UPLC_MS_MS同时测定固体_省略_料中9种甜味剂及筛查数据库的建立.pdf

为保障进出口食品安全，提升固体饮料中常用甜味剂的筛查效率，为口岸监管执法提供快速、准确的实验结果，保证贸易和供应顺畅，本研究建立了固体饮料中 9 种甜味剂的超高效液相色谱-串联质谱测定方法（UPLC-MS/MS）。试样经甲醇-水（1 1，体积比）提取后，采用 HLB 固相萃取小柱净化，采用 ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1100 mm,1.7 m）进行分离，多反应选择离子检测。本实验利用超高效液相串联质谱仪的动态多重反应监控模式，在同一分析时间下快速扫描完成 9 种甜味剂的筛选，针对疑似检出的阳性物质以触发式多重反应监控模式，得到二级质谱图，通过自建数据库的比对得到匹配相似度值以作为定性确认。方法学验证结果表明，所有化合物均得到良好的线性关系，标准曲线回归系数()均大于0.9995，回收率范围为72.4103.4，精密度在0.85.4之间。本方法简单、快速、灵敏度高，并具有良好的精密度与准确度，能满足固体饮料中甜味剂测定的要求。关键词 超高效液相色谱-串联质谱；固体饮料；甜味剂；筛查数据库Simultaneous Determination of 9 Sweetener in Solid Drinks by UPLC-MS/MS and the Establishment of Screening DatabasePENG Bi-Ning1 CAI De-Ling1 YANG Chen2 ZENG Wen-Xiang1 ZENG Jun-Jie1 ZENG Chuan1Abstract In order to ensure the safety of imported and exported food,improve the screening efficiency of commonly used sweeteners in solid drinks,provide rapid and accurate experimental results for port supervision and law enforcement,and ensure the smooth trade and supply,this study established an ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the determination of nine sweeteners in solid drinks.The samples were extracted by methanol-water(1 1),purified by HLB solid-phase extraction column,separated by acquity UPLC BEH C18 column(2.1 100 mm,1.7 m),and detected by multi reaction selective ion.In this experiment,the dynamic multiple reaction monitoring mode of ultra-high performance liquid-phase tandem mass spectrometer was used to quickly scan nine sweeteners at the same analysis time.For the suspected positive substances,the trigger multiple reaction monitoring mode was used to obtain the secondary mass spectrum,and the matching similarity value was obtained through the comparison of self-built database for qualitative confirmation.The results of methodological validation showed that all the 54CHINA PORT SCIENCE AND TECHNOLOGY我国社会经济水平和科技实力不断发展，食物作为人类提供能量和摄入营养的重要来源，现代消费者对于食物的要求也随之提高。