产肠毒素性大肠杆菌致病特性及益生菌的筛选与疾病控制研究.pdf

学校编码：学校编码：10384 分类号_密级 分类号_密级 学号：学号：200326051 UDC UDC 硕 士 学 位 论 文硕 士 学 位 论 文 产肠毒素性大肠杆菌致病特性 及益生菌的筛选与疾病控制研究 产肠毒素性大肠杆菌致病特性 及益生菌的筛选与疾病控制研究 The Research of Pathogenetic Characteristics of Enterotoxigenic Escherichia coli and The Screening and Inhibitory Effect of Probiotic on Pathogenic Bacteria 朱 红 梅 指导教师姓名：周 涵 韬 副教授 专 业 名 称：发 育 生 物 学 论文提交日期：2006 年 6 月 论文答辩时间：2006 年 8 月 学位授予日期：2006 年 9 月 答辩委员会主席：刘波 评 阅 人：2006 年 7 月 厦门大学学位论文原创性声明厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。声明人（签名）：年 月 日 厦门大学学位论文著作权使用声明厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。本学位论文属于 1、保密（），在 年解密后适用本授权书。2、不保密（）（请在以上相应括号内打“”）作者签名：日期：年 月 日 导师签名：日期：年 月 日 摘 要-I-摘 要 摘 要 产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli.，ETEC）是一类引起人和幼畜（初生仔猪、犊牛、羔羊）腹泻的重要病原菌，初生幼畜被ETEC感染后，常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡，发病率和死亡率均很高，给养殖业带来严重的经济损失。目前，通过在饲料中添加抗生素进行防治是一条最主要的途径。但近些年来，抗生素的由于耐药性、安全性等问题遭到了广泛的置疑和反对，世界上很多国家都对饲料中添加抗生素实行了禁用或限用。益生素（Probiotics）由于“无毒”、“无抗药性”、“无残留”、“无副作用”的特点，逐渐成为国内外饲料添加剂研究的热点。本文利用绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein）标记技术研究ETEC致病特性及筛选益生菌在体内、体外进行抑制致病菌研究，主要结果如下：1通过电击转化法，将带有gfp标记基因的pGLO质粒成功转化到产肠毒素性大肠杆菌K88中，经过紫外检测及荧光显微镜检测均发现标记菌株发出绿色荧光。进一步通过分子鉴定、脂肪酸分析、血清学鉴定发现标记菌株和原始菌株没有差异。同时研究在不同微生物学培养条件如：温度、pH值、盐浓度培养条件下，标记菌株的生长状态和原始菌株一致。2建立小白鼠K88、K88-GFP攻毒模型，K88的LD50为5.53108 CFU/mL，K88-GFP的LD50为4.86108 CFU/mL。同时利用标记菌株自发荧光的特点研究感染K88-GFP小白鼠的各器官致病菌的定植情况，发现在肝、肾中细菌最多，同时在脑、肌肉中也有少量分布。并且分析感染K88的小白鼠的血液成分、血生化指标的变化。K88对白细胞及相关指标的影响较大，WBC、W-SCC、W-LCC显著降低；对红细胞及相关指标的影响较小，仅在6h RBC、HCT、HGB降低；对血小板也有影响，PLT显著下降，MPV有所升高。K88对血液生化指标中反应肝、肾功能的指标影响较大，ALT、AST和BUN、UA显著升高，而对反应脂代谢的指标无影响，TCHO、TG与对照组相比无差异。3从土壤中筛选到的一株芽孢杆菌对K88、鸡大肠杆菌、沙门氏菌有抑制作用，通过对其表型特征、生理生化特征、脂肪酸分析和16S rDNA序列分析的多相分类研究，初步确定该菌株为短芽孢杆菌（Brevibacillus brevis）。摘 要-II-4在研究发酵动态对PB JK-2体外抑制K88、K88-GFP的影响时发现，30、pH值7.5、发酵24h的原液，同时接入PB JK-2的抑菌效果最好。在对感染K88-GFP的小白鼠模型的疾病控制研究时发现，腹腔注射PB JK-2的小白鼠LD50是不添加PB JK-2的对照组LD50的1.34倍，延缓了小白鼠的死亡，具有一定的保护作用。由此可见，短芽孢杆菌PB JK-2在体内、体外都能对K88起到抑制作用。本文表明利用GFP标记技术可以方便地检测K88-GFP在小白鼠体内的各器官定植及致病情况，为研究ETEC致病特性提供一种有效工具。研究表明致病菌可能具有侵袭性可以感染多种器官，感染的小白鼠血液组分中红细胞、白细胞及相关指标降低，与对照组有显著差异并且通过对血液生化指标研究发现对肝、肾功能有严重损坏。同时，从土壤中筛选到一株短芽孢杆菌PB JK-2，研究发现对K88体内、外都有抑制作用，这对开发益生菌新品种、了解益生素与致病菌的互作机理有具有重要的理论和实践意义。关键词：关键词：产肠毒素性大肠杆菌；绿色荧光蛋白；益生素。