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头孢他啶治疗下尿路及男性生殖系感染的疗效观察
【摘要】 6氨基青霉烷酸(6APA)是重要的抗生素药物中间体之一，目前均采用青霉素酰化酶酶促裂解青霉素获得。本文介绍近年来青霉素酰化酶催化青霉素水解的研究进展，青霉素酰化酶的性质及其催化机理，青霉素酰化酶的固定化方法，青霉素酰化酶反应器的设计，反应介质工程的研究进展。
【关键词】 青霉素酰化酶； 6APA； 双水相系统； 水有机相系统； 离子液体； 反应器设计
ABSTRACT As an important pharmaceutical intermediate in the production of βlactam antibiotics, 6aminopenicillanic acid is the product from enzymatic hydrolysis of penicillin with penicillin acylase. In this article, the recent development concering with the preparation of 6APA by hydrolysis of penicillin, catalytic mechanism of penicillin acylase, immobilization techniques and their carriers, twophase system for hydrolysis of penicillin, the design and optimization of bioreactor are reviewed.
KEY WORDS Penicillin acylase; 6APA; Aqueous two phase system; Biphasic system; Liquid inions; Design of reactor
　青霉素酰化酶(penicillin acylase，penicillin amidase，penicillin amidohydralse，EC )可以裂解青霉素获得重要的医药原料6氨基青霉烷酸(6APA)。在自然界中来源广泛，细菌、放线菌、酵母和高等真菌都可以产生青霉素酰化酶。
3 青霉素酰化酶催化生产6APA
6APA是β内酰胺抗生素工业中的重要中间体，经过结构修饰可以获得阿莫西林、氨苄西林等重要的抗生素药物。1970年，GistBrocades(后为DSM的子公司)开始化学法生产6APA，称为“Delft裂解”，这种化学工艺延续了10～20年，由于使用了大量的有毒害试剂，而且需要-40℃的低温，耗能严重，已经被淘汰。目前，工业生产6APA都已采用酶法裂解工艺，年产量已经达到20000吨以上［25］。由于6APA在β内酰胺抗生素工业中的重要作用及其巨大的市场，青霉素酰化酶生产6APA的新工艺和新技术不断涌现。
　两相系统中裂解青霉素的研究
(1)水有机相系统 青霉素在发酵结束后，需要在有机溶剂体系中且较低～的条件下进行萃取后成盐，通过结晶获得青霉素的钾盐或者钠盐，再进行溶解后进行酶法裂解。由于这个过程需要进行成盐结晶等复杂的操作，所以研究热点集中于青霉素萃取后在低的pH下直接在两相系统中进行酶法裂解，大大简化了操作工艺流程。两相系统中青霉素G、6APA和苯乙酸都会在两相中进行分配，苯乙酸在有机溶剂中的分配系数受pH影响很大，所以青霉素的水解平衡依赖于pH。在低的pH下，苯乙酸很容易被萃取到有机相中，6APA也可以得到结晶，导致产物的浓度不断降低，使反应向水解的方向进行，这样可以获得高的转化率。在正丁醇水双相系统中进行青霉素G的酶水解，通过多级逆流萃取可以获得较高收率［26］，在50mmol/L青霉素G的底物浓度，起始pH为的条件下，6APA收率可达94%［27］。pH较低时水解青霉素G将导致青霉素G和产物6APA的降解；较高的pH则有利于青霉素G和6APA的稳定，pH从提高到，6APA的降解常数从×10-3/h降低到×10-3/h，半衰期从也从82h提高到192h。同时，青霉素酰化酶在附近时具有较高的活性，较低的pH并不利于发挥酶的最大催化效率。