甜味剂是一种现代全球范围被广泛使用的食品添加剂，主要包括阿斯巴甜、糖精钠、AK 糖、阿力甜、和纽甜等。研究表明，过多的摄入甜味剂损害人体的肝脏和神经系统，容易引发癌症。因此，合理使用甜味剂，不仅能够得到消费者的喜爱，还能保障消费者的食品安全和身体健康1。固体饮料在饮料分类中被划分在软饮料类别，可大致分类为蛋白型和普通型。蛋白型指蛋白质在4%以上的制品，普通型是指蛋白质含量 4%以下的制品2。某些食品企业为了使其产品有更好的口感和更好的功能效果，不惜违规滥用添加剂，甚至添加禁止的添加剂，最后导致的结果是损害消费者利益。因此，为了快速检测甜味剂是否存在非法添加问题、节省成本以及时间费用，保障加工原料和成品的安全，并有效进行产品的风险评估分析。本实验针对特定几种甜味剂建立数据库，并有效收集各类甜味剂，尤其是新型甜味剂的化学性质、物理性质、架构和甜味特征等数据。在目前检测手段中，紫外分光光度法、液相色谱法(UPLC)，液质联用(UPLC-MS/MS)是分析甜味剂的主要方法，其中主要是 UPLC 和 UPLC-MS/MS。因为多种甜味剂混合物性质不同，主要是物理、化学、电化学和光谱方面的差别。因此，在测定多种复合甜味剂固体饮料时，紫外分光光度法通常只能分析一种甜味剂或几种简单甜味剂混合物，液相色谱法存在检测时间较长、前处理复杂、成本昂贵、出峰重叠的问题3。检索多个文献4-6，目前常用的甜味剂种类繁多，因此也导致设计的检验方法多种多样，例如GB 5009.8-2016、GB 5009.245-2016、GB 5009.28-2016、GB 5009.247-2016、GB 5009.255-2016、GB 5009.263-2016、GB 5009.279-2016、SN 3538-2013、SN 3142-2012、SN/T 3850.1-201DBS 52-2014 等各种检验方法。由于检测方法可能因为不同国家、地域、行业的不同，甜味剂的检测方法出现差别，例如：前处理和检测条件要求参差不齐，所用仪器也不相同，有液相、离子色谱、液质联用等，目标物的最低检出限存在差异，有些是几倍甚至几百倍差异。对于复合甜味剂更要进行多次检测，存在周期长，成本高，效率低等问题，为提高食品安全等级，快速、准确、安全检测复合甜味剂食品，同时减少企业对产品的检测成本，使消费者安心，固体饮料中甜味剂数据库的建立及其检测方法优化是大势所趋。为了提高检测复合使用的甜味剂效率，提高食品质量安全，保障消费者权益，本文以固体饮料中的甜味剂为研究对象，开展对固体饮料中常见的 9 种甜味剂，包括乙酰磺胺酸钾，又称 AK 糖；环己基氨基磺酸钠，又称甜蜜素；糖精钠，又称糖精；三氯蔗糖，又称蔗糖素；L-天冬氨酞-L-苯丙氨酸甲酷(APM)，又称阿斯巴甜；N-N-(3，3 一二甲基丁基)-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸-1-甲酯，又称纽甜；L-天冬氨酰-D-丙氨酰胺，又称阿力甜；甜菊糖苷，又称甜菊糖；以及新型甜味剂新橙皮苷二氢查尔酮(NHDC)检测方法的研究，主要通过各种前处理方法(包括 SPE 处理)，提取各种固体饮料中的多种甜味剂，并用液相色谱-串联质谱进行定量检测，研究优化各种前处理参数、仪器方法参数等，得出最佳方案并加以优化，建立数据库。从而使企业在生产和研发过程中对使用的甜味剂的种类和添加水平做出全面详细分析，同时为保障进出口食品的安全，提升固体饮料中常用甜味剂的筛查效率，为口岸监管执法提供快速、准确的实验结果，保证贸易和供应的顺畅。compounds had good linear relationship.The regression coefficient(R)of standard curve was more than 0.9995,the recovery range was 72.4%-103.4%,and the precision was between 0.8%5.4%.The method is simple,rapid,sensitive,and has good precision and accuracy.It can meet the requirements of the determination of sweetener in solid drinks.Keywords UPLC-MS/MS;solid drinks;sweetener;screening database55中国口岸科学技术1 实验部分1.1 材料与试剂20 份固体饮料样品（泡腾片、冲调饮料）市购。