目 录-III-Abstract Enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC)is one of the most important pathogenic bacteria in human and animals(postweaning piglets,calves,lambs).Neonatal animals often die from diarrhea and dehydration after infected ETEC.The diarrhea is responsible for economic losses due to mortality,morbidity,decreased growth rate,and cost of medication.At present,the effective way to treat this disease is to add antibiotics to the feed,but it is controversial and averse because of the problem of the bacteria with resistance to antibiotics.Many countries have forbidden or restricted the use of antibiotics and side-effect.Probiotic is frequently and successfully adopted to add to the feed because it is nontoxic,no resistance,no residue and no side-effect.This paper includes application for Green fluorescent protein(GFP)in the research of pathogenesis of ETEC and the screening and inhibitory effect of probiotic on pathogenic bacteria.The mainly results of the research are as follows:1.The plasmid pGLO with green fluorescent protein gene was transformed successfully to enterotoxigenic Escherichia coli strain K88 by electroshock.It could be observed that the GFP expressed stably and efficiently in transformant by the detection of ultraviolet radiating and fluorescent microscope.By detection of PCR amplification of a structural gene in flagellum,the analysis of fatty acid and serological identification，the transformant and the wild-type strains were proved to have the same genetic background.Meanwhile the transformant was not impaired in their ability to grow under different ferment conditions such as different temperature,pH and salt concentration of culture media,compared with the wild-type strain.2.The mice model was established by challenged K88 and K88-GFP.In the model,LD50(median lethal dose)of K88 was 5.53108 CFU/mL,LD50 of K88-GFP was 4.86108 CFU/mL.Fluorescence provided a convenient way for the study of adherence and colonization in organs of mice.A large number of K88-GFP bacteria were discovered in liver and kidney,whereas only rare bacteria were obtained from on 目 录-IV-brain,muscle.The component and biochemical substances in serum also changed in infected mice.Influence from K88-GFP infection on WBC and a series of indexes was significant