分光光度法测定蛋白酶酶活.doc

分光光度法测定蛋白酶酶活1 适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活得测定。2 测定原理蛋白酶在一定得温度与p条件下，水解酪素（酪蛋白)底物，产生含有酚基得氨基酸（如:酪氨酸、色氨酸等),在碱性条件下，将福林试剂（oln）还原,生产钼蓝与钨蓝,用分光光度计于波长68nm下测定溶液吸光度.酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品得酶活力。酶活单位得定义:每mL粗酶液，在一定温度与p值条件下,10min水解酪素产生酪氨酸为一个酶活力单位，以(u/mL)表示。3 仪器与设备3.1 分析天平：精度为0、000。3.2 紫外分光光度计.3.3 恒温水浴锅:精度、2。3.4 H计:精度为0、01PH单位.4 试剂与溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂与蒸馏水。4.1 福林（Foli）试剂市售分析纯福林试剂。4.2 福林使用溶液 一份福林试剂与两份水混合，摇匀。4.3 碳酸钠溶液（42、4g/L） 称取无水碳酸钠(N23）42、4g，用水溶解并定容至000m。4.4 三氯乙酸(ClCOOH）=0、4l/L 称取三氯乙酸65、4g，用水溶解并定容至000mL。4.5 氢氧化钠溶液c(NOH）=、5mol/L 称取氢氧化钠片剂20、0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至10ml,摇匀。4.6 盐酸溶液c（HCL)=1 mol/L及、 mol/L 1olL CL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至000L.0、1ml/HCL:取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至100mL。4.7 缓冲溶液4.7.1 磷酸缓冲液(p=、5,适用于中性蛋白酶) 称取磷酸氢二钠(NHPO412H2O）6、02g与磷酸二氢钠（NaH2PO1H2O)0、g，加水溶解并定容至00mL。4.7.2 乳酸缓冲液（pH、0,适用于酸性蛋白酶） 甲液：称取乳酸(890）10、6g，加水溶解并定容至1000 mL。乙液：称取乳酸钠（70%）16，加水溶解并定容至100mL.使用溶液:取甲液8,加乙液1 ，混匀,稀释一倍，即成0、mo/L乳酸缓冲溶液。4.8 1酪素溶液 称取酪素（固定厂家生产,不同厂家产品对实验结果有影响）1、000，精确至0、1g，用少量、5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸23滴)湿润后，加入适量得缓冲溶液(测中性蛋白酶加磷酸缓冲液，测酸性蛋白酶加乳酸缓冲液）约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌,直到完全溶解,冷却后，转入1mL容量瓶中，用适宜得p缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天.4.9 L酪氨酸标准溶液(10gmL) 称取预先于15干燥至恒重得L酪氨酸0、10g，精确至0、002g，用1moL盐酸6 L溶解后再用蒸馏水定容至100 mL，即为m/m酪氨酸标准溶液。吸取mg/ L酪氨酸标准溶液0、0 mL，用、1moL盐酸定容至10 mL，即得到00/ mL 酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。5 分析步骤5.1 标准曲线得绘制5.1.1 L酪氨酸标准溶液:按表1配置。L酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定.表1管号酪氨酸标准溶液得浓度（g/m）取100ug/L酪氨酸标准溶液得体积 mL取水得体积mL吸光值Abs、001019203303404655分别取上述溶液各3、00ml,各加碳酸钠溶液(、3）1、00ml、福林试剂使用溶液(4、2)3、0ml，振荡均匀，置于400、水浴中显色in,取出冷却至常温，用分光光度计于波长680测定其吸光度(A），以吸光度A为纵坐标，酪氨酸得浓度c为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点).根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时得酪氨酸得量（），即为吸光常数K值；(其K值应在(95100）范围内).如不符合,需重新配制试剂,进行试验。5.2 样品测定5.2.1 待测酶液得制备液体酶样:准确吸取样品10、l于10ml容量瓶中,用适宜溶剂（蒸馏水或者缓冲溶液）定容至刻度。控制稀释样品酶活力在100/m1000 u/ml范围内.固体酶样:准确称取样品4、0，精确至、000.用适量适宜溶剂(蒸馏水或者缓冲溶液）溶解后，定容至100l。再将定容溶液用定性滤纸过滤后,准确吸取1、0l，用相应溶剂定容至0l。控制稀释样品酶活力在10uml100 /ml范围内。5.2.2 测定a、先将酪素溶液放入00、2恒温水浴中，预热5min；b、按下列程序操作：试管(空白) 试管B（酶试样，需作三个平行试样)加酶液4、00 L 加酶液、00L 40、2保温，2min 400、2保温，2min 加三氯乙酸8、0 mL(摇匀) 加酪素4、mL（已预热）(摇匀) 沸水煮沸，0i(精确计时) 40、保温，30in（精确计时） 加酪素4、0mL（已预热）(摇匀) 加三氯乙酸8、00mL（摇匀) 、2保温，30i，过滤（定性滤纸） 沸水煮沸,10i,过滤(定性滤纸） 取、0m滤液 取3、00ml滤液 加碳酸钠溶液1、m 加碳酸钠溶液15、0ml 加福林试剂使用溶液3、ml 加福林试剂使用溶液3、00m 40、2，显色20n 40、2,显色20min 冷却至常温 冷却于68m波长，测定样品酪氨酸浓度6 结果计算6.1 液体样品酶活力得计算从标准曲线上读出样品最终稀释液得酶活力，单位为u/ml.样品得酶活力按式()计算: （1)式中：X样品得酶活力，（umL）；C由标准曲线得出得检测试液得酶活力,（u/m);21检测试液得体积,l;16-反应试液得总体积，mL；所测样品得稀释倍数;3反应时间为0mi得倍数；-吸取滤液得体积,ml;加入酶液得体积，mL；所得结果表示至整数。6.2 固体样品酶活力得计算固体样品得酶活力换算按式（2）计算: （2）式中：固体样品得酶活力，（u/)；-固体样品溶解定容后得酶活力，(m)；样品定容体积，ml；称取样品得质量,g；所得结果表示至整数。7 检验注意事项7.1 缓冲溶液配制注意事项 缓冲溶液配制完成后，用PH计测定其P值,若H值不在规定范围内,需用相应得试剂调PH值至规定要求。7.2 多个样品同时检验注意事项 如果有多个样品进行检测，样品处理过程： 预热加酶液保温加三氯乙酸沸水煮沸 ，需要分别单独进行操作与计时，加酶液及试剂得时间控制在mn以内。附则:本方法自2015年5月5日实施. 本方法得编制与修订属于质量管理部。编制人：审核人：批准人: