大肠菌群复发酵培养基BGLB改进效果的测试.pdf

中国酿造2013 年 第 32 卷 第 5 期总第 254 期收稿日期：2 0 1 3-0 1-2 1基金项目：广东省重大科技专项（N o.2 0 1 2 A 0 8 0 2 0 3 0 1 4）；广州市发改委生物产业项目（穗发改 2 0 1 2 2 4 3 号）作者简介：刘云林（1 9 7 4-），男，工程师，主要从事微生物快速检测技术的研究工作；吴清平*，研究员，通讯作者。大肠菌群（C o l i f o r m）广泛存在于人和温血动物的肠道，并随粪便分布于自然界，故以其作为粪便污染食品的指示菌。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指示菌之一，也是食品卫生细菌学的必检项目，大肠菌群检测的准确性关系到食品卫生安全 1-2。目前食品安全国家标准G B 4 7 8 9.3-2 0 1 0 大肠菌群的检测都以煌绿乳糖胆盐肉汤培养基（简称B G L B）作为最终的确证培养基 3，即检测样品在进行月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（简称L S T）初发酵或结晶紫中性红胆盐琼脂（简称V R B A）平板分离后将可疑菌落接入B G L B 肉汤培养2 4 h 4 8 h 后观察是否产生气体作为判断大肠菌群阴阳性的标准。因此，B G L B 培养基能否将阳性细菌的产气情况准确、快速地体现出来，是衡量该培养基质量的一个重要特征。根据国际培养基质量控制标准I S O/T S 1 1 1 3 3-2 标准 4 规定，阳性质控菌在2 4 h 4 8 h 内产生的气体应该充满1/3 以上。在检验中发现，国产的商品化B G L B 培养基在接种阳性菌培养后容易产生大量的沉淀，一方面浑浊的培养液影响到小导管中气体的观察，另一方面大量的沉淀会堵塞小导管管口，影响对气体的收集，特别是气体产生量较少时，很容易引起结果的误判。这一领域的技术人员也对相关的培养基做过了一些研究及改良 5-1 1。基于已有的研究经验，针对B G L B 培养基存在的问题进行了改进，现将改进产品与国内外产品比较的效果报告如下。1 材料与方法1.1培养基环凯B G L B 改进培养基（H K MB G L B）、国内B G L B 培养基（B G L B-1）、国内B G L B 培养基（B G L B-2），国外B DB G L B 培养基（B DB G L B）、国外O X O I DB G L B 培养基（O XB G L B），这些对照产品从市场上采购。1.2实验菌株目标菌包括大肠埃希氏菌（E s c h e r i c h i a c o l i）A T C C 2 5 9 2 2、产气肠杆菌（E n t e r o b a c t e r a e r o g e n e s）A T C C1 3 0 4 8、弗氏柠檬酸杆菌（C i t r o b a c t e r f r e u n d d i i）A T C C 4 3 8 6 4；非目标菌为粪肠球菌（E n t e r o c o c c u s f a e c a l i s）A T C C 2 9 2 1 2，金黄色葡萄球菌（S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s）A T C C 6 5 3 8。1.3实验方法1.3.1培养基制作按照产品说明对各种培养基进行了称量，加入适量的去离子水后溶解、煮沸，分装试管，每管分装培养基1 0 m L，1 2 1、1 5 m i n 高压蒸汽灭菌，备用。大肠菌群复发酵培养基BGLB改进效果的测试刘云林1，卢勉飞1，蔡芷荷1，吴会桃1，容艳芬1，吴清平2*（1.广东环凯微生物科技有限公司，广东 广州 5 1 0 0 7 0；2.广东省微生物研究所，广东 广州 5 1 0 0 7 0）摘要：为评价改良的煌绿乳糖胆盐肉汤培养基（简称B G L B）的检测效果。参照I S O/T S 1 1 1 3 3-2 培养基质量控制标准的要求，比较改进后产品H K MB G L B 对大肠菌群标准菌株进行测试。改进产品H K MB G L B 与国外品牌B D 和O X O I D 同类产品对阳性菌培养后培养基仍然澄清透明，小导管的气体容易收集和观察，抑制革兰氏阳性（G+）球菌效果良好，检测灵敏度相当。