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41BBL胞膜外区蛋白对人外周血淋巴细胞体外活性的调节作用 【摘要】 目的: 研究41BBL胞膜外区融合蛋白(ex41BBL)对人外周血淋巴细胞体外活性的调节作用。方法: 表达纯化人41BBL胞膜外区融合蛋白, 台盼蓝计数观察其对淋巴细胞增殖的作用; CytoTox 96非放射性细胞毒试剂盒检测培养液的乳酸脱氢酶水平, ELISA检测白介素2水平。CytoTox 96检测其联合应用antiCD3/antiPgp微型双功能抗体及PBL对靶细胞K562/A02细胞的杀伤作用。结果: 41BBL胞膜外区融合蛋白能够促进淋巴细胞增殖, 减少细胞死亡, 促进IL2分泌; 联合应用ex41BBL的淋巴细胞组的杀伤效率优于对照组。结论: ex41BBL可能成为增强淋巴细胞活性的重要免疫佐剂。【关键词】 41BBL 淋巴细胞 antiCD3 antiPgp 双功能抗体 抗CD3/抗肿瘤抗原的微型双功能抗体如antiCD3/antiPgp、 antiCD3/antiCD20和antiCD3/antiCD191, 2等能够将活化的淋巴细胞靶向至肿瘤细胞, 从而在体外和体内介导特异性杀伤作用, 是一种很有潜力的治疗恶性肿瘤的方法。但是, 采用微型双功能抗体同许多借助完全抗体的治疗相似, 也存在对肿瘤生长的控制难于持久以及停药后复发的问题。这是多种因素影响的结果, 但可以确信, 淋巴细胞作为抗肿瘤免疫过程中的主要效应细胞, 其激活程度以及活化后的状态是关键的因素之一。目前, 包括B7、 41BBL在内的共刺激分子对淋巴细胞的活化作用日益受到关注, 许多研究证明调节一种或多种共刺激分子信号能够改善效应细胞的功能并最终影响抗肿瘤免疫效果。国内外已有关于使用激活性抗41BB抗体治疗肿瘤甚至根治肿瘤的报道3, 但关于可溶型41BBL的作用研究很少。本室构建表达的ex41BBL在大肠杆菌16C9中表达提取纯化后, 已经对其结合活性及促进Jurkat细胞释放IL2作了相关研究4。本实验进一步研究其对人PBL的调节作用, 并通过体外杀伤实验研究其对antiCD3/antiPgp介导的PBL抗肿瘤活性的影响。 1 材料和方法材料CytoTox 96非放射性细胞毒试剂盒购自美国Promega公司; 人IL2 ELISA试剂盒购自晶美生物工程有限公司; 四甲基偶氮唑盐试剂购于博大泰克公司; 其他均为国产分析纯生化试剂。K562/A02细胞系由本室保存。AntiCD3/antiPgp微型双功能抗体和ex41BBL由本室表达和纯化。两种蛋白均带有大小为13个氨基酸的Etag作为鉴定和纯化标记, 通过Pharmarcia公司的antiEtag亲和层析柱纯化后纯度95%。Ex41BBL蛋白包括人41BBL的全部胞膜外结构, 其相对分子质量约为22 000。纯化的蛋白采用Pierce公司的BCA蛋白测定试剂盒测定浓度。方法淋巴细胞的分离与活化健康成人全血经Ficoll分离后得到单个核细胞, 在含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中于37、 50 mL/L CO2条件下培养2 h后, 保留非贴壁的外周血淋巴细胞, 调整细胞密度为3109/L, 加入500 g/L antiCD3/antiPgp 和IL250 U/mL, 继续培养48 h后离心收集细胞, 用PBS缓冲液洗涤2次后重悬于含有100 mL/L FBS的RPMI1640培养液中用于体外实验。细胞增殖及细胞活力检测按照108/L接种淋巴细胞于96孔板, 给予如下终浓度的刺激分子, 即50 U/mL IL2、 500 g/L antiCD3/antiPgp或二者之外再加入500 g/L ex41BBL。分别在培养的2、 4、 6 d用台盼蓝计数检测存活细胞数量。培养第6天, 用MTT法检测各组的细胞活力。同时, 分别在培养48 h和72 h取培养液50 L, 用CytoTox 96试剂盒检测各组上清中LDH的水平。IL2的检测将108/L 淋巴细胞接种于96孔板, 设立3个实验组, 每组3个复孔, 分别给予不同的刺激分子, 包括 500 g/L 41BBL、 500 g/L antiCD3/antiPgp和二者联合应用。在37、 50 mL/L CO2条件下培养48 h, 离心后取各组上清, 分别加入ELISA试剂盒抗体包被板条中。同时设立标准品浓度梯度组, 按照说明进行各步反应后, 测A450值, 绘制标准曲线, 计算上清的IL2水平。体外联合应用对K562/A02细胞的杀伤实验 采用CytoTox 96非放射性细胞毒试剂盒, 比较2种处理方法的淋巴细胞对靶细胞的杀伤效果。靶细胞K562/A02每孔加入2104/100 L。第1组加入500 g/L antiCD3/antiPgp, 第2组加入500 g/L antiCD3/antiPgp和500 g/L ex41BBL。