另外在双相系统中萃取青霉素G的有机溶剂如正丁醇或甲基异丁基甲酮(MIBK)可导致酶的变性，在正丁醇饱和的水溶液下青霉素酰化酶悬浮32d活力下降了58%［28］。针对青霉素酰化酶的不稳定问题，采用反相胶团体系，将青霉素酰化酶包埋在AOT/异辛烷反胶团中，活力与水相相比有提高，水解6h后的转化率可达70%以上［29］。采用亲水化共价交联技术将固定化青霉素酰化酶进行处理，在酶的周围制造一个亲水的微环境［30］，这样固定化青霉素酰化酶在有机溶剂中的稳定性大大提高，选择甲基异丁基甲酮作为两相系统中的有机相，在32℃、的条件下悬浮400h，活力仅损失15%，6APA收率也可达到96%［31］。可以预言，两相系统的发展将会大大简化青霉素酰化酶水解青霉素G的传统工艺，使酶法生产6APA的成本大大降低。
(2)浊点系统 非离子表面活性剂溶液与离子型表面活性剂溶液性质不同，在达到一定的温度或者有添加物存在的条件下，溶液会自动分相形成表面活性剂浓度很小的稀相(dilute phase)和富含表面活性剂的凝聚层相(surfactantrich phase)，这个系统称为浊点系统(cloud point system)［32］。采用表面活性剂Tergitol TMN3形成浊点系统，在控制适当的～的条件下可以实现将青霉素和6APA分配于稀相，苯乙酸可以直接提取到凝聚层相，缓解产物的抑制作用，提高6APA的收率。同时，随着表面活性剂量的增加，6APA可以达到91%的收率［33］。Wang等［34］用摇瓶模拟了离散逆流反应器中青霉素酰化酶水解青霉素的实验，青霉素水解和苯乙酸提取可以同时进行。逆流作用形成pH梯度有利于青霉素水解过程的进行，但由于青霉素水解的最佳pH相对较高，产物萃取的最佳pH相对较低，所以要获得一个具有较高产物浓度，又有较高收率的反应是比较困难的。在浊点系统中，影响反应的主要因素有初始pH、底物浓度、表面活性剂与水溶液的比例以及固定化酶用量等。平衡pH受初始pH影响较大，对水有机相两相系统来说，浊点系统中容易保持相对较高的pH，水相中产物6APA的浓度较高［35］，同时青霉素酰化酶在较高的pH条件下也具有较高的稳定性［36］。浊点系统作为新型反应体系，具有使用的非离子表面活性剂是绿色溶剂，极性范围较高，对于中度极性的产物或底物容易进行分离，容易回收利用，商品化非离子表面活性剂较多且价格相对较低［37］，故浊点系统在青霉素水解中具有一定的工业应用前景［38］。
(3)双水相体系 双水相体系是指某些高聚物之间或者高聚物与无机盐之间在水中以适当浓度溶解后形成的互补相溶的两相或者多相体系。双水相体系已经被广泛应用于生物大分子物质的分离纯化，由于双水相体系具有界面张力小，传质阻力小，能够快速达到分离平衡，成相的高聚物通常采用PEG，PEG对于酶等生物活性物质不存在破坏作用，利用底物、产物的相分配系数不同来消除产物抑制，提高收率等优点，已经在生物催化领域得到重视，在生物分离领域具有广泛的应用前景。1984年，Andersson等［39］最早将双水相体系应用于青霉素的酶法水解，在% PEG 20000和%磷酸钾两相系统中研究了青霉素酰化酶水解青霉素，并对酶进行了多次回收使用。利用PEG20000和Dextran T70构成的双水相系统，37℃条件下，6APA收率高于90%，由于6APA可直接从上相进行结晶，简化了后期分离纯化工艺，最终得到96%纯度的6APA［40］。采用全细胞青霉素酰化酶催化水解青霉素G可以在PEG6000和磷酸钾构成的双水相体系中进行，细胞和底物分配在下相，产物都分配在上相，酶无需纯化，产物对酶活的抑制作用降低，有效降低生产成本。转化10批次以上细胞的青霉素酰化酶酶活力才开始降低［41］，全细胞催化制备催化剂比较简单，但缺点是催化剂的寿命较短，不能长期使用。最近，金科铭等［42，43］研究了在两种高聚物(PADB对pH敏感，PNBC对光敏感)中青霉素G的水解，虽然6APA的收率仅为85%左右，但是由于成相聚合物在反应后通过光照和pH变化进行回收，回收率达到了95%～98%，这样降低了成本，使双水相系统在生产6APA工艺中极具竞争力。
　　　离子液体系统中裂解青霉素的研究
