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现代食品XIANDAISHIPIN107/食品科技FoodScienceandTechnology关于阿斯巴甜人体甜味受体预测模型探讨TheSummarizationofHumanSweetTasteReceptorPredictionModesbasedonArtificialtwoPeptideSweetenerAspartame 刘晓丹，李 博，曲春波，刘 倩，谈甜甜（上海城建职业学院，上海 201415）Liu Xiaodan,Li Bo,Qu Chunbo,Liu Qian,Tan Tiantian(Shanghai Urban Construction Vocational College,Shanghai 201415,China)摘 要：阿斯巴甜，作为二肽类人工甜味剂的典型代表，在食品领域有很广泛的应用，但是分子易受温度、水和 pH 的影响，导致失甜，为了改进分子性能，合理探索阿斯巴甜二肽类衍生物人工甜味剂，本文利用Shallenberger-Kier 学说的多点结合理论，对甜味受体蛋白模型进行计算机优化，以获得最接近人体甜味受体蛋白结构的模型，为今后人体甜味受体模型的制定应用和二肽甜味剂阿斯巴甜衍生物分子结构的改造和筛选研究提供有效参考。关键词：人体甜味受体；二肽人工甜味剂；阿斯巴甜Abstract：Aspartame,as a typical artificial sweetener of dipeptides,has been widely used in food industry.But the molecule is susceptible to temperature,water and pH.In order to improve the molecular properties and explore the artificial sweetener of Aspartame dipeptide derivatives reasonably,the model of sweetness receptor protein was calculated by using the multi-point binding theory of Shallenberger-Kier theory.In order to obtain the protein structure closest to human sweetness receptor,the machine optimization provides an effective reference for the future development and application of human sweetness receptor model and the molecular structure modification and screening of aspartame derivatives as dipeptide sweeteners.Key words：Human sweet taste receptor;Artificial two peptides sweetener;Aspartame中图分类号：TS202.3阿斯巴甜是目前市面上使用比较普遍的一种二肽类人工甜味剂，已获得 100 多个国家及权威机构的认可。主要优势是不会产生龋齿、不影响血糖、热量低、甜度高及甜味纯1，一直以来，基于阿斯巴甜呈味特性的人体甜味受体一直很难获得，原因是甜味受体蛋白是一种膜蛋白，有七次跨膜区域，因而组织中能够提取的目的蛋白及其稀少。甜味受体蛋白在肠道中存在于内分泌细胞中，而内分泌细胞只占肠道细胞总量作者简介：刘晓丹（1981）女，硕士，助教；研究方向为食品教学。doi:10.16736/41-1434/ts.2019.07.030现代食品XIANDAISHIPIN108/食品科技Food Science and Technology的 1%，因此提取人体组织的甜味受体十分困难，研究者们利用二肽甜味剂的呈味特点及多位点结合理论，不断寻找与人体甜味受体相接近的结构，甚而利用计算机模拟出最为匹配的甜味受体模型。