T∕CACM 1326.7-2019 草豆蔻种子超低温保存技术规程.pdf

ICS 11.120.01 C 23 团体标准 T/CACM 1326.72019 草豆蔻种子超低温保存技术规程 Technical code of practice for cryopreservation of Alpinia katsumadai Hayata seeds2019-10-17 发布 2019-10-17 实施 中 华 中 医 药 学 会 发 布T/CACM 1326.72019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 种子采收及选择.2 4.1 种子采收.2 4.2 种子选择.2 5 种子前处理.2 5.1 活力 .2 5.2 含水量范围.2 6 种子量保存.2 7 种子冷冻方式.2 8 恢复培养.3 8.1 种子解冻处理.3 8.2 冻后种子生活力检测.3 8.3 萌芽成苗.3 附录 A（规范性附录）BTB 配制和保存方法.4 参考文献.5 T/CACM 1326.72019 II 前 言 本标准是药用植物顽拗性种子超低温保存系列标准之一，该系列标准结构和名称如下：T/CACM 1326.1 药用植物顽拗性种子超低温保存技术通则；T/CACM 1326.2 白木香种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.3 降香种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.4 益智种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.5 高良姜种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.6 朱砂根种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.7 草豆蔻种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.8 化州柚种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.9 樟种子超低温保存技术规程；T/CACM 1326.10 两面针种子超低温保存技术规程；。本标准按照 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由中国医学科学院药用植物研究所海南分所提出。本标准由中华中医药学会归口。本标准起草单位：中国医学科学院药用植物研究所海南分所、中国医学科学院药用植物研究所。本标准主要起草人：曾琳、魏建和、郑希龙、李榕涛、王秋玲、何明军、金钺、顾雅坤、符丽。T/CACM 1326.72019 1 草豆蔻种子超低温保存技术规程 1 范围 本标准规定了草豆蔻（Alpinia katsumadai Hayata）种子超低温保存过程中的术语和定义、种子采收及选择、种子前处理、种子保存量、种子冷冻方式、恢复培养等内容。本标准适用于草豆蔻种子的超低温长期贮藏。2 规范性引用文件 下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.6 农作物种子检验规程 水分测定 植物生理学实验指导（第三版），2005 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 草豆蔻 Alpinia katsumadai Hayata 为姜科（Zingiberaceae）山姜属（Alpinia Roxb）植物，株高 3 m，叶片线状披针形，总状花序顶生。其干燥近成熟种子性辛、温，归脾、胃经，具有燥湿行气，温中止呕的功效。常用于治疗寒湿内阻，脘腹胀满冷痛。收载于中华人民共和国药典（2015 版）。3.2 草豆蔻果实 Alpinia katsumadai Hayata fruits 果实为蒴果，圆球形，直径约 3.5 cm4 cm，外面密生粗毛。内有类球形的种子团，直径 1.5 cm2.7 cm，表面灰褐色，中间有黄白色的隔膜，将种子团分成3瓣，每瓣有种子多数，粘连紧密，种子团略光滑。3.3 草豆蔻种子 Alpinia katsumadai Hayata seeds 草豆蔻的繁殖材料为完整种子，贮藏特性判断为顽拗性种子。