低分子量κ-卡拉胶马来酰基化衍生物的制备及抗氧化活性的研究.pdf

天然产物研究与开发N a tP r o dR e sD e v2 0 0 9，2 1：1 0 2 8 1 0 3 1文章编号：1 0 0 1-6 8 8 0(2 0 0 9)0 6 1 0 2 8 0 4低分子量K。卡拉胶马来酰基化衍生物的制备及抗氧化活性的研究孙涛，陶慧娜，卢克祥，周冬香，毛芳，姚倩上海海洋大学食品学院海。上海2 0 1 3 0 6摘要：对K-卡拉胶进行氧化降解，得到分子量不同的两种卡拉胶低聚糖，并分别制成四丁基铵盐，进而与马来酸酐进行酰化，制得两种不同分子量的卡拉胶马来酰基化衍生物。对产物进行I R 表征，并对产物的抗氧化性能进行测试。结果表明：K 一卡拉胶在马来酰基化以后对超氧阴离子自由基0；以及过氧化氢的清除能力都大大增强了。关键词：K-卡拉胶；氧化降解；马来酰基；抗氧化活性中图分类号：1 1 2 8 5；Q 5 3 9；T S 2 0 2 3文献标识码：AP r e p a r a t i o na n dA n t i o x i d a n tA c t i v i t yo fL o w-m o l e c u l a r-w e i g h tC a r r a g e e n a n sa n dT h e i rM a l e y o lD e r i v a t i v e sS U NT a o，T A OH u i-n a，L UK e-x i a n g，Z H O UD o n g x i a n g，M A OF a n g，Y A OQ i a nC o l l e g eo yF o o dS c i e n c e，S h a n g h a iO c e a nU n i v e r s i t y，S 地增h f2 0 1 3 0 6，C h i n aA b s t r a c t：T w ol o w m o l e c u l a r-w e i g h t(L M W)K-C a t c a g e e n a mw e r ep r e p a r e db yo x i d a t i v ed e g r a d a t i o no fK e a r r a g e e n a n si n v o l v i n gh y d r o g e np e r o x i d e T h et e t r a b u t y l a m m o n i u ms a l t s(T B A)w e F ep r e p a r e db yt e t r a b u t y l a m m o n i u m，t h e na e y l a t e dw i t hm a l e i ea n h y d r i d et oa b t a i nm a l e o y ld e r i v a t i v e so fL M WK c a r r n g e e n a n s T h ep r o d u c t sw e r ec h a r a c t e r i z e db yF I-I R T h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so fL M W K Ca n di t sd e r i v a t i v ew e r es t u d i e d T h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es c a v e n g i n ga c t i v i t i e so fa c y l a t e dd e r i v a t i v e sf o rs u p e r o x i d ea n i o na n dH 2 0 2w e r ei n c r e a s e da p p a r e n t l y K e yw o r d s：K-C a l T a g e C l l a n；o x i d a t i o nd e g r a d a t i o n；m a l e y o l；a n t i o x i d a n ta c t i v i t y卡拉胶作为一种海藻胶，主要是利用其高粘度和成凝胶等特性作为凝固剂、增稠剂等，被广泛应用于食品、化工、医药等工业生产中uJ。近年来，随着科技的进步，卡拉胶的应用已不再局限于简单的工业生产，而是不断地向生命科学领域发展。卡拉胶作为一种结构独特的硫酸多糖，被证明在抗病毒、抗肿瘤等方面都具有理想的药理活性旧J。但由于卡拉胶分子量大，溶解性差，使它的应用受到了很大的限制【3】。