and the value of WBC、W-SCC、W-LCC was depressed seriously.RBC and a series of indexes were not affected apparently and the value of RBC、HCT、HGB only reduced at 6 hours compared with healthy mice.Also variance of the PLT and a series of indexes between infected mice and healthy was great,and the PLT value decreased greatly while the PLT value increased.ALT、AST which was the index standing for the function of liver and BUN、UA which was the index standing for the function of kidney increased observably,but no significant difference of TCHO、TG which was the index standing for the fat metabolism was observed.3.A Brevibacillus strain was isolated from soil which had an inhibitory effect on ETEC strain K88,Escherichia coli strain from chicken and Salmonella sp.A ployphasic taxonomy study including its morphology,physiological and biochemical characteristics,the analysis of fatty acid and 16S rDNA sequence was performed on the isolate,which showed that the strain represented as Brevibacillus brevis.4.The experiment showed that the optimal inhibitory effect was obtained when PB JK-2 was cultivated at 30 and the pH7 of medium for 24 hours and cultivated with pathogenic bacteria at the same time.PB JK-2 also increased the LD50 of the mice model of K88-GFP and leaved death of mice,so it suggested a probability of the protection mice from the infection with pathogenic bacteria.This study indicated that GFP as a novel fluorescent marker had a potential and convenient use in the research of colonization of pathogenic bacteria.K88 may be invasive and could colonize many organs and it impaired the function of liver and kidney seriously.The strain isolated from soil had an antagonistic effect on pathogenic bacteria in vivo and in vitro.It generates a prospect for the exploitation of probiotic and the antagonistic mechanism between pathogenic bacteria and probiotic.Key words:Enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC);Green fluorescent protein(GFP);Probiotics.