种子表面灰棕色或浅褐色，卵圆状多面体，长 3 mm5 mm，直径约 3 mm，外被一层白色透明膜质假种皮，种脊为一条纵沟，一端有种脐；质硬，将种子沿种脊纵剖两瓣，纵断面观呈斜心形，种皮沿种脊向内伸入部分约占整个表面积的1/2；胚乳灰白色。T/CACM 1326.72019 2 3.4 种子超低温保存 seed of cryopreservation 将经过前处理的草豆蔻种子置于液氮（-196）中保存。4 种子采收及选择 4.1 种子采收 5 月8 月，果皮呈金黄色时，即可采收，去除果肉，取出种子洗净。4.2 种子选择 挑选发育饱满、完整、健康的种子为保存材料，置于 10 种子低温低湿储藏柜中保存备用（存放时间不超过 6 个月）。5 种子前处理 5.1 活力 5.1.1 检测 草豆蔻种子活力以种子生活力为判别标准。按照 植物生理学实验指导 中的溴麝香草酚蓝（BTB）法测定草豆蔻种子生活力。待测种子在 30 35 温水中浸种 2 h，随后取吸胀种子 20 粒，整齐地埋于备好的 1.5 BTB 琼脂凝胶中，应将胚部分埋入凝胶中。将培养皿置于 35 温箱中 12 h后观察结果。BTB 的配制和保存方法见附录 A。5.1.2 鉴定及要求 在光下用放大镜对染色结果进行观察鉴定。凡种胚周围出现黄色晕圈的种子为有活力的种子，否则为无活力的种子。待保存的草豆蔻种子生活力应 70。5.1.3 计算 生活力按照公式（1）计算：式中：A生活力；y有活力的种子数；x总的种子数。5.2 含水量范围 用尼龙网袋包裹草豆蔻种子，置于盛有变色硅胶的干燥器内，硅胶与种子的体积比为 60:1，室温T/CACM 1326.72019 3 条件下干燥处理 4 h18 h，在干燥过程中定期测定种子含水量，将种子含水量降至 1216。按照 GB/T 3543.6 中的高恒温烘干法（130 烘干 1 h）测定种子含水量，并按照公式（2）进行计算：式中：W0 种子含水量，用百分数表示（）；M1 种子鲜重，单位为克（g）；M2 种子烘后重量，单位为克（g）。6 种子保存量 草豆蔻种子保存量不少于 500 粒。7 种子冷冻方式 草豆蔻种子超低温保存的冷冻方式为直接冷冻法，即将待保存的草豆蔻种子放入 2 mL 冻存管（每管 50 粒种子）中，迅速投入液氮中保存。8 恢复培养 8.1 种子解冻处理 液氮中至少冻存 24 h 后，取出 1 个冻存管，立即放入 40 水浴中快速解冻 2 min。8.2 冻后种子活力检测 取出 20 粒解冻后的种子，按照 5.1 活力检测方法，进行超低温保存后的初始生活力检测。当种子生活力 50 时视为保存成功。8.3 萌芽成苗 将剩余的 30 粒解冻后的草豆蔻种子，播种到带有无菌滤纸的带盖发芽盒中，在温度 25 30、湿度 7085 条件下培养。草豆蔻种子出芽周期大约 10 d40 d。T/CACM 1326.72019 4 A A 附 录 A（规范性附录）BTB 的配置和保存方法 A.1 0.1 BTB 溶液配置和保存方法 精密称取 BTB 0.1 g，溶解于煮沸过的 100 mL 纯水中，之后用滤纸去残渣。滤液若呈黄色，可加数滴氢氧化钠溶液，使之变为蓝色或蓝绿色，置于棕色瓶中长期贮存。A.2 1.5 BTB 琼脂凝胶配置方法 称量 0.1 BTB 溶液 40 mL 置于烧杯中，称取 0.5 g 琼脂，将其剪碎后加入杯中，加热并不断搅拌使之完全溶解。待溶液稍微冷却即可趁热倒入 9 cm 培养皿中，使之形成一均匀的薄层，完全冷却后备用。T/CACM 1326.72019 5 参 考 文 献 1 中国植物志委员会.中国植物志第 16(2)卷M.科学出版社.2004(1991)：091 2 Wu Te-lin.Kai Larsen.Zingiberaceae M/Flora of China Beijing:Science Press/St.Louis:Missouri Botanical Garden Press.2000.24:322-377 3 国家药典委员会.中华人民共和国药典M.北京，中国医药科技出版社，2015，238-239 4 傅家瑞，宋松泉.顽拗性种子生物学M.中国科学文化出版社，2004:1 5 Reed BM.Plant CryopreservationA Practical GuideM.Springer,2010:3 _