因此对其进行设计改性，采用降解和接枝修饰等手段，获得水溶性较好的卡拉胶低聚糖及各类衍生物，对于开发海洋新药具有重要的价值”1。氧化和机体的衰老、病变密切相关。研究表明肿瘤发生、心脑血管疾病、药物中毒、人体衰老等过收稿日期：2 0 0 8-0 9 1 6接受日期：2 0 0 9 1 0 1 4基金项目：上海市教育委员会科研项目(0 7=1 3 4)；上海市重点学科建设项目(T 1 1 0 2)通讯作者T e l：8 6-2 1-6 1 9 0 0 3 6 3；E-m a l l：t a u n s h o u e d u c n程都涉及到自由基和活性氧，因此，对抗氧化剂的研究开发至关重要L S 。本文研究了卡拉胶低聚糖及其马来酰化衍生物的抗氧化活性，以期为其进一步的高值化研究提供参考。1 材料与方法1 1 仪器与材料w F ZU V 2 0 0 0 型紫外分光光度计(上海合利仪器有限公司)；D e l t a3 2 0 型p H 计(梅特勒一托利多仪分析仪器上海有限公司)；I F F M D 型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈科技有限公司)；J B 9 0 一D 型强力电动搅拌机，M E T I L E RA E 2 0 0 型电子分析天平，J 1 8 0-2 B 型台式离心机。K-卡拉胶(食品级，上海联合食品添加剂有限公司)；四丁基氢氧化铵、N，N 二甲基甲酰胺、4-二甲基氨基吡啶、三丁基胺、马来酸酐(国药基团化学试剂上海有限公司)；鲁米诺(S i g m a 公司)；抗氧化测试所需溶液，由二次蒸馏水配制。万方数据孙涛等：低分子量K 一卡拉胶马来酰基化衍生物的制备及抗氧化活性的研究1 0 2 91 2 卡拉胶低聚糖的制备N J将3 0g 卡拉胶溶于1 2 0 0m L 浓度为0 6m o l L的H：O：中，于8 0 下降解8h，将产物干燥得白色粉末。将白色粉末溶于蒸馏水中，先通过微孔过滤器过滤(O 4 5I x m)，然后在蒸馏水中透析(3 5 0 0 7 0 0 0，7 0 0 0)6d，冷冻干燥后分别得到两种不同分子量的卡拉胶低聚糖1 2g。1 3 卡拉胶衍生物的制备p 1分别将1 2g 两种低分子量卡拉胶用7 3 2 型阳离子氢型树脂在4 下交换1h，过滤，再用四丁基氢氧化铵调节溶液p H 值至6 0，冻干，得两种卡拉胶四丁基铵盐。将卡拉胶四丁基铵盐8 9 8m g 溶解于2 0m LN，N 一二甲基甲酰胺中，然后依次加入1 3 1m 9 4-二甲基氨基吡啶，3 1 0m L 三丁基胺，1 2 7g 马来酰酐于装有磁力搅拌器和冷凝管的三口烧瓶中，通N 2 保护，在6 0 下反应6h，然后于4 的三水合乙酸钠的过饱和乙醇溶液中沉淀1 5h，用无水乙醇洗涤离心3 次后，将沉淀溶于蒸馏水中，在5 N a H C O，溶液中透析2d，再在蒸馏水中透析4d，冻干后分别得两种分子量的低聚糖卡拉胶马来酰基化产物0 6g。1 4 测试表征红外光谱在E Q U N O X 5 5 傅立叶红外一拉曼光谱仪上进行，采用K B r 压片法制样，测定波数范围为4 0 0 4 0 0 0e m 一，分辨率为0 8e m 一。1 5 卡拉胶降解产物及其衍生物相对分子质量的测定采用G P C 法测定卡拉胶降解产物及其衍生物的相对平均分子质量及其分布。G P C 测试条件如下：流动相：0 1m o l L 硝酸钠水溶液；监测器：W a-t e r s2 4 1 0 示差折光监测器；柱子：U l t r a h y g r o g e l5 0 0。1 2 0 串连；温度：4 0。标准物质为：葡聚糖。1 6 抗氧化性测定用流动注射化学发光法 3 1 考察了低分子量卡拉胶及其衍生物对超氧阴离子自由基O；的清除活性，用比色法来评价它们对双氧水的清除作用。1 6 1超氧阴离子自由基O i 的清除配制p H=1 0 2 0 的0 0 5m o l LN a 2 C O a-N a H C O，缓冲溶液，用缓冲溶液配制1 5 1 0。m o l L 的鲁米诺，用去离子水配制浓度为4 1 0 m o l L 的邻苯三酚溶液。以缓冲液作为溶剂，配制成不同浓度的样品待测溶液。用流动注射化学发光分析仪依次测定从稀到浓的样品溶液，读出峰面积。并计算出其对超氧阴离子自由基的清除率。清除率=(A o-A i)A o 1 0 0 式中，A。为未加抗氧化剂时的峰面积，A。为加入样品溶液时的峰面积。经S O D、过氧化氢酶及甘露醇检测，该体系产生的自由基为O i。1 6 2 过氧化氢的清除作用配制p H=7 2 的0 2m o l LN a 2 H P 0 4 一N a i l 2 P 0 4缓冲溶液，用缓冲溶液配制0 1m o l L 的H：O：溶液，在装有此H：O：溶液的比色管中，加入不同浓度的样品溶液2m L，摇匀，3 3 避光静置半小时，在2 3 0n m 处测量吸光度A；。