离子液体是指在室温或者接近室温时完全由离子组成的液体物质。膜分离也是酶法生产6APA的主要技术之一，采用耦联超滤膜反应器进行青霉素G的酶法水解是可行的［55］，但是耦合膜反应器或者仅仅采用膜反应器的效果并不理想，特别是在高浓度底物的条件下，转化率较低，膜的成本也较高，所以出现了电膜反应器或者将膜反应器与电渗析相耦联的技术。Pribyl等［56］采用离子交换膜设计了电膜反应器，发现在优化条件下相对产率可以提高80%［57］，该反应器可以用于青霉素G的连续水解中［58］。
产量超过85%的6APA主要是采用青霉素G酰化酶水解青霉素G得到的。但Shewale［59］指出，如果采用青霉素V酰化酶水解青霉素V来获得6APA，则具有更大的优势，因为青霉素V在低pH条件下比青霉素G更稳定，能够避免青霉素V在较低pH条件下从发酵液中提取时所产生的降解；而且青霉素V酰化酶比青霉素G酰化酶具有更广泛的pH适应性和更高的稳定性，在水解反应中还可以得到更高的收率。
4 结语
由于青霉素类抗生素药物在临床上的广泛应用，青霉素酰化酶在医药工业中的重要作用将越来越大。因此，对反应器和反应介质的优化和创新的研究将会推动6APA的生产。筛选性能更优越的青霉素酰化酶产生菌株，进行发酵工艺优化获得高产也是其中的一个发展方向［60～62］。随着酶生产技术的发展，获得的青霉素酰化酶稳定性的不断提高，两相系统势必会在工业中得到应用，将导致6APA的生产成本大大降低。由于6APA的巨大产量，生产工艺中技术的任何革新都将给生产带来巨大的经济效益。我国是6APA的生产大国，在生产6APA的工艺和青霉素酰化酶上迫切需要加强研究并转化为生产力，这将有利于我国社会经济的发展。
【参考文献】
［1］ Sudhakaran V K, Borkar P S. Phenoxymethyl penicillin acylase: Sources and studyA sum up ［J］. Hin Antibiot Bull,1985,27(1～4):44～45.
［2］ Valle F, Balbas P, Merino E, et al. The role of penicillin amidases in nature and in industry ［J］. Trends Biochem Sci,1991,16(1):36～40.
［3］ Arroyo M, TorresGuzman R, TorresBacete J, et al. Chromogenic analogues of penicillin dihydroF and penicillin K for the continuous spectrophotometric determination of aliphatic penicillin acylase activity ［J］. Biotechnol Lett,2002,24(13):1045～1048.
［4］ Duggleby H J, Tolley S P, Hill C P, et al. Penicillin acylase has a singleaminoacid catalytic center ［J］. Nature,1995,373(6511):264～268.
［5］ Suresh C G, Pundle A V, SivaRaman H, et al. Penicillin V acylase crystal structure reveals new Ntnhydrolase family members ［J］. Nature Struct Biol,1999,6(5):414～416.
［6］ McVey C E, Walsh M A, Dodson G G, et al. Crystal structures of penicillin acylase enzymesubstrate complexes: Structural insights into the catalytic mechanism ［J］. J Mol Biol,2001,313(1):139～150.
［7］ Oinonen C, Rouvinen J. Structural comparison of Ntnhydrolases ［J］. Protein Sci,2000,9(12):2329～2337.