甲醇、乙腈（色谱纯）德国 Merker 公司；乙酰磺胺酸钾、糖精钠、环己基氨基磺酸钠、三氯蔗糖、L-天冬氨酞-L-苯丙氨酸甲酷(APM)、阿力甜、纽甜、甜菊糖苷及新橙皮甙二氢查尔酮标准品，纯度均 99.5%，均购于德国 Dr.Ehrenstorfer 公司。1.2 仪器与设备ACOUITY UPLC Xevo TQ-S 三重四极杆超高效液相色谱质谱联用仪（美国Waters公司）电喷雾离子源（ESI），Masslynx 4.1 数 据 处 理 系 统(美国 Waters 公司)；IKA MS 3 basic 微型混合器等实验室常用设备。1.3 实验条件1.3.1 标准储备溶液和标准工作溶液的配制准确称取 0.1000 g，安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、纽甜、甜菊糖苷及新橙皮甙二氢查尔酮 9 种标准品，各加甲醇-水（11，体积比）并定容至 100 mL，各标准品溶液含量为 1.00 mg/mL，于 4的冰箱中备用。临用前，恢复至室温使用。取混合对照品溶液适量，以甲醇-水（11，体积比）溶液逐级稀释为系列对照品标准溶液（质量浓度为 100、500、1000、1500、2000 ng/mL）。1.3.2 样品制备称取 2.5 g（精确至 0.01 g）样品于 100 mL 容量瓶，用水-甲醇（11）稀释并定容至标线，超声25 min，待净化。净化：取 HLB 固相萃取小柱，用 5 mL 水、5 mL甲醇依次活化，淋洗液弃去。加 5 mL 水继续淋洗，弃去洗脱液。取提取液 10 mL 过柱，弃去流出液。加5 mL 超纯水淋洗，淋洗液弃去，抽干。量取 10 mL甲醇加入洗脱，控制流速 0.6 mL/min，采集洗脱液至刻度离心管，进行氮吹，温度设置为 40，浓缩至 0.5 mL，加甲醇-水（11，体积比）并定容至 1.0 mL，过 0.45 m 有机滤膜，滤液待测定。1.3.3 液相色谱分析条件 色 谱 柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 柱（2.1100 mm,1.7 m）；流动相：甲醇（A）+20 mmol/L 乙酸铵（B）；流速：350 L/min；柱温：45；进样量：10 L；梯度洗脱程序见表 1。表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient program时间（min）01.05.08.08.0110.010.0120.020.0130.0A（%）15.060.080.080.090.090.095.095.015.015.0B（%）85.040.020.020.010.010.015.015.085.085.01.3.4 质谱条件电离方式：ESI+，ESI-；检测方式：多重反应监测（MRM）；毛细管电压：3.0 kV；喷雾电压：4500 V；脱溶剂气温度：375；脱溶剂气流量：700 L/h；离子源温度：500；锥孔电压：ESI+20 V 100 V（增量为 20V），ESI-105 V；筛选条件：UPLC/MS ESI+m/z 55 680，ESI-m/z 200 680。目标化合物的质谱分析参数见表 2。56CHINA PORT SCIENCE AND TECHNOLOGY2 结果与分析2.1 优化流动相的选择及洗脱条件的优化分别比较两种流动体系，分别是乙腈(A)-乙酸铵溶液(B)（20 mmol/L）、甲醇(A)-20 mmol/L 乙酸铵溶液(B)，分别考察其对 9 种甜味剂的分离效果的影响程度。对比两种流动体系结果（图1-A、图1-B），乙腈(A)-20 mmol/L 乙酸铵溶液(B)，由于保留时间相近，极性相近，同时待分离的一些甜味剂几个组分出峰重叠，分离效果不理想。对比甲醇(A)-20 mmol/L乙酸铵(B)体系洗脱能力，甲醇相对于乙腈效果更强，在本研究的 9 种甜味剂中，分离效果比较好。因此，为了得到更好的分离效果，本研究选择流动相体系为甲醇-20 mmol/L 乙酸铵。为更好分离 9 种甜味剂，尝试优化甲醇(A)-20 mmol/L 乙酸铵(B)为流动相的洗脱条件。根据下面的色谱图（图 1-C），对比等梯度洗脱和梯度洗脱，等度洗脱出现组分重叠的现象，因此通过梯度洗脱的方法解决“共流出”问题，不断实验完善梯度洗脱程序中甲醇-乙酸铵的比例。最终梯度洗脱程序见表 1。