关键词：B G L B；澄清度；大肠菌群中图分类号：Q93-335文献标识码：A文章编号：0254-5071（2013）05-0079-03T e s t i n g o f e f f e c t o f i m p r o v e d b r i l l i a n t g r e e n l a c t o s e b i l e b r o t hf o r c o l i f o r md e t e c t i o nL I UY u n l i n1,L UMi a n f e i1,C A I Z h i h e1,WUH u i t a o1,Y O N GY a n f e n1,WUQ i n g p i n g2*(1.G u a n g d o n g H u a n k a i Mi c r o b i a l S c i&T e c h C o.,L t d.,G u a n g z h o u,G u a n g d o n g 5 1 0 6 6 3,C h i n a;2.G u a n g d o n g I n s t i t u t e o f Mi c r o b i o l o g y,G u a n g z h o u,G u a n g d o n g 5 1 0 0 7 0,C h i n a)A b s t r a c t:O T oe v a l u a t e t h e d e t e c t i o ne f f e c t s o f t h e i m p r o v e dB G L Bm e d i u m,t h e e f f e c t s o f t h e i m p r o v e dH K M b r i l l i a n t g r e e nl a c t o s e b i l e(B G L B)m e d i u mw i t hB G L Bm e d i a f r o mo t h e r d o m e s t i c a n do v e r s e a s w e r e c o m p a r e da c c o r d i n gt oI S O/T S 1 1 1 3 3-2s t a n d a r do f q u a l i t yc o n t r o l m e t h o df o rc u l t u r e m e i d a.T h e c l a r i t y a n d g a s p r o d u c t i o n o f t h e i m p r o v e d H K MB G L Bm e d i u mw e r e a s s a m e a s t h e B Da n d O X O I D,b e t t e r t h a n o t h e r d o m e s t i cp r o d u c t s,a n d t h e s e l e c t i v i t y a n d s e n s i t i v i t y o f t h e i m p r o v e d H K MB G L Bw e r e a s s a m e a s o t h e r f o u r p r o d u c t s.K e y w o r d s:B G L B;l i m p i d n e s s;c o l i f o r m研究报告79China Brewing2013 Vol.32 No5Serial No2541.3.2实验菌液的准备取上述实验菌株分别接种营养琼脂斜面，于（3 6 1）培养1 8 h 2 4 h，取适量培养物加入8.5 g/L 无菌生理盐水中，混匀，制成一定浓度的菌悬液，并用8.5 g/L 生理盐水进行逐级1 0 倍稀释，取适宜稀释度的菌悬液0.3 m L 用于增菌试验。1.3.3选择性增菌试验1）目标菌的接种：参照I S O/T S 1 1 1 3 3-2 标准对培养基灵敏度的要求，目标菌的接种量为1 0 c f u/管 1 0 0 c f u/管。取大肠埃希氏菌A T C C 2 5 9 2 2、产气肠杆菌A T C C 1 3 0 4 8、柠檬酸杆菌A T C C 4 3 8 6 4 已制备好的上述1 0-7 1 0-8菌悬液各1 m L加入供试的5 种B G L B 培养基中，每种接3 支平行试管，同时取等量的菌悬液（与试管接种同一稀释度）倾注T S A 平板，用于确定增菌培养的接菌量。增菌培养基以及计数培养基均培养于（3 6 1）的恒温培养箱中，其中增菌培养基培养2 4 h 4 8 h，T S A 计数平板培养1 8 h 2 4 h。2）非目标菌的接种：参照I S O/T S 1 1 1 3 3-2 标准对灵敏度的要求，非目标菌的接种量为 1 0 0 0 c f u/管。取粪肠球菌A T C C 2 9 2 1 2，金黄色葡萄球菌A T C C 6 5 3 8 已制备好的上述1 0-6菌悬液1 m L 分别接种各试管，接种量计数及培养条件与目标菌相同。