用去离子水代替样品溶液，得吸光度A。，去离子水代替H：O：溶液，得吸光度A，。清除率=1 一(A i A，)A。1 0 0。2 结果与讨论2 1原料卡拉胶及其低聚糖的结构表征图1 是原料卡拉胶及其低聚糖的红外光谱图。由图可知，氧化降解后两个不同分子量的卡拉胶低聚糖均保留了原料卡拉胶的三个特征吸收峰，即1 2 5 0e m 4 吸收峰处的O S O 对称伸缩振动吸收峰；8 5 0e m 4 吸收峰处的C O S 伸缩振动吸收峰；9 3 0e m 以吸收峰处的3，6 一内醚D 半乳糖中C O-C 的伸缩振动吸收峰，这说明卡拉胶经氧化降解后基本单元结构均没遭到破坏。4 0 0 03 5 0 03 0 0 02 5 0 02 0 0 01 5 0 01 0 0 05 0 0波数W a v en u m b e r s(e r a-1)图lf 8)原料卡拉胶、fb)1 8 9 0 一K C 和(c)4 5 5 0 一K C 的红外光谱图F i g,lI Rs p e c t r ao f(a)K C，(b)1 8 9 0 一K Ca n d(e)4 5 5 0-K C2 2 低分子量K。卡拉胶马来酰衍生物的结构表征图2 是原料卡拉胶及两种不同分子量卡拉胶马来酰基化衍生物的红外光谱图。图中可以看出，卡拉胶马来酰衍生物保留有原料卡拉胶的三个特征吸收峰，这表明卡拉胶经过马来酰基化后，其结构单元也未发生变化。卡拉胶马来酰衍生物在1 7 4 0、1 5 8 0和1 4 3 0c l n d 处出现特征吸收峰，1 7 4 0c n l 1 吸收峰归 万方数据1 0 3 0天然产物研究与开发属于经马来酸酐酰化后形成的酯基的特征吸收，表明生成了马来酰化卡拉胶；而1 5 8 0 和1 4 3 0c m。1 处的吸收峰则分别是由马来酰基中C O O 的不对称伸缩振动和对称伸缩振动引起的，1 6 5 0c m d 的特征吸收峰归属于C=C。综上可知：卡拉胶低聚糖在与马来酸酐进行反应时生成了卡拉胶马来酰基衍生物 7】。G P C 结果表明：卡拉胶低聚糖平均分子量分别为1 8 9 0 和4 5 5 0，其相应的马来酰化衍生物平均分子量分别为3 5 9 6 和6 2 1 0。4 0 0 03,5 0 03 0 0 02 5 0 02 0 0 01 5 0 0 1 0 0 05 0 0波数W a v e n u m b e r s(c m。)图2(a)原料卡拉胶、(b)3 5 9 6 M K C 和(c)6 2 1 0 一M K C 的红外光谱图F i 昏21 Rs p e c t r ao f(a)K C，(b)3 5 9 6-M K Ca n d(c)6 2 1 0 M K C2 3 抗氧化性能的测试自由基又叫游离基，在正常情况下，体内自由基的产生和清除是平衡的，一旦自由基产生过多或抗氧化体系出现故障，体内自由基代谢就会出现失衡。过剩的自由基可以损伤神经系统，引发老年痴呆、震颤麻痹等症状归川，故对自由基的及时清除十分重要。2 3 1超氧阴离子自由基O；清除超氧阴离子是一类较毒的活性氧，由多种生物反应和光化学反应产生，它还能分解形成更强的活性氧物质，如单线态氧和羟自由基，导致脂质过氧化。邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O 彳，生成有色的中间产物。当有自由基清除剂剂存在时，可清除O；，阻止中间有色产物的积累2 l。图3 描述了分子量为1 8 9 0 的卡拉胶低聚糖(1 8 9 0 K C)及其马来酰化衍生物(3 5 9 6 一M K C)对超氧阴离子O i 清除效果图。由图可知，它们对超氧阴离子O；的清除活性随着浓度的升高而逐渐增强，其对于超氧阴离子自由基的半抑制浓度I C 卯(对自由基清除率为5 0 时所需要的自由基清除剂浓度)分别为1 8 4 和0 4 5v L m o l m L。由此可知，卡拉胶低聚糖经过马来酰基化后对超氧阴离子O；的清除能力得到增强。这主要是由卡拉胶海藻多糖的特性所决定的，它的抗氧化活性o 一少轰：隰cC o n c e n t m t i o n(u m o l m L)图31 8 9 0 K C(一)及3 5 9 6-M K C()对超氧阴离子0 f 的清除F i g 30 2 s c a v e n g i n ga b i l i t i e so f1 8 9 0 一K C(_)a n d3 5 9 6-M K C()图4 描述了分子量为4 5 5 0 的卡拉胶低聚糖(4 5 5 0-K C)及其马来酰化衍生物(6 2 1 0-M K C)对超氧阴离子O；清除效果图。