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公共卫生微生物采样检测方法总结

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2020年4月19日
文档仅供参考
一、 空气中微生物的检测方法------细菌总数
（营养琼脂，121℃高压灭菌20min，培养时间37℃,48h）
1. 两种方法
（1） 撞击法(二级或者六级微生物采样器)
（2） 自然沉降法（暴露5min）
采样：梅花布点，高度：1.2~1.5m；离墙：1m。
二、 茶具微生物检验方法
（一）细菌总数
1、生理盐水的制法：将氯化钠（8.5g）溶解于蒸馏水（1000mL）中，分装到试管内，每管10mL，121℃高压灭菌20min。
2、采样：棉拭子湿润生理盐水，在茶具内、外缘涂抹50cm2，即口唇接触处一圈（1~1.5cm），用灭菌剪刀剪去棉签手接触处，将棉拭子放入10mL生理盐水中，4h内送检。
3、检验程序：
检样→各1mL加入两块灭菌平皿（若污染严重，可十倍递增稀释）→37℃，48h培养→菌落计数→报告
4、 单位：cfu/cm2。
（二） 大肠菌群
二、 培养基：乳糖胆盐发酵培养液（双料的，每管10mL，115℃高压灭菌15min）
三、 检测方法：发酵法（具体内容课本11页）
四、 检样（测定细菌总数余下的样品）
五、 革兰氏染色过程：（阳性菌显紫色，阴性菌显红色）
（1） 初染：1min，水洗；
（2） 碘染：1min，水洗；
（3） 脱色：30s，水洗；
（4） 复染：1min，水洗，待干，镜检。
5、 结果报告：凡乳糖发酵管最终产酸产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告检出大肠菌群。

三、毛巾、床上卧具微生物检测方法
（一）细菌总数
1.采样
（1）毛巾、枕巾：对折后两面的中央各25cm2；
（2）床单、被单：在上下两部中央25cm2来回涂抹；
2、检测程序同茶具细菌总数检测
3.计算单位：cfu/25cm2。
(二)大肠菌群（检测程序同茶具大肠菌群检测）
1.涂抹法：（用测定细菌总数时采集的样品）
四、理发用具微生物检验方法
（一）大肠菌群
1、采样
推子：在推子前部上下部分均匀各涂抹三次；
理发刀、剪和修脚工具：在使用的刀、剪面的两侧各涂抹一次采样；两个刀或者两个剪为一份样品。
2、 检样5mL倒入双料乳糖胆盐发酵管，37℃，24h培养；
3、 分离培养：接种伊红美蓝平板，做革兰氏染色镜检；
4、 证实试验：接种乳糖发酵管37℃，24h培养，观察产气情况。
5、 结果报告：乳糖管最终产酸产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，可报告为大肠菌群阳性。
（二） 金黄色葡萄球菌
（三） 培养基：7.5%的氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤培养基
（四） 步骤：
（1） 做大肠菌群剩余的5mL倒入培养基中，37℃，24h培养；
（2） 接种血平板，37℃，24h培养；观察形状：圆形、金黄色、凸起、表面光滑、周围有溶血圈；
（3） 挑菌落做镜检：革兰氏阳性（红色），葡萄状排列；
（4） 甘露醇发酵试验：接种到甘露醇发酵培养基中，37℃，24h培养，观察是否产酸；
（5） 血浆凝固酶试验
玻片法：在干净的玻片两边，一端滴一滴生理盐水，一端滴一滴血浆，接种环挑菌落分别与它们混合。5min后均无凝固现象的为阴性；若血浆中出现颗粒状凝块而生理盐水中没有，则为阳性。
五、 拖鞋微生物检验方法
霉菌与酵母菌
（生理盐水中要加入玻璃珠）
2. 培养基：霉菌培养基、（虎红）孟加拉红培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）
3. 取样：有棉拭子在每只拖鞋鞋面与脚趾接触处的5cm×5cm面积上均匀涂抹3次，一双拖鞋为一份样品；
4. 将盛有棉拭子的试管在手心用力振荡100次，使霉菌孢子分开；
5. 培养：在霉菌培养箱中25~28℃，培养观察一周。
6. 单位是cfu/50cm2。
六、 浴盆、脸（脚）盆微生物检测
（三） 细菌总数
无菌生理盐水：分装125mL/瓶供浴盆采样；50mL供脸（脚）盆采样。
采样部位：在盆内侧二分之一到三分之一高度；
布点：浴盆梅花布点；脸（脚）盆相对两侧壁布点；
方法：涂抹法（与茶具方法一致）
单位：cfu/25cm2。
（四） 大肠菌群(同茶具)
七、游泳池水微生物检测
（一） 、细菌总数
1.采样瓶：无酸、无碱、无毒的玻璃容器。
2.灭菌前要加入足量的10%的硫代硫酸钠溶液，一般125mL水样加0.1mL。
3.采样
游泳池水
面积，㎡
儿童池
成人池
天然游泳池
≦1000
>1000
≦2500
>2500
采样点数
1~2
2
3
5
>5
注：在水面下30cm处取水样450mL
4. 操作步骤（与茶具细菌总数一样）