2 结果本试验从目标菌的灵敏度（产气情况），非目标菌的选择性以及影响结果观察的培养基外观（沉淀产生）三方面进行了比较，具体结果分别见表1、表2 和表3。2.1目标菌的灵敏度试验从表1 的结果可看，3 株目标菌在5 个厂家的培养基中培养2 4 h 时，产气能力均较差，产气量均未达到1/3 小导管，继续培养至4 8 h 后，除产气肠杆菌A T C C 1 3 0 4 8 在B DB G L B中未达到1/3 外，其他目标菌在5 个厂家的培养基中均达到1/3 小导管，就同一株目标菌而言，5 个厂家的培养基无明显差别，检测灵敏度相当。2.2非目标菌的选择性试验从表2 可见，2 株非目标菌在5 个厂家的培养基中培养2 4 h 时，除了O XB G L B 对粪肠球菌A T C C 2 9 2 1 2 抑制性较差，试管中的培养基有轻微生长浑浊外，其他4 个厂家的产品对2 株非目标菌均有很好的抑制效果。2.3增菌液培养后的外观从表3 可见，H K MB G L B、B DB G L B 和O XB G L B 增菌液澄清透明，无沉淀产生，试管中小导管的气体很容易观察；而B G L B-1 和B G L B-2 厂家的增菌液有明显的胆酸浑浊，沉淀量较多，小导管中的产气情况不易观察。3 讨论大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，不代表某一个或某一属细菌，而是指具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为需氧及兼性厌氧、在3 7 能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。一般认为该群细菌可包括大肠杆菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等 1-2。所以，为评价改进后B G L B 的效果，选取了基本上能代表大肠菌群的3 种菌：大肠埃希氏菌A T C C 2 5 9 2 2、柠 檬 酸 杆 菌 A T C C 4 3 8 6 4 和 产 气 肠 杆 菌A T C C 1 3 0 4 8 作为目标菌株进行试验。结果表明，在培养温度及相同时间情况下，3 种菌的产气情况并不相同，可能与这几种菌利用乳糖的能力有关 1 2，也可能与开始接种的菌落数多少有关，在一般情况下，接种量越大，增菌效果越好，产气越多，故为了评价一种培养基的性能及灵敏度，正如I S O/T S 1 1 1 3 3-2 所要求，接种量需控制在合适的范围（1 0 c f u 1 0 0 c f u）。B G L B 作为一种复发酵培养基，其的功能除了使大肠注：*目标菌的产气情况的计算方法为气体充满整个小导管计为1 0/1 0，充满半个小导管计为5/1 0，以此类推。表 1BGLB 的灵敏度试验Table 1 Sensitivity test of BGLB培养时间/h菌株编号接种量/（c f u 1 0 m L-1）试验培养基产气体积比*H K MB G L BB G L B-1B G L B-2B DB G L BO XB G L B2 4 A T C C 4 3 8 6 42 30.7/1 00.1/1 00.5/1 01.8/1 00.1/1 0A T C C 1 3 0 4 81 30.4/1 0 0.1 7/1 0 0.2/1 00.3/1 00.6/1 0A T C C 2 5 9 2 25 92.2/1 01.3/1 01.8/1 00.6/1 01.5/1 04 8 hA T C C 4 3 8 6 42 36.0/1 05.7/1 05.3/1 07.3/1 06.3/1 0A T C C 1 3 0 4 81 34.3/1 04.1/1 04/1 02.2/1 04.3/1 0A T C C 2 5 9 2 25 97/1 06.3/1 04.7/1 06.8/1 04.5/1 0注：*培养时间4 8 h 与2 4 h 的结果无明显差异，省略，非目标菌的生长情况用用C 值表示，C=0 表示澄清，C=1 表示很轻的浊度，C=2 表示严重的浊度。表 2BGLB 的选择性试验Table 2 Selective test of BGLB培养时间菌株编号接种量/（c f u 1 0 m L-1）阳性质控菌生长情况（C）*H K MB G L BB G L B-1B G L B-2B DB G L BO XB G L B2 4 hA T C C 2 9 2 1 2 2 2 3 00，0，00，0，00，0，00，0，01，1，1A T C C 6 5 3 8 2 7 5 00，0，00，0，00，0，00，0，00，0，0注：*培养时间4 8 h 与2 4 h 的结果无明显差异，省略，目标菌生长后的沉淀情况用C 值表示，C=0 表示澄清，C=1 表示轻微的沉淀，C=2表示明显的沉淀。