1 阿斯巴甜分子甜味呈味机理1.1 早期研究在 20 世纪，研究者们对阿斯巴甜的呈甜机理进行了大量研究，最具代表性的是 Shallenberger2提出了AH/B 甜味产生机制：甜味分子结构存在一个能形成氢键的基团（-AH），即质子的供给者（proton donor）如（-OH、-NH2、=NH 等），同时存在一个电负性较大的原子（B）即质子接受者（proton acceptor）如 O、N 原子等，两类基团（AH/B）的距离约为 0.3 nm（3），同时甜味受体蛋白中也含有相应的-AH 与 B 基团。在各类甜味剂的研究中发现，甜味剂含有的 AH 能和甜味受体蛋白中的 B 形成氢键，同时甜味剂中的 B 基团能和甜味受体蛋白中的 AH 基团形成氢键，这样便产生了甜味。Kier2对 AH/B 理论进行了补充，他认为甜味物质在距离 AH 约 0.35 nm，距离 B 约 0.55 nm 的地方有一疏水基团 X，如 CH2、CH3、C6H5，它能与味觉受体的亲脂性部位形成疏水键，使两者产生第三接触点，形成一个三角形的接触面。AH、B 和疏水基团 X形成空间三角形，分别与甜味受体蛋白的 B、AH 和 X三个活体位点相作用。很显然 X 也是影响甜味剂甜度的一个控制因素。三点接触面需要和甜味受体蛋白形成对应的化学键B-AH，AH-B，X-X，才能产生甜味，阿斯巴甜的空间构型符合三点理论：N-端的氨基酸天冬氨酸（-L-Asp）的构型满足左旋结构，-NH2连接在羰基 碳上，且生甜基团-NH2（AH），-COOH（B）和-CH（X）按顺时针旋转，见图 1；同理 C-端的苯丙氨甲酯部分（L-Phe-OMe）的构型也满足左旋型，且生甜基团-NH-（AH）、-CONH-（B）和-CH2C6H5（X）按照顺时针旋转2。-L，L 构型的阿斯巴甜符合 Goodmen 的理论“L”形状结构3，这时天冬氨酸分子作为 L 的+Y 轴，疏水的苯基侧链就成为 L 的+X轴。而 L，D 构型的异构体成反“L”形，它的疏水苯基侧链朝向 L 的-X 轴，不符合甜味基团分布规律，因此不产生甜味。图 1 阿斯巴甜分子所呈现的空间“L 形状“及生甜团的排布图1.2 多点结合甜味理论早期的理论可解释阿斯巴甜呈甜味的原因，但是，有些含有 AH、B 体系的化合物没有甜味如一些氨基酸不呈甜味，X 疏水部位的引入也不足以解释所有的甜味现象，因此 AH、B、X 三角理论还不能完全解释甜味的产生。综合 Shallenberger 与 Kier 理论，多点结合甜味理论合理解释了甜味呈味机理4。人体甜味蛋白受体最少包括 8 个基本识别部位，分别为 B、AH、XH、G1、G2、G3、G4 和 D，这些识别部位能与甜味分子相应的部位发生相互作用，不同甜味分子的结合部位可以少于 8 个，通常都超过 3 个结合部位。阿斯巴 甜 属 于 B1、B2、AH1、XH1、XH2、G1、E1、G2及 G4 型甜味剂，阿斯巴甜与甜味受体的 9 个结合位点分布如图 2 所示。这些基团通过离子键、氢键和范德华力 3 种作用方式，与受体蛋白相应的识别部位发生相互作用5。图 2 阿斯巴甜与甜味受体结合 9 位点分布图现代食品XIANDAISHIPIN109/食品科技FoodScienceandTechnology2 二肽人工甜味剂阿斯巴甜人体甜味受体模型建立2.1 基于富勒醇的甜味受体模型的建立陈果3应用富勒醇作为人工甜味剂的受体，主要考虑富勒醇具有以下特征：具有特异的球形结构和尺寸，可以调控多个取代基的位置和构象，在结构上能满足甜味剂多位点键合要求。含多羟基能与甜味剂极性基团通过氢键产生多位点结合。C60 球笼的疏水结构能与甜味分子产生范德华力。有较好的水溶性，能有效模拟人体甜味受体的物理环境。但是富勒醇与真实的人体甜味受体蛋白的结构还有很大差距，基于蛋白结构模拟甜味受体仍是最佳选择。2.2 基于代谢型谷氨酸受体蛋白甜味受体模型的建立生物甜味受体已经研究了三十多年，目前，研究表明人体甜味受体 T1R2/T1R3，sac 基因座控制着编码T1R3基因，T1R2和T1R3组成的二聚体即为甜味受体，而表达 T1R2+T1R3 的细胞即为甜味函授的味觉受体细胞6。