细胞生物学研究方法样本.doc

资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。2. 细胞生物学研究方法2.1 显微成像技术2.1.1 光学和电子显微镜成像原理2.1.2 常见的光学显微镜2.1.3 光学显微镜的样品制备与观察2.1.4 电子显微镜2.1.5 间接成像技术2.2 细胞化学技术2.2.1 酶细胞化学技术2.2.2 免疫细胞化学技术2.2.3 细胞分选技术2.2.4 其它细胞化学技术2.3 细胞工程技术2.3.1 细胞培养2.3.2 细胞融合与单克隆抗体技术2.3.3 动物细胞核移植克隆技术2.4 分离技术2.4.1 离心分离技术2.4.2 层析分离技术2.5 分子生物学方法2.5.1 基因工程技术2.5.2 PCR技术2.5.3 选择性基因敲除与转基因鼠2.5.4 乳腺生物反应器技术2. 细胞生物学研究方法生命科学是实验科学, 它的很多成果都是经过实验得以发现和发展的。方法上的突破, 对于理论和应用上的发展具有巨大的推动作用。2.1 显微成像技术最早的光学显微镜是1590年Z.Janssen和她的侄子H.Janssen共同研制的。其后, Robert Hooke和Antonie van Leeuwenhoek对光学显微镜的分辨本事进行了极大的改进, 由此发现了细胞。20世纪30年代发展起来的电子显微镜导致细胞结构和功能研究发生了一次革命, 使生物学家得以从亚显微水平上重新认识细胞(图2-1)。图2-1 光学显微镜和电子显微镜下的细胞结构 2.1.1 光学和电子显微镜成像原理不论是何种显微镜, 镜像的形成都需要三个基本要素:照明系统, 被观察的样品, 聚焦和成像的透镜系统(图2-2)。图2-2 光学和电子显微镜的基本结构在光学显微镜中, 照明系统是可见光, 使用的是玻璃透镜系统, 可直接经过目镜观察镜像。在电子显微镜中, 照明系统为电子束, 使用电磁透镜, 经过荧光屏观察样品的镜像。照明系统的波长是显微镜成像的一个重要因素, 因为波长决定能被检测样品的最小极限。波长越长, 波幅的跨度就越大, 所能观察到的物体极限就越大(图2-3)。图2-3 波的移动、 波长和干扰请对图2-3作出说明光学和电子显微镜成像的光学原理是相同的, 其中最重要的是光子和电子都具有波的行为。当光子和电子穿过透镜到达聚焦点时, 由于波的干涉(interference)性质而成像。实际上经过透镜观察到的样品的镜像是经过透镜波的干涉累加或消除, 即衍射(diffraction)的结果。焦距与角孔径焦距(focal length)是透镜的中心平面到焦点的距离(图2-4), 而角孔径(angular aperture)是光从样品进入显微镜的物镜半角(图2-5), 因此角孔径实际表示有多少光离开样品经过透镜, 最好的光学显微镜的角孔径大约是700。图2-4 透镜的焦距图2-5 透镜的角孔径角孔径是光从样品进入透镜的半角。(a)小孔径透镜;(b)大角孔径透镜。角孔径越大, 透过透镜的信息越多, 最好的玻璃透镜的角孔径大约是700 分辨率(resolution)透镜最重要的性质就是它的分辨率, 分辨率(R)可用以下公式计算: R = 0.61 /n Sin其中:n=聚光镜和物镜之间介质的折射率. 空气为1. 油为1.5; =样品对物镜角孔径的半角, sin的最大值为1;=照明光源的波长。0.61是一个恒定的参数, 表示成像的点虽被重叠但仍能被区别的程度。上式中n Sin的量称为物镜的数值孔径(numeric aperture), 缩写为NA, 因此显微镜的分辨率的表示公式可改为:R=0.61 /NA从上式可知, 角孔径越大, 进入物镜的光越多; 介质的折射率越大, 则数值孔径越大, 这些都能够使分辨率提高。由于分辨率表示的是能够区别两个点间最近距离的能力, 因此R值越小, 分辨率越高。从分辨率的表示式来看, NA越大, 分辨率越高, 或者波长越短, 分辨率越高。 分辨极限(limit resolution)与放大率(magnification)一般地说, 一定波长的射线不能用以探查比它本身波长短得多的结构细节, 这是一切显微镜的一个基本限度。对可见光来说, 能清楚地分辨出相邻两点之间的最小间隔是0.2 m, 称之为分辨极限(limit resolution)。最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率。总放大率 = 物镜放大率目镜放大率, 放大率同样受分辨极限的限制。一般来说, 光学显微镜的最大放大率只能是透镜的数值孔径的1000倍。由于透镜的数值孔径的范围是1.01.4, 因此光学显微镜在用空气作介质时最大放大倍数为1000倍, 用油镜则为1400倍。增大角孔径或缩短波长可提高光学显微镜的分辨率。如果用波长比普通波长短得多的电子波代替光波, 分辨率可大大提高, 电子显微镜就是在这种需求下被创造的。表2-1是光学显微镜与电子显微镜某些特性的比较。表2-2 电子显微镜与光学显微镜的基本区别分辨本事光源透镜真空光学显微镜300 nm可见光玻璃透镜不需真空200 nm(油镜)可见光玻璃透镜不需真空100 nm紫外光玻璃透镜不需真空电子显微镜0.1 nm电子束电磁透镜真空2.1.2 常见的光学显微镜光学显微镜(light microscope)是光学显微技术的主要工具, 自问世以来已有400多年历史。