［8］ Tischer W, Kasche V. Immobilized enzymes: crystals or carriers? ［J］. Trends Biotechnol,1999,17(8):326～335.
［9］ Mateo C, FernandezLorente G, Abian O, et al. Multifunctional epoxy supports: A new tool to improve the covalent immobilization of proteins. The promotion of physical adsorptions of proteins on the supports before their covalent linkage ［J］. Biomacromolecules,2000,1(4):739～745.
［10］ KatchalskiKatzir E, Kraemer D M. Eupergit (R) C, a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential ［J］. J Mol Catal BEnzym,2000,10(1～3):157～176.
［11］ Mateo C, Abian O, FernandezLorente G, et al. Epoxy sepabeads: A novel epoxy support for stabilization of industrial enzymes via very intense multipoint covalent attachment ［J］. Biotechnol Prog,2002,18(3):629～634.
［12］ Bianchi D, Golini P, Bortolo R, et al. Immobilization of penicillin G acylase on aminoalkylated polyacrylic supports ［J］. Enzyme Microb Technol,1996,18(8):592～596.
［13］ Guisan J M. Aldehydeagarose gels as activated supports for immoblizationstablization of enzymes ［J］. Enzyme Microb Technol,1988,10(6):375～382.［14］ van Langen L M, Janssen M H A, Oosthoek N H P, et al. Active site titration as a tool for the evaluation of immobilization procedures of penicillin acylase ［J］. Biotechnol Bioeng,2002,79(2):224～228.
［15］ Calleri E, Temporini C, Massolini G, et al. Penicillin G acylasebased stationary phases: Analytical applications ［J］. J Pharm Biom Anal,2004,35(2):243～258.
［16］ Calleri E, Massolini G, Lubda D, et al. Evaluation of a monolithic epoxy silica support for penicillin G acylase immobilization ［J］. J Chromatogr A,2004,1031(1～2):93～100.
［17］ Jing H, Li X F, Evans D G, et al. A new support for the immobilization of penicillin acylase ［J］. J Mol Catal BEnzym,2000,11(1):45～53.
［18］ 高波，朱广山，付学奇，等. 介孔材料的修饰及固定青霉素酰化酶的稳定性研究［J］. 高等学校化学学报，2006，27(10)：1823～1826.
［19］ 高波，朱广山，付学奇，等. 不同介孔材料固定青霉素酰化酶的稳定性研究 ［J］. 高等学校化学学报，2005，26(10)：1852～1854.
［20］ De Martin L, Ebert C, Garau G, et al. Penicillin G amidase in lowwater media: immobilisation and control of water activity by means of celite rods ［J］. J Mol Catal BEnzym,1999,6(4):437～445.
［21］ Govardhan C P. Crosslinking of enzymes for improved stability and performance ［J］. Curr Opin Biotechnol,1999,10(4):331～335.
［22］ Cao L Q, van Rantwijk F, Sheldon R A. Crosslinked enzyme aggregates: A simple and effective method for the immobilization of penicillin acylase ［J］. Org Lett,2000,2(10):1361～1364.
［23］ Mateo C, Palomo J M, van Langen L M, et al. A new, mild crosslinking methodology to prepare crosslinked enzyme aggregates ［J］. Biotechnol Bioeng,2004,86(3):273～276.
［24］ Sheldon R A, Schoevaart R, Van Langen L M. Crosslinked enzyme aggregates (CLEAs): A novel and versatile method for enzyme immobilization (a review) ［J］. Biocatal Biotransform,2005,23(3～4):141～147.
［25］ Kallenberg A I, van Rantwijk F, Sheldon R A. Immobilization of penicillin G acylase: The key to optimum performance ［J］. Adv Synth Catal,2005,347(7～8):905～926.
［26］ den Hollander J L, Zomerdijk M, Straathof A J J, et al. Continuous enzymatic penicillin G hydrolysis in countercurrent waterbutyl acetate biphasic systems ［J］. Chem Eng Sci,2002,57(9):1591～1598.