早期，人们发现人类甜味受体是 hSTR，然而这个受体有超过 800 个氨基残基，通过目前的实验或计算机建模方法很难获得其精确的结构数据，只能截取受体 hSTR 中氨基终端或位于横膜区的 T1R2/T1R3亚基来进行结构分析，形成 3D 模型，研究表明7 大部分甜味剂的结合位点集合在这些区域内。T1R2/T1R3 结构中包含两对 C 级 G 蛋白偶联受体（Class C of G-Protein Coupled Receptor，C-GPCR）的 异 杂聚合体结构亚基，具有两个捕蝇模型（Venus Flytrap Module，VFTM）和半胱氨酸富集区（the Cysteine-rich Domain，CRD）以及 7-螺旋横膜区（Transmembrane Domain，TMD），CRD 位于捕蝇模型和 7-螺旋细胞横膜之间。二肽类甜味剂-L，L 型阿斯巴甜只能与T1R2 的 VFTM 区域结合8。2.2.1 代谢型谷氨酸盐受体蛋白晶体结构 mGluR1（PDB ID：2E4U）的氨基酸人类的 VFTM-T1R2 受体三维蛋白结构参考模型氨基酸序列数据可以从 Swiss-Plot 库找到，登录号为Q8TE23，再从 NCBI（National Center for Biotechnology Information）BLAST 搜索引擎中获得对应的模板，选用与谷氨酸结合的代谢型谷氨酸盐受体蛋白晶体结构mGluR1 的氨基酸模板（PDB ID：2E4U），相似度达到了 28%，是目前与人类甜味受体蛋白相似度较高的模板，研究者们利用MODELLER 9v14软件包（Andrej Sali Lab Francisco，CA），从100个模型中选取DOPE（Discrete Optimized Protein Energy）值最小蛋白模型，再通过GROMACS4.5 软件包的最速下降法计算最小化模型，获得人体甜味受体模型 T1R2 的三维模型分子5。通过阿斯巴甜分子对接发现，T1R2 疏水口袋 Ile67 与阿斯巴甜结构 G2，G4 衔接；Ser303 羟基和羰基部分与阿斯巴甜的羰基和氨基通过氢键相连；Asp307 通过盐桥和阿斯巴甜的 NH3+相连，Ser303 和 Asp307 形成了氢键和盐桥，是与阿斯巴甜分子连接的最主要的氨基残基结合点9。2.2.2 代谢型谷氨酸盐受体蛋白晶体结构 mGluR1（PDB ID：1EWK）氨基酸Emeline10等人利用 mGluR1（PDB ID：1EWK）模板进行模拟改良，利用 MODELLER 程序用二硫键限制了 mGluR1 晶体模型中的 C67-C109、C378-C394和 C432-C439，用 CHAMM 程序模拟计算了 VFTM构型，通过 5000 次最速下降法和 40000 步牛顿迭代法（ABNR Adapted Basis Newton Raphson）最小化，从而获得人体甜味蛋白模型，研究人员通过变化各种T1R2-VFTM 的残基，评估了这些受体的活性，并获得了 11 环状残基（S40、Y103、D142、S144、S165、S168、Y215、D278、E302、D307 和 R383）的结合口袋，这些结合点与配体识别以及阿斯巴甜活性关系密切。2.2.3 代谢型谷氨酸盐受体蛋白晶体结构 mGluR1（PDB ID：2E4U、LEWK、3KS9 及 2E4Z）的氨基酸A.Shrivasta7等人基于mGluR1结晶结构数据（PDB ID2E4U、LEWK、3KS9 及 2E4Z），利 用 SWISS-MODEL 进行模拟计算，寻找出了 T1R2 区域 VFTM-CRD 最佳模拟结构。通过软件应用，获得的 T1R2 预测模型与真实蛋白接近度超过 95%，并且通过软件及其模拟结构能成功将阿斯巴甜与 T1R2-VFTM 结点对现代食品XIANDAISHIPIN110/食品科技Food Science and Technology接。