目 录-V-目目 录录 1 前言前言 1 1.1 产肠毒素性大肠杆菌的研究概况 1.2 绿色荧光蛋白研究综述 1.3 益生素研究综述 1.4 本研究目的和意义 12 2 材料与方法材料与方法 13 2.1 材料 13 2.2 方法 14 3 结果与讨论结果与讨论 23 3.1 产肠毒素性大肠杆菌遗传转化及鉴定 23 3.1.1 产肠毒素性大肠杆菌遗传转化及荧光检测 23 3.1.2 标记菌株的分子鉴定 23 3.1.3 脂肪酸鉴定 24 3.1.4 血清型鉴定 24 3.1.5 标记菌株和原始菌株的微生物学异质性研究 25 3.1.6 讨论 27 3.2 产产肠毒素性大肠杆菌的致病特性研究 28 3.2.1 ETEC 小白鼠致病模型的建立 29 3.2.2 ETEC 感染小白鼠途径研究 29 3.2.3 ETEC 感染小白鼠的血液生理生化分析 31 3.2.4 讨论 33 3.3 益生菌 PB JK-2 的筛选、鉴定 44 3.3.1 抑菌筛选结果 44 3.3.2 细菌的鉴定 45 3.3.3 讨论 47 目 录-VI-3.4 益生菌 PB JK-2 抑菌活性研究 48 3.4.1 发酵动态对 PB JK-2 体外抑菌效果的影响 48 3.4.2 PB JK-2 对感染 K88-GFP 的小白鼠模型的疾病控制研究 51 3.4.3 讨论 51 4 总结与展望总结与展望 53 5 参考文献参考文献 55 致致 谢谢 62 Catalogue-VII-Catalogue 1 Introduction 1 1.1 The study of Enterotoxigenic Escherichia coli.1 1.2 The summarize of Green fluorescent protein.5 1.3 The summarize of Probiotics.8 1.4 Purpose and significance of this thesis.12 2 Materials and methods.13 2.1 Materials.13 2.2 Methods.14 3 Results and discussion.23 3.1 The transformation of ETEC and the identification.23 3.1.1 The transformation and the detection of fluorescence.23 3.1.2 The detection of PCR amplification of a structural gene in flagellum.23 3.1.3 The analysis of fatty acid.24 3.1.4 The serological identification.24 3.1.5 The compare of microbial characteristics.25 3.1.6 Discussion.27 3.2 The research of pathogenic characteristics of ETEC.28 3.2.1 The construction of mice model of ETEC29 3.2.2 The study of adherence and colonization of ETEC in organs of mice.29 3.2.3 The analysis of component and biochemical substances in serum.31 3.2.4 Discussion.33 3.3 The screening and identification of PB JK-244 3.3.1 The screening of strain.44 3.3.2 A ployphasic taxonomy study46 Catalogue-VIII-3.3.3 Discussion.47 3.4 The research of inhibitory effect.48 3.4.1 Influence of ferment on antagonistic effect.48 3.4.2 Influence of PB JK-2 on the model of mice.51 3.4.3 Discussion.51 4 Conclusion and Expectation 53 5 Reference.55 Acknowledgements.62 1 前言-1-1 前前 言言 1.1 产肠毒素性大肠杆菌的研究概况产肠毒素性大肠杆菌的研究概况 产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是一类引起人和幼畜（初生仔猪、犊牛、羔羊及断奶仔猪）腹泻的重要病原菌，初生幼畜被ETEC感染后，常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡，发病率和死亡率均很高，这是目前养殖业研究热点之一（周凯等，2003）。据估计，国内约有35%的仔猪腹泻是由ETEC引起的（杨正时，1987），美国等国家新生仔猪腹泻中，由ETEC引起的占45%以上（余志东，1992），给养殖业带来严重的经济损失。下面就ETEC病原学、致病机理、临床症状、治疗及防制等研究进展作概述。1.1.1 ETEC病原学特性病原学特性 ETEC属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）埃希氏菌属（Escherichia）成员，为革兰氏阴性的直杆菌。大小约50.8 m1.03.0 m，无芽孢，大多数菌株有动力，普通菌毛与性菌毛，有些菌株有多糖类荚膜。ETEC最佳生长温度为37，最佳pH值为7.27.4。在普通琼脂上生长良好，可形成圆形、边缘整齐、稍隆起、光滑、半透明的灰白色菌落。