按照效靶比201、 101、 51和1分别加入活化的PBL, 同时按照操作说明设立对照组, 每组3复孔。在37、 50 mL/L CO2条件下培养4 h后, 取上清, 按照说明先后加入反应底物和终止液, 酶标仪测定A492值后, 按下式计算杀伤百分率: 细胞杀伤率/(靶细胞最大释放-靶细胞自发释放)100。统计学处理应用软件进行分析, 两组均数比较应用Studentt检验, 多组均数比较应用OneWay ANOVA检验。当 时认为差异有统计学意义。2 结果促进淋巴细胞增殖并改善存活状态给予ex41BBL的联合处理组, 淋巴细胞数由初始的5108/L增加到第6天的108/L, 而单独使用antiCD3/antiPgp的处理组, 细胞由初始的5108/L增加到108/L, 两组间存在明显差异。同时, 联合处理实验组培养液上清的LDH水平的降低趋势显示该胞外区蛋白能够减少活化淋巴细胞的LDH释放。促进淋巴细胞IL2分泌加入ex41BBL的对照组淋巴细胞释放的IL2的浓度为( ) ng/L, 单独用antiCD3/antiPgp组的浓度为( ) ng/L, 而联合处理组的IL2浓度为( ) ng/L, 联合处理组同其他两组间存在明显差异。这一结果说明, ex41BBL联合antiCD3/antiPgp能够促进活化淋巴细胞分泌IL2。联合应用antiCD3/antiPgp、 ex41BBL及PBL杀伤K562/A02细胞 采用CytoTox 96试剂盒检测不同处理组的特异性杀伤。给予人ex41BBL的试验组, 在不同的效靶比时, 对靶细胞的杀伤百分比均高于没有加入胞膜外区蛋白而只有antiCD3/antiPgp和PBL的对照组。如ET为201时分别为( )%和 ( )%。3 讨论 T细胞是PBL中参与抗肿瘤免疫的主要效应细胞, 其活化状态同杀伤肿瘤细胞的效果直接相关。缺少TCR复合物同提呈抗原肽的MHC分子作用的第1信号, 可以使淋巴细胞的活化受到影响, 而共刺激信号的不足同样会影响其充分活化。如肿瘤细胞缺失或低表达B7、 41BBL等共刺激分子, 会使淋巴细胞对肿瘤的免疫反应减弱。另外, T淋巴细胞在增殖分化中如果未能获得完全活化信号, 可能会出现活化诱导的细胞死亡或者无能状态, 从而导致抗肿瘤免疫功能低下。 然而, 利用这些特点调节对T细胞的共刺激信号却能够调节其活性。目前研究较多的是CD28/B7和41BB/41BBL。CD28/B7信号通路能够协同诱导T细胞产生高水平的IL2, 提供必要的存活信号, 防止AICD以及细胞无能状态。但是该信号的作用是短暂的, 随即被CTLA4和B7的作用所抑制, 而对T细胞活化的进一步调节则需要41BBL等共刺激分子。41BB/41BBL属于TNF家族, 其对活化的T细胞的免疫增强作用, 同增加细胞数量, 延长存活时间, 甚至增加颗粒酶、 穿孔素的蓄积等机制相关5。而且, 已发现应用41BB激动性抗体可增加肿瘤部位的淋巴细胞浸润6, 7。这些因素均有助于增强细胞免疫功能。41BB/41BBL的作用对CD4+和CD8+淋巴细胞均提供活化信号8, 但对CD8+的细胞更利于扩增和存活9。激活这一信号通路可以改变非最佳状态的免疫反应, 使得肿瘤杀伤过程中的主要参与者之一细胞毒淋巴细胞cytotoxic T lymphocyte, CTL）活性增强, 从而使基于PBL的生物治疗效果得到改进。为此, 我们构建了表达人ex41BBL的原核表达载体, 并且已经证实这种可溶性表达的蛋白能够同受体结合并能够促进Jurkat细胞分泌IL2。在本研究中, 体外实验结果说明了该分子能够促进人类淋巴细胞的增殖, 同时, 对淋巴细胞活化后的状态具有调节作用, 使细胞的LDH释放减少。尽管细胞增殖, 数量增加, 但是释放的LDH并未高于对照组, 提示其减少了细胞死亡, 改善了活化淋巴细胞的存活状态。进一步实验也证实了该胞膜外区蛋白能够激活PBL并促进IL2的释放。双特异抗体联合应用激活共刺激信号通路的治疗方案能够提高疗效, 这一点已被许多实验证实10。本研究中检测了ex41BBL联合双功能抗体的体外杀伤效果, 用以观察对PBL细胞毒性的调节作用。数据显示, 经过ex41BB处理活化的淋巴细胞, 联合antiCD3/antiPgp微型双功能抗体, 在不同的效靶比下能够增强对高表达Pgp的耐药肿瘤细胞K562/A02的杀伤作用。这说明通过ex41BBL给予活化的淋巴细胞强化的共刺激信号, 确实改变了淋巴细胞的状态, 提高了其对肿瘤细胞的杀伤效率。体外杀伤实验中, 加入ex41BBL实验组的杀伤百分率的增加主要同预活化处理时和杀伤过程中加入的ex41BBL对活化淋巴细胞的调节作用有关。这些活化的淋巴细胞可能蓄积丰富的穿孔素、 颗粒酶等对靶细胞进行高效地杀伤。同时, ex41BBL能够减少淋巴细胞AICD, 也使 1Gao Y, Xiong D, Yang M, et al. 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