中国人抗肌营养不良蛋白基因缺失的分布特点.docx

中国人抗肌营养不良蛋白基因缺失的分布特点【摘要】目的了解国内Duchenne/Becker型肌营养不良症(DMD/BMD)患者基因缺失的分布特点。方法用12对引物以多重PCR检测与56例DMD/BMD患者，分析缺失型患者抗肌营养不良蛋白(dystrophin)基因缺失的断裂点分布， 并结合国内文献报道的221例病例资料，分析9对引物的总检出率及各引物的最佳组合。结果国内dystrophin基因缺失断裂点72%位于4451号内含子内，以44号内含子最多(22%)，50号内含子次之(17%), 位于4551号内含子内的断裂点是44号内含子的倍。7号内含子断裂较少，仅4%的断裂点位于该内含子。9对引物的总检出率为48%，其中5对引物的总检出率为46%。两对引物的最佳组合为48号和17号，可检出35%的患者。结论国内dystrophin基因4451号内含子高度不稳定，容易发生断裂。7号内含子可能不是国内dystrophin基因缺失断裂的高发区域。在国内5对引物的总检出率接近9对引物，48号和17号外显子的二重PCR扩增对于全国范围内DMD/BMD的筛选，尤其是结合其他方法进行大范围的产前筛选，不失为一种可取的选择。【Abstract】ObjectiveTo understand the distributional characteristics of dystrophin gene deletion in Chinese 56 Duchenne/Becker muscular dystrophy (DMD/BMD) patients were detected by twelve primers mPCR (9 primers plus exon 7,50,52) and the distribution of the breakpoints of dystrophin gene deletion was analyzed. Combining with the 221 unrelated DMD/BMD cases reported in the published papers in China, we analyzed the positive ratio detected by the nine primers mPCR and the best primers combination to detect DMD/BMD About 72% of deletion breakpoints fell in intorns 4451 in the Chinese&nbs p;DMD/BMD patients. About 22% of deletion breakpoints fell in intron 44 , 17% in intron 50, whereas the majority (50%) were located within the segments encompassing introns 4551. Only 4% of deletion breakpoints fell in intron 7. Nine primers mPCR could detect 48% of all the cases of DMD/BMD, and five (exons 12,51,17,48,45) of these nine primes could detect 46% of all the cases of DMD/BMD. The best two-primer combination was exons 48 and 17, which could detect 35% deletion of all the DMD/BMD Introns 44 51 were highly unstable and prone to break. Intron 7 might not be a real deletion “hot spot” in the Chinese population. In China, the positive rate of deletion detection with five primers mPCR was almost the same as that with nine primers mPCR. Detecting deletion of exons 48 and 17 might be a preferable choice if the prenatal screening on a wide range of pregnancies would be needed.【Key words】Muscutar dystrophyGene deletion Polymerase chain reactionDystrophin抗肌营养不良蛋白(dystrophin)基因突变中55%65%为缺失，5%10%为重复，8%左右为小的缺失和插入，点突变占25%左右1。dystrophin基因缺失分布在不同民族有不同的特点，如在以色列，Duchenne/Becker肌营养不良症(DMD/BMD) 患者dystrophin基因突变中缺失率较低2，而希腊人和保加利亚人dystrophin基因缺失的断裂点分布有其独特的特点3，4。我们利用12对引物(9对引物5加7、50和52号外显子扩增引物)检测了56例DMD/BMD患者，分析了缺失型患者dystrophin基因缺失的断裂点分布。