在鉴别性或选择性培养基上形成有颜色、直径23mm的光滑型菌落。生化反应：能分解多种糖(醇、苷)类，使其产酸或产气；吲哚试验和M.R.试验均为阳性；V.P.试验和柠檬酸盐利用试验均为阴性。易产生耐药性。胆盐、煌绿等对大肠杆菌有抑制作用。对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，但易耐药。迄今，已确定的ETEC O抗原有173种，K抗原有80种，H抗原有56种（陆承平，2001）。O抗原在菌体胞壁中，属多糖、磷脂与蛋白质的复合物，即菌体内毒素，耐热（120，2h），是大肠杆菌血清分群的基础，在鉴定和流行病学调查中十分有用，国内ETEC O抗原具有多样性和地域性，但同时存在着优势血清型，主要有O8、O9、O20、O45、O60、O101、O138、O139、O147、O149等。K抗原系表面多糖或蛋白质抗原，存在于荚膜、被膜或菌毛中，与细菌毒力有关。根据耐热性等不同，K抗原分为L、A、B三类。H抗原为不耐热的鞭毛蛋白质，具有良好的抗原性，H抗原能刺激机体产生高效价凝集抗体。1 前言-2-1.1.2 ETEC的毒力因子及致病机理的毒力因子及致病机理 ETEC的毒力因子包括粘附素（adhesin）、肠毒素（enterotoxin，Ent）、水肿病毒素（edema disease principle，EDP）、内毒素（endotoxin）、溶血素（hemolysin）以及新近才发现的Eat A（Patel S K et al.，2004），其中粘附素和肠毒素对是ETEC主要的致病因素（Levine，1987；Osek et al.，1992；袁万哲等，2005）。ETEC粘附素与O抗原群和肠毒素产生的关系见表1.1（房海，1997）。表1.1 ETEC粘附素与O抗原群和肠毒素产生的关系 Table 1.1 Relationship of O antigen，enterotoxin and fimbrial of ETEC 粘附素种类 来源 相关的主要O抗原群 肠毒素类型 LT ST LT+ST K88 仔猪 O8、O45、O60、O138、O139、O141、O147、O149、O157+（居多）K99 犊牛、羔羊、仔猪O8、O9、O20、O101、O64-+-987p 犊牛、羔羊、仔猪O9、O20、O141-+-1.1.2.1 粘附素粘附素 粘附是微生物定殖（colonization）的基础，也是细菌致病感染的先决条件之一。凡具有粘附作用的细菌结构成分，统称为粘附素或定居因子（colonization factor）。通常是细菌表面的一些大分子结构成分，主要是革兰氏阴性菌的菌毛，其次是非菌毛粘附素，如某些外膜蛋白以及革兰氏阳性菌的脂磷壁酸等。ETEC的蛋白性菌毛呈纤维型包在菌体抗原表面，具有保护细菌免受补体的杀灭和巨噬细胞的吞噬作用(Nagy et al.，1978)。这种ETEC特有的菌毛与普遍存在于大肠杆菌的I型菌毛不同，对红细胞的凝集反应不被D-甘露糖抑制，是一种甘露糖抵抗的血凝反应（房海，1997）。粘附素抗原主要有K88即F4（K88ab，K88ac，K88ad），K99（F5），987p（F6），F41，F42等几种，其中K88是最常见的（Gaastra et al.，1982），而K88变异体的主要形式是K88ac。ETEC菌毛，与肠粘膜上皮不同的受体结合（Ouwehand et al.，1996），定居在肠道上皮细胞上，避免因动物消化道不断蠕动而被迅速排出，为细菌大量生长繁殖和产生肠毒素致病创造条件。Bertin（1983）报道K88、K99抗原在小白鼠模型中可能不是必须的致病因子。ETEC受体在肠道各段的分布不均匀，使表达1 前言-3-不同粘附因子的ETEC表现出相应的组织嗜性（卫广森等，2005）。其中D-半乳糖是K88的受体，主要表达在小肠；神经节苷（GM）和D-半乳糖是K99的受体；糖蛋白、D-半乳糖和L-岩藻糖是987P的受体，两种菌毛受体主要在回肠表达；D-半乳糖是F41的受体，主要在小肠表达（潘玲等，1997）。粘附素是一种具有良好免疫原性的蛋白质性抗原，用带有粘附素的菌体或纯化的粘附素抗原免疫动物体均可以产生高效价的相应抗体，这也是研究粘附素疫苗的理论基础。1.1.2.2 肠毒素 肠毒素 肠毒素是一些致病性大肠杆菌在生长繁殖过程中产生并释放出来的一种蛋白质性外毒素。肠毒素主要包括耐热肠毒素（Heat-stable toxins，ST）、不耐热肠毒素（Heat-1abi1e toxins，LT）、Vero细胞毒素（Vero toxins）和血管渗透因子（Vessel permeate factor，VPF），ETEC产生的肠毒素主要是ST和LT。LT是一种高分子量寡聚体蛋白毒素，对热敏感，6530min或10020min 即被破坏，其结构和功能同霍乱肠毒素相似。它由1个具有酶活性的A亚单位和5个具有结合能力B亚单位组成。A亚基能催化与调控腺苷酸环化酶有关的一种膜蛋白腺苷二磷酸糖基化，是毒素的毒力活性部分。B亚基与是毒素主要的免疫原性部分，在免疫学上具有重要意义（Svennerholm，1998）。B亚基细胞膜上GM1神经节苷脂和糖蛋白受体结合，A亚基进入肠上皮细胞后，裂解活化为A1和A2两个片段。