法u干燥法干燥法45第四十五页，共七十四页。1）渗透压冲击(chngj)法 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于溶液），由于(yuy)(yuy)渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于胞转入水或缓冲液中，由于(yuy)(yuy)渗透压的突然变化，胞外渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。弱。46第四十六页，共七十四页。2）冻结(dngji)-融化法 将细胞放在低温下冷冻（约将细胞放在低温下冷冻（约-15-15），然后在室温中融化，反复），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁多次而达到破壁(p b)(p b)作用。作用。一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。47第四十七页，共七十四页。使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用(ciyng)(ciyng)丙酮、丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-3025-30的气流中吹干；的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。真空干燥多用于细菌。冷冻干燥适用于不稳定的生化物质冷冻干燥适用于不稳定的生化物质3 3）干燥）干燥(gnzo)(gnzo)法法气流干燥气流干燥真空干燥真空干燥喷雾干燥喷雾干燥冷冻干燥冷冻干燥48第四十八页，共七十四页。49第四十九页，共七十四页。选择破碎选择破碎(p su)方法的依据：方法的依据：u细胞处理量；细胞处理量；u细胞壁强度和结构细胞壁强度和结构(高聚物交联程度高聚物交联程度(chngd)(chngd)、种类和壁厚度种类和壁厚度)；u目标产物对破碎条件的敏感性；目标产物对破碎条件的敏感性；u破碎程度；破碎程度；u目标产物的选择性释放目标产物的选择性释放50第五十页，共七十四页。选择性释放目标产物的一般(ybn)原则仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围l当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的方法，当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的方法，如酶溶法、渗透压冲击法和冻结融化法等。当目标产如酶溶法、渗透压冲击法和冻结融化法等。当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法l当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶液液pHpH值，离子强度值，离子强度(qingd)(qingd)或添加与目标产物具有亲和性的或添加与目标产物具有亲和性的试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释放。放。(2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。51第五十一页，共七十四页。破碎技术的研究破碎技术的研究(ynji)(ynji)方向方向1)1)多种破碎多种破碎(p su)(p su)方法相结合方法相结合化学法、酶法、机械法相化学法、酶法、机械法相(f xin)(f xin)结合。结合。酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、渗透压法结合酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、渗透压法结合如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa95MPa压力下压力下匀浆匀浆4 4次，总破碎率接近次，总破碎率接近100%100%。而单独采用高压匀浆法，同。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有样条件下破碎率只有32%32%。有机溶剂与冻融法、干燥法结合有机溶剂与冻融法、干燥法结合52第五十二页，共七十四页。破碎技术破碎技术(jsh)(jsh)的研究方向的研究方向-与上游过程相结合与上游过程相结合v在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如pHpH、温度、通气、温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。的影响。v在生长后期在生长后期(huq)(huq)，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂制剂(如青霉素如青霉素)，继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁，继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎；有缺陷，利于破碎；v选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；v用基因工程的方法对菌种进行改造，如在细胞内引进噬菌体基因，用基因工程的方法对菌种进行改造，如在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。胞自内向外溶解，释放出内含物。53第五十三页，共七十四页。（inclusion bodies IBs)3.3 3.3 基因工程基因工程(jyn gngchng)(jyn gngchng)包涵体的包涵体的纯化纯化基因工程菌培养液不同表达形式的前处理基因工程菌培养液不同表达形式的前处理(胞外分泌型表达：离心胞外分泌型表达：离心,收集液相收集液相浓缩浓缩纯化。纯化。(胞内表达：胞内表达：l胞内可溶性表达：离心胞内可溶性表达：离心,收集菌体收集菌体细胞破碎细胞破碎离心，