由图可知，它们对于超氧阴离子自由基的半抑制浓度I C 分别为1 3 5 和0 4 3I J,m o l m L。竺二=矿一C o n c e n t r a t i o n(u m o V m L)图44 5 5 0 K C(-)及6 2 1 0 M K C()对超氧阴离子0；的清除F i g 40；s c a v e n 舀n ga b i l i t i e so f4 5 5 0 K C(_)a n d6 2 1 0-M K C()基团主要是羟基和硫酸基。根据对卡拉胶及其衍生物结构的分析可知3|：每个卡拉胶结构单元中有3个羟基、1 个硫酸基；经过降解之后的卡拉胶低聚糖保留了原有的羟基和硫酸基数量。在进行马来酰化的时候，马来酰基取代了其中一个羟基而接枝在结构单元上。而保留了原有其他位置上的羟基和硫酸基数量。这样可能会导致部分活性羟基被取代，使得活性羟基数量有所减少，但是在马来酰化后引入了吸电子基团一C O C H=C H C 0 0-，由于其吸电子作用可能使母体卡拉胶分子的电子云密度降低，使得O H 键更易断裂，提高了羟基中氢的活性，而更易与超氧阴离子自由基形成氢键，从而增强了其清除超氧阴离子O 主的能力。2 3 2 对过氧化氢的清除过氧化氢不是活性氧，但它能够形成毒性最大的羟基自由基，引发细胞膜中的不饱和脂肪酸发生过氧化反应，从而产生危害。图5 描述了分子量为 万方数据孙涛等：低分子量K 一卡拉胶马来酰基化衍生物的制备及抗氧化活性的研究1 0 3 11 8 9 0 的卡拉胶低聚糖(1 8 9 0 一K C)及其马来酰化衍生物(3 5 9 6 一M K C)对过氧化氢的清除效果图。由图可知，它们对过氧化氢的清除活性随着浓度的升高而逐渐增强，其对于过氧化氢半抑制浓度I C 卯分别为3 7 0 和0 0 6 8l x m o l m L。、r。3 弋。产-=-3 5 8 登9 6-M K C f-，。一。01234C o n c e n t r a t i o n(u m o l m L)图51 8 9 0 一K C(_)及3 5 9 6-M K C()对过氧化氢的清除F i g 5H 2 0 2s c a v e n g i n ga b i l i t i e so f1 8 9 0 一K C()a n d3 5 9 6 一M K C()图6 描述了分子量为4 5 5 0 的卡拉胶低聚糖(4 5 5 0 一K C)及其马来酰化衍生物(6 2 1 0-M K C)对过氧化氢的清除效果图。由图可知，其对于过氧化氢的半抑制浓度I C 5 0 分别为0 5 9 和0 0 6 6l,L m o l m L。0 00 20 40 60 8C o n c o n t r a t i o n(u m o l m L)图64 5 5 0-K C(一)及6 2 1 0-M K C()对过氧化氢的清除F i g 6H 2 0 2s c a v e n g i n ga b i l i t i e so f4 5 5 0-K C(-)a n d6 2 1 0 M K C()由此可知，卡拉胶马来酰化衍生物对过氧化氢的清除能力比其对应的低聚糖强得多。这可能同样由于马来酰化后引入了吸电子基团一C O C H=C H C 0 0 一，其吸电子作用可以使母体卡拉胶分子的电子云密度降低，使得0 一H 键更易断裂，提高了羟基中氢的活性，而更易与过氧化氢分子形成氢键，从而增强了其清除过氧化氢的能力。3结论用H：0：对K 卡拉胶进行氧化降解，再经过透析，筛选出两种不同分子量范围的卡拉胶，并通过化学手段将其与马来酸酐相结合成为卡拉胶马来酰基化衍生物。通过对其进行抗氧化性能的测试，K 卡拉胶经过马来酰基化后对超氧阴离子O；以及过氧化氢的清除能力都有所提高，对过氧化氢的清除率甚至比低聚糖高了1 0 倍左右。K 卡拉胶低聚糖及其马来酰基化衍生物所表现出来的优异抗氧化性能，为K 一卡拉胶的高值化利用和海洋多糖类药物的开发和研究提供有益的参考。参考文献1M e n gF L(孟凡玲)，L u oL(罗亮)，N i n gH(宁辉)，甜甜R e s e a r c hp r o s e s so fK-r 豫g e e n 锄P o l y mB u l(高分子通报)，2 0 0 3，5：4 9-5 6 2W a n gC Y(王长云)，G u a nH S(管华诗)A d v a n c e so fr e s e a r c h e so na n t i v i r a la c f i f i t i e so fp o l y s a c c h a r i d e s e a r r a g e e n a na n di t sa n t i v i r a la c t i v i t i e s P r o gB i o t e c h n o l(生物工程进展)，2 