并结合国内文献报道，共分析了274例无血缘关系的DMD/BMD患者9对引物检测的总检出率及各引物最佳组合。资料和方法一、资料56例DMD/BMD患者均来自我院神经遗传病专科门诊，其中BMD 5例。所有患者均为男性，年龄8个月至30岁。患者中有6例两两之间有血缘关系。53例无血缘关系的病例中12例有家族史或同胞发病，占23%。除1例8个月男婴为症状前诊断外，其余患者均有典型临床表现并经肌电图、肌酶谱检查证实。此外，结合国内文献221例资料，分析9对引物的总检出率。二、PCR扩增9对由Chamberlain设计的引物5由中山医科大学遗传病学教研室提供，为了解dystrophin基因缺失在中央缺失热区的断裂点，我们根据Beggs等6的设计合成了50、52号外显子扩增引物。将以上11对引物分为5对、4对、3对三组：5对引物为12、17、45、48、51号外显子扩增引物，4对引物为4、8、19、44号，3对引物为50、51、52号。每次扩增均同时设空白和正常对照。缺失的外显子再以单一引物PCR扩增验证1次。为了解7号内含子的断裂情况, 我们合成了7号外显子扩增引物，引物序列7F：GCATGGAAGTAAATCTCATGGAAC；7R：GTGTAG-AAATGACAAGTCTCAGATG，扩增产物为279 bp。结果56例患者中28例至少有1个外显子缺失。53例无血缘关系的患者中27例有基因缺失，总检出率为51%。累及中央缺失热区的缺失24例，总检出率为45%, 占检出病例的89%。根据检测结果，在27例缺失的54个断裂点中，72%的断裂点位于4451号内含子，50%的断裂点位于4551号内含子。确定位于7、44、50和51号内含子内的断裂点共30个，22%、17%、13%的断裂点分别位于44号、50号、51号内含子。7号内含子断裂较少，仅4%的断裂点位于该内含子。结合文献资料7-14, 274例DMD/BMD患者9对引物的总检出率为48%。对207例有完整资料的病例分析表明，48号外显子缺失最常见，45、51、17号外显子次之，它们各自的总检出率分别为28%、20%、16%、10%，分别占9对引物检出人数的57%、42%、33%、22%。4、8号外显子缺失少见，仅占总检出率的1%、5%。两对引物的组合以48号和17号组合检出率最高，总检出率为35%，检出人数占9对引物检出人数的73%。3对引物的最佳组合为48、45和17号，总检出率为41%，占9对引物检出人数的84%。4对引物的最佳组合为48、17、45和51号，总检出率为44%，占9对引物的91%。5对引物总检出率可达46%，占9对引物检出人数的96%。讨论dystrophin基因突变55%65%为缺失，且主要分布在两个区域。中央缺失热区位于4453号外显子区域，占所有缺失的70%左右；5端缺失热区位于319号外显子，占20%左右。Chamberlain等5的9对引物可检测出80%的缺失患者，Beggs等6又增设了另9对引物，发现这18对引物可检测出98%的缺失患者。以上研究为临床检测提供了极其重要的信息。dystrophin基因长达 Mb，其所包含的79个外显子仅占整个序列的%，因而内含子大是其显着的特点。早期的研究表明，该基因缺失断裂点的分布是非随机的，因而许多学者认为该基因最长的2个内含子(44和7号)是该基因断裂的高发区。本资料显示9对引物的总检出率为51%，与国外研究结果相似1 3。但对缺失断裂点的分析发现，72%的缺失断裂点位于4451号内含子内，以44号内含子最多，50、51号内含子次之(分别为17%、13%)。约50%的断裂点位于4551号内含子内，是44号内含子的倍。国内274例DMD/BMD患者9对引物的缺失总检出率为48%，缺失外显子以48号最为常见，45、51号次之。以上结果与部分文献报道相似。Danieli等15报道，在部分欧洲人群中位于4551号内含子内的断裂点是44号内含子的倍。在保加利亚人，dystrophin基因的总缺失率与其他文献报道相似，但%的断裂点位于4551号内含子内，以50号内含子最多, 而断在44号内含子内的比率为%4。希腊3和土耳其16也发现，在50号内含子内断裂点有聚集现象。4551号内含子的总长度不超过270 kb，仅较44号内含子大30%左右。50号内含子长约45 kb, 长度仅为44号内含子的1/4。提示至少在国内及以上人群中，不仅44号，4551号内含子也是高度不稳定的，尤其是50号内含子。在以上人群中，这一区域的内含子容易发生断裂。本资料中7号内含子断裂较少，仅4%的断裂点位于该内含子。对其他资料7 -14统计结果也发现，国内DMD/BMD患者4号和8号外显子缺失少见，仅分别占1%、5%。这一结果低于国外的报道 (%)17，提示7号内含子可能不是国内dystrophin基因缺失的断裂高发内含子。7号内含子是否是中国人真正的缺失热区，尚有待进一步研究。对国内207例完整资料的分析表明，国内5对引物的检测效果与9对引物接近，其总检出率达46%，占9对引物的96%。我们认为, 在国内如果受条件限制，可以考虑用5对引物来替代9对引物检测或先行5对引物检测。对于条件较差的医院可以根据本研究统计的引物最佳组合，酌情选择检测引物。行48号、17号外显子的二重PCR扩增，可筛选出35%的DMD/BMD患者，对于全国范围内DMD/BMD的筛选，尤其是结合其他方法进行大范围的产前筛选时，不失为一种可取的选择。参考文献1Roberts RG, Gardner RJ, Bobrow M. 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