基于此研究的甜味 TIR2 受体蛋白模型已经可以在 PMDB（Protein Model Data Base）http:/mi.caspur.it/PMDB/中 获 取，T1R2 亚 基 PMDB 的 ID 号 是：PM0078689。研究中发现，甜味配体-L,L 型阿斯巴甜主要与 T1R2-VFTM 口袋对接，主要对接点区域为环 L1、L12、L17、L19、螺旋 H9 及-折叠 B8 等，并且数目越多越好，符合甜味多点结合理论的位点越多，甜度就越高。配体与受体主要的氢键结合部分有 4种。VFTM 区域 Gln459 氨基酸上的 N（B）与阿斯巴甜-NH-（XH）形成氢键。Arg457氨基酸上的H（H）与阿斯巴甜C=O（即图1-1中B1、B2结合点）形成氢键。Gln463上的H（H）和O（AB）分别和阿斯巴甜的（C=O）（E1）和（-NH2）（XH1，AH1）基团形成氢键。其余基团即为疏水 X（如 G2、G4、G1）的结合，受体蛋白 VFTM 结合区域氨基酸为 Ile306、Leu377、Ser372、Leu371、Pro308、Gln463、Arg457 及 Thr375。2.2.4 其它蛋白晶体结构对甜味受体蛋白的模拟此外，Mayank11等人用代谢型谷氨酸受体蛋白mGluR5（PDB ID 3LMK）模板（相似度 25%）进行模拟改良；段辉12等人利用 mGluR4 模板进行模拟改良；Fariba13等人认为人类 T1Rs 蛋白部分结构和 mGluR3（相似度25.79%），mGluR7和视紫质蛋白都有关。因此，寻找和人体最接近的甜味蛋白受体模板依然任重而道远。3 总结目前与二肽类人工甜味剂阿斯巴甜位点结合的人体甜味受体 T1R2-VFTM 蛋白模型都是基于代谢型谷氨酸受体蛋白进行改良模拟，然而相吻合度都低于30%，但是通过计算机辅助优化计算，吻合度在 95%以上，还需要研究者们进一步探索发现更符合人体受体蛋白的模板。同时，各类研究中蛋白的模型模拟方法也各不相同，获得的数据无法统一，若想匹配二肽人工甜味剂阿斯巴甜衍生物与受体位点对接分析，需要依据指定蛋白的模拟计算方法，运用文献资料中的专门软件进行对接分析，为日后人工二肽类甜味剂阿斯巴甜衍生物的分子改造和筛选提供理论依据。参考文献：1 吴璞强，赵桂霞，张亚楠，等.阿斯巴甜的合成和应用研究进展 J.中国调味品，2010，35（1）：30-37.2 郑建仙，高宪枫，袁尔东.AH，B，H 的甜味分子识别及其理论扩展 J.中国食品添加剂，2001（5）：32-36.3 陈 果.人工甜味剂模型识别甜味过程的分子动力学模型 D.杭州：浙江工商大学，2011.4 李振远，李方方.甜味受体的营养研究进展及其基因表达调控 J.养猪，2017（1）：25-30.5 邱 洁，郑健仙.二肽甜味剂的研究进展 J.食品研究与开发，2006，27（10）：173-175.6 谢宁宁.人工甜味剂暴露对机体多组织甜味受体表达的影响 D.杭州：浙江工商大学，2017.7AditiShrivastav，SudhaSrivastava.HumanSweet Taste Receptor:Complete StructurePrediction and EvaluationJ.InternationalJournalofChemicalandAnalyticalScience，2013，4（1）：24-32.8 刘秋蕾，王 飞，李 磊，等.甜味分子与 G 蛋白偶联受体 Tas1R2/3 的相互作用及激活机制 J.生命化学，2014（4）：500-505.9AdrianoMollica，SakoMirzaie.Exploringthebiologicalconsequencesofconformationalchanges in aspartame models containingconstrained analogues of pheylalanineJ.JEnzymeInhibMedChem，2016，31（6）：953-963.10Emiline L，Maillet，Meng Cui，et 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