0 0 0，2 0(3)：3 9 4 2，4 8 3Q i a oQ L(乔庆林)P r o p e r t i e sa n da p p l i c a t i o n so fc a r r a g-n 瓶M e a tI n d u s(肉类工业)，1 9 9 8，1 1：3 0-3 4 4S o n gJ M(宋金明)2 1 t hc e n t u r yd e v e l o p i n gs t r a t e g yo f 眦一f i n en a t u r a la c t i v ep r o d u c t si nC h i n a M a rS c i(海洋科学)，2 0 0 1，2 5(4)：5 0-5 2 5C u z z o c r e aS，R i l e yD。C a p u t iA P A n t i o x i d a n t t he m p y：an wp h a r m a c o l o g i c a la p p r o a c hi ns h o c k，i n f l a m m a t i o n，a n di s e h e-m i a r e p e r f u s i o ni n j=-y P h a r m a c o lR e v，2 0 0 1，5 3：1 3 5 1 3 9 6G u oX K(郭锡坤)，T i a nX F(田秀芳)，甜以P r e p a r a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fO s u e e i n y ld e r i v a t i v eo fK-e a r r a g-e e n a n，S a n t o uU n i v(汕头大学学报)，2 0 0 6，2 1：2 3-3 2 7J i a n gY P，G u oX K 0 一m a l e o y ld e r i v a t i v eo fl o w m o l e e u l a r-w e i g h tK-e m z a g e e n a n：S y n t h e s i sa n dc h a r a c t e r i z a t i o n C a r b o-h y d rP o l y m，2 0 0 5，6 l：4 4 1 4 4 5 8S u nT(孙涛)，Z h o uD X(周冬香)，M a oF(毛芳)，e t 击F l o wi n j e c t i o ne h e m i h m i n e s e e n e ed e t e r m i n a t i o no ft h eS U-p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l0 2=a n dh y d r o x y lr a d i c a l O H S c fT e c hF o o dI n d u s(食品工业科技)，2 0 0 6，11：1 8 2 1 8 4 9F o r r e s tV J，K a n gY H，M e C l a i nD E，e ta O x i d a t i v es t r e s s i n-d u c e da p o p t e s i sp r e v e n t e db yt r o l o x F r e eR a d i cB i o lM e d，1 9 9 4，1 6：6 7 5-6 8 4 1 0H a U i w e l lB，G u t t e r i d g eJ M C，C r o s sC E F r e er a d i c a l s，a n t i o x i-d a n t sa n dh u m a nd i s e a s e：w h e r ea r ew en o w?Jl a bC l i nM e d，1 9 9 2，1 1 9：5 9 8-6 2 0 1 1P o o rW A O x i d a t i o na n da t t h r e e s e l e r o s i s F r e eR a d i cB i o lM e d，2 0 0 0，2 8：1 6 8 1 1 6 8 2 1 2F o r r e s tV J，l(a I I gY H，M e C l a i nD E，e t0 2 O x i d a t i v es t r e s s-i n-d u c e da p o p t e s i sp m v e n t e db yt r o l o x F r e eR a d&B i o lM e d，1 9 弓1 4 1 6：6 