其A1片段激活胞浆内的腺苷酸环化酶，并使其活性不可逆，致使cAMP水平增高，从而改变细胞膜对水和盐离子的通透性，导致腺上皮细胞分泌功能亢进，引起Cl-、Na+、HCO3-和水在小肠内分泌增加，超过肠管重吸收能力，从而导致腹泻，过量的分泌导致脱水及代谢性酸中毒等，进而引起仔猪死亡（刘瑞田，1992；Inoue et al.，1993；卫广森等，2005）。ST是一种多半脱氨酸残基的小分子量单体毒素，对热稳定，10030min和1215min不被破坏。根据其是否溶于甲醇，ST可分为ST-1（STa或ST）和ST-2（STb或ST II）两种结构和功能完全不同的毒素。ST溶于甲醇，引起乳鼠和乳猪肠腔积液；ST II不溶于甲醇，不引起乳鼠和乳猪肠腔积液。ST II的致病机理还不清楚，它不能激活鸟苷酸环化酶和腺昔酸环化酶，也不能利用C-激酶旁路，1 前言-4-Thomas 等（1998）表明仅表达ST II的ETEC不能引起仔猪腹泻。ST I能激活颗粒性鸟苷酸环化酶，从而使肠上皮细胞内cGMP浓度升高，与LT一样，引起腺细胞分泌增加，最终导致腹泻。病原性大肠杆菌的异常增殖产生大量的胺、氨等，同时形成多量非生理性物质和大量气体，刺激肠粘膜，促进肠道损伤和肠管蠕动，使肠道分泌增加，加快肠毒素等有害物质的吸收，致使肠内渗透压升高，水分电解质吸收障碍，从而发生渗透性腹泻。仔猪大肠杆菌性腹泻的发生，是以仔猪的生理、免疫功能不完善为背景，以卫生防疫及饲养管理的不健全为条件，以ETEC的侵入感染和异常增殖为病因，再通过各种机制的作用，表现的综合症状和病理变化。首先ETEC依赖菌毛抗原等抵抗机体的防御并定居于小肠，然后进行繁殖并释放肠毒素和产生内毒素，同时在代谢过程中产生各种有毒物质，它们通过各自的作用机制导致或加重腹泻和肠道炎症（李鹏，2002）。1.1.3 防治措施防治措施 提高饲养水平增强仔猪自身的抵抗力，利用抗生素、血清疫苗或基因工程疫苗防治为目前防治仔猪腹泻的主要途径。在饲料中添加一定的抗生素基本上是目前最主要的一种防治仔猪腹泻的途径。随着抗菌药物的广泛应用，大肠杆菌的耐药、残留等问题日趋突出，耐药菌株不断增多，而且耐药谱也不断加宽，过去常用的一些抗菌药物如链霉素、庆大霉素、氯霉素等现在已成为许多地区的养猪场禁用药。人们不断开发出抗菌谱更广的药物，如头饱类、新喳诺酮类药物，在临床上也有非常理想的报道（姜卫东等，1998；汪明等，1999）。但一些现在认为有特效的药物，在若干年后仍然会由于耐药性问题变的毫无用处。随着人们对肠道免疫机制认识的逐步加深，以及对大肠杆菌肠道致病相关抗原类型研究的深入，接种疫苗所带来的经济效益越来越显著。国内外开展了预防ETEC 腹泻的各种类型疫苗研究，例如基因工程活菌苗、多价灭活菌苗以及植物表达系统产生疫苗（Huang YH et al.，2003）等。日前在国内外猪场中应用的疫苗主要有以下几种类型：自家苗、K88-K99 基因工程苗（张景六等，1985；陈章水 等，1992）、K88-K99-987p 三 价 菌 毛 灭 活 苗（Jin LiZhi,et al.）及1 前言-5-K88-K99-987p-F41 多价灭活菌苗（Nagy et al.，1978；戴鼎震等，2003；李鹏等，2004）以及各种单价灭活疫苗等。但由于大肠杆菌血清型多，变异大，抗原复杂，制苗菌株的血清型很难与地方菌株相一致，因而在生产上菌苗的使用效果反应不一，而且存在成本较高、基因工程安全性等问题。益生素（Probiotics）为一种活菌制剂，具有调节动物体内微生态平衡，提高机体免疫力，促进消化，提高饲料利用率等多方面的优点；同时，与抗生素相比，益生素还具有“无毒”、“无抗药性”、“无残留”、“无副作用”等特点。由于益生素的发展和相关研究的进步，利用益生素或相应有效物质喂养，提高仔猪自身的免疫力，进行仔猪腹泻的防治研究和相关试验正日益成为热点话题。早在1908年，Metchnikoff 就发现了与罗马尼亚农民长寿有关的“保加利亚杆菌”并将用它发酵的牛奶饲喂犊牛、仔猪，调整幼畜腹泻出现的菌群失调。日本可能是最早将活菌真正作为商品应用于畜禽饲养业的国家，由日本琉球大学的比嘉照夫教授30年代初研制的EM（Effective Microorganisms）微生态制剂，它是由光合细菌、乳酸杆菌、酵母菌和放线菌等10个属的80多种微生物复合而成的活性微生物制剂；真田等20世纪50年代曾提出给白猪饲喂酪酸菌减轻了仔猪下痢；继之星野等报道了芽孢杆菌制剂经口饲喂或添加在饲料中预防及治疗仔猪、犊牛的下痢。我国动物微生态制剂的研究和开发起始于20世纪70年代，何明清等（1980）等致力于畜禽下痢的研究，率先筛选到无病原性大肠杆菌SY30菌株制成大肠杆菌活菌制剂，预防仔猪黄痢收到良好效果，同年方定一用NY-10（大肠杆菌+乳酸杆菌）预防仔猪黄痢取得了明显的效果，从此为动物微生态制剂的研究、开发和产业化生产拉开了序幕。益生素概念的提出以及真正的发展还是在欧美，应用于动物生产的良好效果已被大量试验所肯定。1.2 绿色荧光蛋白研究综述绿色荧光蛋白研究综述 绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）标记系统具有标记基因小（约 1kb），检测荧光方便，对细胞安全、稳定等优点己被成功用于微生物定殖、对宿主组织侵染、微生物动态监测、基因表达调控等研究，因而为 ETEC 的致病机理研究提供一种有效工具。