表2 9种甜味剂的质谱参数Table 2 Mass spectrum parameters of 9 Sweetener序号化合物中文名参考保留时间母离子(m/s)子离子(m/s)去簇电压(eV)碰撞能量(eV)1甜蜜素12.6178.080.1*-27-33178.0-52糖精钠10.0182.241.8*-65-4462.1-303安赛蜜8.2161.878*-30-4182-194阿斯巴甜20.2293.3200.0*-63-22261.4-155阿力甜24.5330.3312.2*-80-19167.3-306纽甜28.9377.4200.3*-65-26345.3-197三氯蔗糖11.3395.1361.1*-80-10359.2-258甜菊糖苷9.4803.4641.3*-8831479.3219新橙皮甙二氢查尔酮27.0610.9302.5*-70-30610.7-5注：其中*标注的特征碎片离子是用来进行定量分析的离子57中国口岸科学技术图1 乙腈(A)-20mmol/L乙酸铵(B)梯度洗脱(A)；甲醇(A)-20mmol/L乙酸铵(B)梯度洗脱(B)；50%甲醇等度梯度洗脱色谱图(C)Fig.1 gradient elution of acetonitrile(a)-20 mmol/L ammonium acetate(b)(a);gradient elution of methanol(a)-20 mmol/L ammonium acetate(b)(b);50%methanol isocratic gradient elution chromatogram(c)2.2 质谱条件的优化考虑到 9 种目标物的极性差别，采用电喷雾离子源(ESI)，通过全扫描模式选择响应高，接近目标物分子的电离方式的母离子，之后对比不同离子模式下的响应程度。最终结果显示，在负离子电离模式下响应度较高。在前面结论的基础上进行一级质谱分析（Q1 扫描）。再针对碰撞电压、离子源温度、气帘气等参数进行检测。而锥孔电压、去簇电压、碰撞电压等质谱参数通过 MRM 负离子模式进行优化取得。进行定性和定量分析以丰度较强的子离子为特征离子，以母离子与子离子组成监测离子对。优化后质谱参数见表 5。通过优化方案的选择确定电离方式和准分子离子峰，针对锥孔电压条件进行完善，得到各目标化合物多反应监测(MRM)色谱图的最佳参数。2.3 方法学考察以优化条件为基础，配制标准系列(n=5)，设定横纵坐标为分析化合物的浓度比(X)-峰面积比）绘制标准曲线。得到标准工作曲线，以三倍信噪比作为最低检出限，9 种甜味剂浓度 0.010.2mg/L 范围内，相关系数 0.9995，达到定量分析条件。其相关系数和回归方程见表 3。2.4 回收率与精密度选取固体饮料样品（经检测不含有待测组分的实际样品），在 3 个水平质量浓度下（0.5、1.0、5.0 mg/mL）取 5 份样品，平行实验 6 次，计算平均回收率及 RSD。结果表明：9 种甜味剂的平均回收率在72.4%103.4%区间内，RSD 在 0.8%5.4%区间内，实验结果如表 4。2.5 数据库的建立与应用本实验利用超高效液相串联质谱仪的动态多重反应监控(DMRM)模式，在同一分析时间下快速扫描完成多种甜味剂的筛选，再针对疑似检出的甜味剂以触发式多重反应监控(triggered MRM,tMRM)模式，得到二级质谱图，在数据库中保存化合物的特征信息。自建数据库的比对得到匹配相似度值以作为定性确认。当某甜味剂成分的主离子峰强度超过设定的限度时，次级离子立刻被触发，采集开始，最后得到 tMRM 子离子图谱，透过自建数据库之比对可得到匹配相似度值，作为定性确认之依据，此时标记为绿灯，表明软件判定代表性样品检出了甜蜜素。58CHINA PORT SCIENCE AND TECHNOLOGY目前 9 种甜味剂的超高效液相串联质谱仪数据库建立已经完成，提高了筛查的效率和准确性。2.6 方法应用用于固体饮料中分析 9 种甜味物质的 UPLC-MS/MS 测定分析方法，通过筛查软件 QuanpediaTM将原始数据导入，根据软件中已经建好的筛查数据库和筛查方法进行快速自动筛查，并使用 Masslynx 4.1 数 据 处 理 系 统对阳性样品进行定量分析。在总计 7 批次样品中检出 5 批阳性样品，检出率为 71，检测到的甜味剂均为甜蜜素。样品结果（见图3），甜味剂添加物含量（见表5）。本研究方法简单、准确，满足国家关于食品甜味剂的标准要求。本研究还建立了 9 种甜味剂的质谱数据库，为甜味剂快速筛查提供较为完善的数据库。