光学显微镜是利用光线照明, 使微小物体形成放大影像的仪器。现今使用的光学显微镜都是由几个透镜组合而成, 因此又称为复合显微镜(compound microscope)(图2-6)。 图2-6 普通光学显微镜的基本结构 普通双筒显微镜(binocular microscope)比较高级的显微镜上都设有倾斜式的双目镜筒(图2-7)。在物镜转换器上方装有四个棱镜, 使经过物镜的光线平分为两路到达目镜, 故双筒显微镜的亮度要比单筒者为暗。双筒显微镜的优点为同时用两眼观察, 有较强的立体感。图2-7 双筒显微镜 荧光显微镜(fluorescence microscope)荧光显微镜的工作原理是利用紫外线发生装置(如弧光灯、 水银灯等)发出强烈的紫外线光源, 经过照明设备把显微固定的切片或活染的细胞透视出来, 基本成像原理示于图2-8。图2-8 荧光显微镜的光通路 相差显微镜(phase contrast microscope)相差显微镜在结构上进行了特别设计, 特别是光学系统有很大的不同(图2-9), 可用于观察未染色的活细胞(图2-10)。图2-9 相差显微镜的光学部件及光线通路图2-10 相差显微镜观察的活细胞 暗视野显微镜(dark field microscope)暗视野显微镜是利用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放大, 在黑暗的背景下呈现明亮的像。这种特殊的照明方式, 使反差增大, 分辨率提高, 用以观察未经染色的活体或胶体粒子(图2-11)。图2-11 暗视野显微镜的光学暗视野显微镜主要观察的是物体的轮廓, 分辨不清内部的微细构造, 适合于观察活细胞内的细胞核、 线粒体、 液体介质中的细菌和霉菌等。 倒置显微镜倒置显微镜的结构组成与普通显微镜一样, 所不同的只是它的物镜与照明系统的位置颠倒过来。前者置于载物台之下, 而后者在载物台的上方。集光器与载物台之间的工作距离提高, 能够放置培养皿、 培养瓶等容器, 直接对培养的细胞进行照明和观察(图2-12)图2-12 倒置显微镜2.1.3 光学显微镜的样品制备与观察由于大多数细胞的成分不影响光线的穿透, 无法形成反差, 因此在一般光学显微镜下, 几乎看不清未经处理的细胞。为了看清细胞内含物, 就必须对细胞样品进行一些特殊的处理, 为此建立和发展了样品的各种制备技术。 样品的固定(fixation) 目的: 生物组织在染色前先进行固定的目的是杀死细胞, 稳定细胞的化学成份, 而且使样品硬化以便在进一步的处理和切片时不会受到破坏。 做法: 样品固定的最简单做法是将样品直接浸泡在固定液中。固定使得大分子交联而保持在一定的位置上, 不致于在以后的染色等处理过程中移位或丢失而产生人工假象。一般用具有缓冲作用的醛类固定液, 用甲醛或戊二醛作固定剂, 能够与蛋白质的游离氨基形成共价键, 从而将邻近的蛋白质分子牢固地交联在一起。 包埋和切片(embedding and sectioning)样品制备的第二步是将固定的组织制备成切片。为此, 样品首先要被包埋在介质中, 一般见液态的石蜡或树脂做包埋剂, 使之渗入整块组织, 然后将之硬化成固体的包埋块, 随后用专门的切片机切割包埋块, 制备成薄切片(图2-13)。适用于光学显微镜观察的切片厚度为 l10 m。图2-13 用切片机进行样品切片 染色(staining)大多数细胞总重量的70%是水, 对可见光几乎是透明的, 只有很少的内含物不透光。染色的目的就是给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征。19世纪初, 发现某些有机染料可染生物组织, 并对细胞特殊部位的着色具有选择性。如苏木精(hematoxylin)对负电荷分子有亲和性, 能显示出细胞内核酸的分布; 酸性染料如伊红(eosin)可使细胞质染色; 苏丹染料(Sudan dyes)在脂肪中的溶解度比在乙醇中大, 因此苏丹染料的乙醇饱和溶液能使脂肪着色。但对许多染料的特异性染色机理尚不清楚。 细胞化学技术(cytochemistry) 采用比有机染料更为特异的染色剂及酶细胞化学方法, 能够了解细胞和组织中大致的化学组成, 及某些活性基团或酶的存在。 为了测定蛋白质、 核酸、 多糖和脂类, 常利用一些显色剂与所检测物质中特殊基团的特异性结合, 经过显色剂在细胞中出现的部位和颜色显示的程度, 从而判断被检物质在细胞中的分布和含量。例如, 利用Feulgen反应(图2-14)可特异性检测细胞中的DNA, PAS反应可用于检测植物中的淀粉、 纤维素及动物细胞中的糖原、 粘蛋白等。 将细胞或组织切片与适宜的底物共同温育, 切片中的酶会水解底物, 再将所释放物质转变成不溶性有色化合物, 后者所在部位即是组织细胞中酶的活性部位。图2-14 Feulgen反应 放射自显影(autoradiography)放射自显影技术是用感光胶片测定细胞内某种被放射性标记的物质在细胞固定时所在的位置, 基本过程如图2-15 所示。 图2-15 放射自显影术