［27］ Diender M B, Straathof A J, van der Does T, et al. Equilibrium modeling of extractive enzymatic hydrolysis of penicillin G with concomitant 6aminopenicillanic acid crystallization ［J］. Biotechnol Bioeng,2002,78(4):395～402.
［28］ Ferreira J S, Straathof A J J, Franco T T, et al. Activity and stability of immobilized penicillin amidase at low pH values ［J］. J Mol Catal BEnzym,2004,27(1):29～35.
［29］ 何志敏，郭从容，吴金川，等. 反胶团酶促水解青霉素G制备6APA ［J］. 中国抗生素杂志，1999，24(6)：404～407.
［30］ Abian O, Wilson L, Mateo C, et al. Preparation of artificial hyperhydrophilic microenvironments (polymeric salts) surrounding enzyme moleculesNew enzyme derivatives to be used in any reaction medium ［J］. J Mol Catal BEnzym,2002,19:295～303.
［31］ Abian O, Mateo C, FernandezLorente G, et al. Improving the industrial production of 6APA: enzymatic hydrolysis of penicillin G in the presence of organic solvents ［J］. Biotechnol Prog,2003,19(6):1639～1642.
［32］ Saitoh T, Hinze W. Concentration of hydrophobic organiccompounds and extraction of protein using alkylammoniosulfate zwitterionic surfactant mediated phase separations (cloud point extractions) ［J］. Anal Chem,1991,63(21):2520～2525.
［33］ Wang Z, Guo Y, Bao D, et al. Direct extraction of phenylacetic acid from immobilised enzymatic hydrolysis of penicillin G with cloud point extraction ［J］. J Chem Technol Biotechnol,2006,81(4):560～565.
［34］ Wang Z, Wang L, Xu J H, et al. Enzymatic hydrolysis of penicillin G to 6aminopenicillanic acid in cloud point system with discrete countercurrent experiment ［J］. Enzyme Microb Technol,2007,41(1～2):121～126.
［35］ Wang L, Wang Z, Xu J H, et al. An ecofriendly and sustainable process for enzymatic hydrolysis of penicillin G in cloud point system ［J］. Bioprocess Biosyst Eng,2006,29(3):157～162.
［36］ 郭雅静，王志龙，包达，等 . 浊点系统中青霉素水解物系的分配及固定化青霉素酰化酶的稳定性［J］. 化工学报，2006，57(6)：1422～1425.
［37］ Wang Z. The potential of cloud point system as a novel twophase partitioning system for biotransformation ［J］. Appl Microbiol Biotechnol,2007,75(1):1～10.
［38］ 王丽，王志龙，包达，等. 非水相青霉素酰化酶催化反应研究进展［J］. 中国抗生素杂志，2006，31(9)：518～524.
［39］ Andersson E, Mattiasson B, HahnHaegerdal B. Enzymatic conversion in aqueous twophase systems: Deacylation of benzylpenicillin to 6aminopenicillanic acid with penicillin acylase ［J］. Enzyme Microb Technol,1984,6(7):301～306.
［40］ Cao X J, Wu X Y, Fonseca L J P, et al. Production of 6aminopenicillanic acid in aqueous twophase systems by recombinant Escherichia coli with intracellular penicillin acylase ［J］. Biotechnol Lett,2004,26(2):97～101.
［41］ Liao L C, Ho C S, Wu W T. Bioconversion with whole cell penicillin acylase in aqueous twophase systems ［J］. Process Biochem,1999,34(5):417～420.
［42］ 金科铭，曹学君，庄英萍，等. 固定化青霉素酰化酶在光敏感可再生两水相体系中催化青霉素G为6APA［J］. 华东理工大学学报(自然科学版)，2007，33(3)：318～322.