表 3增菌液培养后的沉淀情况Table 1 Sediment after enrichment strain culture培养时间菌株编号接种量/（c f u 1 0 m L-1）增菌液产生沉淀情况*H K MB G L BB G L B-1B G L B-2B DB G L BO XB G L B2 4 hA T C C 4 3 8 6 42 302200A T C C 1 3 0 4 81 302100A T C C 2 5 9 2 25 902200R e s e a r c h R e p o r t80中国酿造2013 年 第 32 卷 第 5 期总第 254 期笠 广 告 笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠笠菌群在其中得到增殖及产气外，也肩负着使试管中可疑的非大肠菌群受到抑制而无法在其中生长 1 2，从而排除假阳性或避免与目标菌竞争性生长产生干扰。所以，判断B G L B 的优劣，除了看对目标菌的灵敏度外，还需关注其对非目标菌的抑制性能。在试验中选取了2 株革兰氏阳性（G+）球菌来测试各个厂家的B G L B 的选择性高低。结果表明，对金黄色葡萄球菌A T C C 6 5 3 8，5 个厂家的产品均可以达到理想的抑制效果，均没有生长的迹象；但对于粪肠球菌A T C C 2 9 2 1 2，O XB G L B 有轻微生长产生浑浊，其他厂家产品未见生长。这一结果说明，相对于金黄色葡萄球菌，粪肠球菌更难于抑制，但粪肠球菌也广泛存在于人、畜粪便中，所以，选择性良好的培养基应该把该菌抑制住。作为一种依靠产气情况来判断阴阳性的培养基，观察结果时培养基的外观也就比较重要。目前，国内厂家生产的B G L B 培养大肠菌群后，往往会出现底部浑浊沉淀的现象，这种现象是由于培养基中含有作为抑制剂的胆盐，而大肠菌群利用培养基中的乳糖后产酸，导致培养基的p H 值下降，胆盐在酸性条件下容易引起胆酸沉淀的原因 1 2。国外的B G L B 不存在此不良现象，从而推测为国内外胆盐的质量直接影响了培养基的外观性能。本实验中改进后的H K MB G L B，是选用经过前期研究后通过精制的优质胆盐代替了原来配方中所用的一般国产胆盐，故效果良好。参考文献：1 孙玉焕，骆永明，吴龙华，等.长江三角洲地区污水污泥与健康安全风险研究粪大肠菌群数及其潜在环境风险 J .土壤学报，2 0 0 5，4 2（3）：3 9 7-4 0 3.2 磨伟，于澎，张阅平，等.浑河抚顺段水质粪大肠菌群污染现状研究 J .环境科学与管理，2 0 0 6，3 1（7）：7 6-7 8.3 G B4 7 8 9.3-2 0 1 0 食品微生物学检验-大肠菌群计数 S .4 I S O/T S1 1 1 3 3-2:2 0 0 3.Mi c r o b i o l g yo f f o o da n da n i m a l f e e d i n gs t u f f s-G u i d e l i n e s o n p r e p a r a t i o n a n d p r o d u c t i o n o f c u l t u r e m e d i a-P a r t 2:p r a c t i-c a l g u i d e l i n e o n p e r f o r m a n c e t e s t i n g o f c u l t u r e m e d i a.5 刘莉.大肠菌群检测中应注意的关键问题探讨 J .辽宁医学院学报，2 0 1 0，3 1（5）：4 5 9-4 6 0.6 李晶晶，潘慧华，胡汪洋，等.大肠菌群测定初发酵培养基的改进 J .中国食品学报，2 0 0 6，6（1）：1 5-1 9.7 潘慧华，李晶晶，刘坚真.大肠菌群一步发酵法检测的研究 J .食品科学，2 0 0 6，2 7（1 2）：6 3 7-6 4 1.8 周曼.关于提高食品中大肠菌群检出率的探讨 J .标准计量与质量，2 0 0 3（1 2）：1 7-1 8.9 林凤.纸片法与发酵法检测食具大肠菌群的实验研究 J .中国卫生检验杂志，2 0 0 6，6（6）：6 9 6-6 9 7.1 0 绪红霞，陈秀华，吴菊英，等.纸片法与发酵法检测大肠菌群的比较研究 J .现代中西医结合杂志，2 0 0 9，1 8（2 8）：3 4 9 2-3 4 9 3.1 1 卢勉飞，蔡芷荷，吴清平，等.显色培养基快速检测大肠菌群和大肠杆菌效果的研究.中华预防医学杂志，2 0 0 7，4 1（4）：3 0 7-3 1 0.1 2 陈天寿.微生物培养基的制造与应用 M.中国农业出版社，1 9 9 4.研究报告81