表3 9种甜味剂的线性方程，相关系数及检测限Table 3 Linear ranges,correlation coefficients(r)and limits of quantification(LOQ)for 9 sweeteners序号组分名称保留时间/min线性方程相关系数（r）检出限/（g/g）（RSN3）1甜蜜素12.6Y=12448X+5215.700.99952592糖精钠10.0Y=1238.01+1660.640.9996453安赛蜜8.2Y=33.5.32+4817.880.9995464阿斯巴甜20.2Y=60720.73-17244.200.9995385阿力甜24.5Y=72720.84+9177.650.9998466纽甜28.9Y=704828.51-10481.030.9998437三氯蔗糖11.3Y=443.77+147.160.999736.08甜菊糖苷9.4Y=33346-7056.930.9996259新橙皮甙二氢查尔酮27.0Y=8541.60-1237.300.999813表4 9种甜味剂的回收率与相对标准偏差(n=6)Table 4 Recoveries and relative standard deviation(RSD)of 9 sweeteners(n=6)序号名称检测方法0.5mg/L1.0mg/L5.0mg/L回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%1甜蜜素72.42.880.32.496.31.02糖精钠83.22.586.32.098.61.23安赛蜜79.83.483.42.499.81.64阿斯巴甜80.35.484.33.896.41.55阿力甜81.23.686.32.896.41.36纽甜95.62.898.61.9102.30.87三氯蔗糖84.64.398.41.3103.40.88甜菊糖苷88.93.298.61.4100.60.99新橙皮甙二氢查尔酮90.32.896.31.499.81.059中国口岸科学技术图2 样品检出结果Fig.2 sample detection results60CHINA PORT SCIENCE AND TECHNOLOGY表5 阳性固体饮料样品的检测结果Table 5 Test results of positive solid beverage samples样品编号检出成分含量/（g/g）样品3甜蜜素0.0126样品4甜蜜素0.0017样品5甜蜜素0.0018样品6甜蜜素0.0039样品7甜蜜素0.00383 结 论本研究建立了固体饮料中可能添加的 9 种甜味剂的 UPLC-MS/MS 测定方法。添加水平区间在0.010.2mg/L 内,平均回收率在 72.4%103.4%区间内，相对标准偏差(RSD)在 0.8%5.4%区间内。通过 HPLC 和 UPLC-MS/MS 两种不同的检测方法，比较其中差异，根据一系列的可靠数据结果，选择其中效率可靠度更高、速度更快的UPLC-MS/MS法，并对其操作过程中的流动相和质谱条件进行优化，同时建立 9 种甜味剂数据库，利用超高效液相串联质谱仪的动态多重反应监控模式，在同一分析时间下快速扫描完成 9 种甜味剂的筛选,针对疑似检出的阳性物质以触发式多重反应监控模式，得到二级质谱图，通过自建数据库的比对得到匹配相似度值以作为定性确认，有助于检测食品中 9 种甜味剂的快速筛选与定性确认，满足国家关于甜味剂的相关标准，为甜味剂快速筛查提供较为完善的数据库。【该文经 CNKI 学术不端文献检测系统检测，总文字复制比为 12.6%。】参考文献1 闫震,聂继云,李志霞,李静,程杨,SAQIB Farooq.超高效液相色谱-串联质谱法同时检测果汁中 7 种甜味剂 J.农产品质量与安全,2018(04):25-30+39.2 尹军峰.我国速溶茶产业创新发展趋势与主要技术需求 J.中国茶叶加工,2019(04):10-13+49.3 唐吉旺,袁列江,肖泳,王秀,王淑霞.固相萃取-高效液相色谱-质谱联用法同时测定食品中 9 种人工合成甜味剂 J.色谱,2019,37(06):619-625.4 孙立臻,周禹君,尹丽丽,刘艳明,祝建华.高效液相色谱法同时测定饮料中 10 种天然甜味剂 J.食品工业,2019,40(10):344-348.5 刘红,王林,胡博,李丽霞,黄伟,刘芸.超高效液相色谱-串联质谱快速测定饮料中 2 种生物碱和 6 种甜味剂 J.食品与发酵工业,2019,45(17):247-251.6 胡平,朱梦旭,丰荣鹏.食品中甜味剂分类及检测技术研究进展 J.食品安全导刊,2019(18):75-76+78.（文章类别：CPST-A)