［43］ 金科铭，曹学君，庄英萍，等. 固定化青霉素酰化酶在光pH敏感可回用两水相中裂解青霉素G为6APA［J］. 中国生物工程杂志，2007，27(10)：53～58.
［44］ vanRantwijk F, Sheldon R A. Biocatalysis in Ionic Liquids ［J］. Chem Rev,2007,107(6):2757～2758.
［45］ Sheldon R A, Lau R M, Sorgedrager M J, et al. Biocatalysis in ionic liquids ［J］. Green Chem,2002,4(2):147～151.
［46］ Sheldon R A, van Rantwijk F, Lau R M. Biotransformations in ionic liquids: An overview ［M］. Ionic Liquids As Green Solvents: Progress And Prospects. vol. 856. Washington: American Chemical Society,2003:192～205.
［47］ Lau R M, van Rantwijk F, Seddon K R, et al. Lipasecatalyzed reactions in ionic liquids ［J］. Org Lett,2000,2(26):4189～4191.
［48］ Park S, Kazlauskas R J. Improved preparation and use of roomtemperature ionic liquids in lipasecatalyzed enantioand regioselective acylations ［J］. J Org Chem,2001,66(25):8395～8401.
［49］ Schofer S H, Kaftzik N, Kragl U, et al. Enzyme catalysis in ionic liquids: lipase catalysed kinetic resolution of 1phenylethanol with improved enantioselectivity ［J］. Chem Comm,2001,2001(5):425～426.
［50］ 夏寒松，余江，刘会洲. 离子液体反胶团中青霉素酰化酶的水解反应特性［J］. 化工学报，2005，56(10)：1932～1935.
［51］ Zhang W G, Wei D Z, Yang X P, et al. Penicillin acylase catalysis in the presence of ionic liquids ［J］. Bioprocess Biosyst Eng,2006,29(5～6):379～303.
［52］ Basso A, Cantone S, Linda P, et al. Stability and activity of immobilised penicillin G amidase in ionic liquids at controlled a(w) ［J］. Green Chem,2005,7(9):671～676.
［53］ 龚俊波，王静康. 固定化青霉素酰化酶反应器研究进展［J］. 中国抗生素杂志，2005，30(7)：441～444.
［54］ Ishimura F, Suga K I. Hydrolysis of penicillinG by combination of immobilized penicillin acylase and electrodialysis ［J］. Biotechnol Bioeng,1992,39(2):171～175.
［55］ Bryjak J, Bryjak M, Noworyta A. Membrane reactor with soluble forms of penicillin acylase ［J］. Enzyme Microb Technol,1996,19(3):196～201.
［56］ Pribyl M, Chmelikova R, Hasal P, et al. Dynamics of penicillin G hydrolysis in an electromembrane reactor ［J］. J Chem Technol Biotechnol,2002,77(1):51～62.
［57］ Pribyl M, Chmelikova R, Hasal P, et al. Penicillin G hydrolysis in an electromembrane reactor with immobilized penicillin G acylase ［J］. Enzyme Microb Technol,2003,33(6):793～801.
［58］ Zadrail A, Chmelikova R, Hasal P. Continuous penicillin G hydrolysis in an electromembrane reactor with immobilized penicillin G acylase ［J］. Biotechnol Lett,2003,25(6):485～490.
［59］ Shewale J G, Sudhakaran V K. Penicillin V acylase: Its potential in the production of 6aminopenicillanic acid ［J］. Enzyme Microb Technol,1997,20(6):402～410.
［60］ Cheng S, Wei D, Song Q. Extraction penicillin G acylase from Alcaligenes faecalis in recombinant Escherichia coli with cetyltrimethylammoniumbromide ［J］. Biochem Eng J,2006,32(1):56～60.
［61］ Cheng S, Wei D, Song Q, et al. Immobilization of permeabilized whole cell penicillin G acylase from Alcaligenes faecalis using pore matrix crosslinked with glutaraldehyde ［J］. Biotechnol Lett,2006,28(14):1129～1133.