（二） 大肠菌群
1. 培养基：三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（蒸馏水量不变，其它成分三倍）
2. 步骤
（1） 推测性试验
2个装有50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管内（装有小试管）各加入100mL的水样；在10支装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管里（装有小试管）加入10mL水样。摇匀，培养。
（2） 平板分离
接种伊红美蓝，培养、观察；典型菌落形态：黑紫色或红紫色，具有金属光泽。
（3） 复发酵试验
进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，培养，观察。
（4） 查表：1000mL水样中大肠菌群的MPN值。
八、 生活饮用水微生物检验方法
（一） 采样
1.采样容器应采用洁净、无色、无毒的聚乙烯塑料和硬质玻璃（又称硼硅玻璃）。样品瓶必须专瓶专用，切不可用实验室盛装过浓溶液的瓶作采样瓶。一般我们使用500ml的高压灭菌的细口瓶采样。
2.容器及瓶塞、瓶盖应能经受灭菌的温度。
3.检验中所用的一切用品必须是完全灭菌的。在灭菌前应彻底洗涤干净，121℃高压蒸汽灭菌20min，或160℃干烤2h。
4.冷藏，4h内检测。如有游离余氯应在采样瓶消毒前每125ml加0.1ml硫代硫酸钠溶液。
（二） 细菌总数（操作步骤同茶具，记得做空白对照）
（三） 总大肠菌群
1. 乳糖发酵试验
（1）10mL水样加入10mL双料乳糖发酵管中；1mL水样加入10mL单料乳糖发酵管中； 0.1mL水样加到10mL单料乳糖发酵管中；每一稀释度接种5管。
（2）37℃培养24小时，观察产酸产气现象
2. 分离培养（接种伊红美蓝，培养）
3. 证实实验（革兰氏染色，镜检，接种乳糖发酵管）
4. 结果报考：查表。
（四） 耐热大肠菌群
5、 培养基：EC培养基
6、 操作步骤：同大肠菌群多管发酵法。
7、 培养温度：44.5℃培养24h。
（五） 大肠埃希氏菌
1. 培养基：EC-MUG培养基（培养基加热溶解后要先在366nm紫光下检查有无荧光）
2. 培养温度：44.5℃培养24h。
3. 观察：在暗处用366nm的紫外灯照射，是否有蓝色荧光产生；
4. 计算阳性管数，查表得出最可能数，结果以MPN/100mL报告。
九、 公共场所集中空调系统
（一） 冷凝水、冷却水中嗜肺军团菌
（1）采样
1. 采样容器：可选择玻璃瓶或聚乙烯瓶，广口瓶，用前灭菌。
2.采样量：每个采样点依无菌操作取水样（或沉积物、软泥等样品）约500ml。
3.中和：经氯或臭氧等消毒的样品，采样容器灭菌前加硫代硫酸钠溶液中和。
4.样品运输与贮存：样品最好2天内送达实验室，不必冷冻，但要避光和防止受热，室温下贮存不得超过15天。
（2）热处理：取1ml洗脱样品置50℃水浴加热30min。
酸处理：取5ml洗脱样品，调pH至2.2，轻轻摇匀，放置5min。
（3） 接种平板静置于浓度为2.5%的CO2培养箱中，35~37℃，观察到有培养物生成时，反转平板，孵育10d，注意保湿。
（4） 观察
军团菌生长缓慢，易被其它菌掩盖，需每天在体式镜上观察。军团菌的菌落颜色多样，一般呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、灰绿色、深红色；菌落整齐，表面光滑，呈典型毛玻璃状，在紫外灯下，部分有荧光。
（二） 送风中细菌总数
以无菌操作，使用六级筛孔空气撞击式采样器，以空气流量为28.3L/min，在采样点采集5~15min。将采集细菌后的营养琼脂平皿置35~37℃培养48 h，计数菌落数。
（三） 送风中真菌总数
采样方法同上将采集真菌后的沙氏琼脂培养基平皿置28℃培养5~7 d，逐日观察并于第7 d 记录结果。若真菌数量过多可于第5d 计数结果，并记录培养时间，换算成cfu/m3。
（四） 送风中β-溶血性链球菌
在血琼脂平板上形成灰白色，表面凸起，直径0.5mm~0.7mm的细小菌落，菌落透明或半透明，表面光滑有乳光，菌落周边有溶血环；镜检为革兰氏阳性无芽孢杆菌，圆形或卵圆形，呈链状排列。
（五） 风管内表面微生物检验
采样面积：每一点采样面积应为50cm2。
采样方法：刮拭法、擦拭法
细菌和真菌培养与计数方法同上