7 5-6 8 4 1 3W a n gC Y(王长云)，G uQ Q(顾谦群)，Z h o uP(周鹏)，e ta M o l e c u l a rm o d i f i c a t i o no fc a r r a g e e n a n，ap o l y s a c c h a r i d ef r o mr e ds e a w e e dK a p p a p h y e u ss t r l a m mI a c i d i cd e g r a d a-f i a n C h i nJM a rD r u g s(中国海洋药物)，2 0 0 3，3：2 4 2 7 掌3 a m8u16c。uo S u m oacaco，、B3s 万方数据低分子量-卡拉胶马来酰基化衍生物的制备及抗氧化活性的低分子量-卡拉胶马来酰基化衍生物的制备及抗氧化活性的研究研究作者：孙涛，陶慧娜，卢克祥，周冬香，毛芳，姚倩，SUN Tao，TAO Hui-na，LU Ke-xiang，ZHOU Dong-xiang，MAO Fang，YAO Qian作者单位：上海海洋大学食品学院海,上海,201306刊名：天然产物研究与开发英文刊名：NATURAL PRODUCT RESEARCH AND DEVELOPMENT年，卷(期)：2009,21(6)被引用次数：1次 参考文献(13条)参考文献(13条)1.孟凡玲;罗亮;宁辉 Research prosess of-carrageenan期刊论文-高分子通报 2003(05)2.王长云;管华诗 Advances of researches on antiviral activities of polysaccharides.carragcenan andits antiviral activities期刊论文-生物工程进展 2000(03)3.乔庆林 Properties and applications of carrageenan 1998(11)4.宋金明 21(th)century developing strategy of marine natural active products in China期刊论文-海洋科学 2001(04)5.Cuzzocrea S;Riley D;Caputi AP Antioxidantth empy:a new pharmacological approach inshock,inflammation,and ischemia/reperfusion injury 20016.郭锡坤;田秀芳 Preparation and characterization of O-succinyl derivative of-carrageenan期刊论文-汕头大学学报 2006(1)7.Jiang YP;Guo XK O-maleoyl derivative of low-moleularweight-carrageenan:Synthesis andcharacterization外文期刊 2005(4)8.孙涛;周冬香;毛芳 Flow injection chemiluminescence determination of the superoxide anion radical O2and hydroxyl radicalOH期刊论文-食品工业科技 2006(11)9.Forrest VJ;Kang YH;MeClain DE Oxidative stress-induced apoptosis prevented by trolox外文期刊199410.Halliwell B;Gutteridge JMC;Cross CE Free radicals,antioxidants and human disease:where are we now 199211.Pryor WA Oxidation and arthreosclerosis外文期刊 200012.Forrest VJ;Kang YH;MeClain DE Oxidative stress-induced apoptosis prevented by trolox外文期刊199413.王长云;顾谦群;周鹏 Molecular modification of carrageenan,a polysaccharide from red seaweedKappaphyeus striatum.acidic degradation期刊论文-中国海洋药物 2003(03)引证文献(1条)引证文献(1条)1.孙涛.朱云.卫颖隽.谢晶.陶慧娜.薛斌 不同取代度马来酰-卡拉胶的抗氧化活性研究期刊论文-上海海洋大学学报 2011(1)本文链接：http:/