红细胞免疫功能与其测定方法.ppt

红细胞免疫红细胞免疫(mi(mi ny)ny)功能及其测定方法功能及其测定方法 汇汇报报报报(hu(hu(hu(hu b b b b o o o o)人：王人：王 翀翀第一页，共二十二页。在肿瘤的发生发展过程中免疫功能起着重要的作用，过去的观点认为在肿瘤的发生发展过程中免疫功能起着重要的作用，过去的观点认为免疫功能主要和白细胞有关，而红细胞在其中所起的作用一直未受重免疫功能主要和白细胞有关，而红细胞在其中所起的作用一直未受重视。视。19811981年年siegelsiegel提出了红细胞免疫系统的新概念，开辟了机体免疫功提出了红细胞免疫系统的新概念，开辟了机体免疫功能研究的新纪元。红细胞作为人体血液有形成份的主要组成部分与肿能研究的新纪元。红细胞作为人体血液有形成份的主要组成部分与肿瘤细胞的接触机会瘤细胞的接触机会(j hu)(j hu)比其他细胞要大比其他细胞要大10001000倍。红细胞可以通过促吞倍。红细胞可以通过促吞噬作用、清除循环免疫复合物噬作用、清除循环免疫复合物(CIC)(CIC)、效应细胞样作用及对淋巴细胞、效应细胞样作用及对淋巴细胞和细胞因子的调控作用来达到抑制肿瘤的生长和转移的作用。在正常和细胞因子的调控作用来达到抑制肿瘤的生长和转移的作用。在正常情况下，红细胞免疫和白细胞免疫情况下，红细胞免疫和白细胞免疫(如如T T细胞、细胞、B B细胞、细胞、NKNK细胞、巨噬细胞、巨噬细胞细胞)在机体内相互联系、密切配合、协同作战，识别和清除肿瘤细在机体内相互联系、密切配合、协同作战，识别和清除肿瘤细胞，共同维持机体内环境的平衡和生物功能的稳定。胞，共同维持机体内环境的平衡和生物功能的稳定。第二页，共二十二页。1 红细胞与其它免疫反应红细胞与其它免疫反应(fnyng)(fnyng)细胞的比较细胞的比较 n n红细胞与其它红细胞与其它(qt)(qt)血细胞均来源于骨髓造血干细胞。血细胞均来源于骨髓造血干细胞。以往认为虽然它们来源相同，但功能各异，前者主以往认为虽然它们来源相同，但功能各异，前者主要是运输气体，而后者则参与免疫和防御机制。目要是运输气体，而后者则参与免疫和防御机制。目前研究表明，红细胞不仅具有呼吸功能，且同白细前研究表明，红细胞不仅具有呼吸功能，且同白细胞一样具有免疫功能。胞一样具有免疫功能。第三页，共二十二页。2 红细胞的免疫红细胞的免疫(miny)(miny)功能功能 2.1 增强吞噬作用增强吞噬作用 n n纳尔逊纳尔逊(Nelson)(Nelson)用肺炎球菌和梅毒螺旋体等进行体外实验，发现用肺炎球菌和梅毒螺旋体等进行体外实验，发现被相应抗体致敏的肺炎球菌或梅毒螺旋体，只有在含补体、红细被相应抗体致敏的肺炎球菌或梅毒螺旋体，只有在含补体、红细胞及白细胞的混合物中，胞及白细胞的混合物中，80809595能迅速能迅速(xn s)(xn s)被吞噬而从液被吞噬而从液相中消失；若缺少红细胞，则在较长时间内仅有少数被吞噬。相中消失；若缺少红细胞，则在较长时间内仅有少数被吞噬。19561956年年NelsonNelson又将抗体调理过的肺炎球菌注入猴体内，获得的结又将抗体调理过的肺炎球菌注入猴体内，获得的结果与体外实验相同，果与体外实验相同，100100的肺炎球菌粘附于红细胞。的肺炎球菌粘附于红细胞。第四页，共二十二页。n n粘附的复合物较悬浮于血浆中游离的复合物更易被吞噬。某粘附的复合物较悬浮于血浆中游离的复合物更易被吞噬。某些病毒在体内也能粘附于红细胞，从而被吞噬消灭。免疫粘些病毒在体内也能粘附于红细胞，从而被吞噬消灭。免疫粘附可以增强吞噬作用附可以增强吞噬作用4 45 5倍。红细胞还能阻止癌细胞在循环倍。红细胞还能阻止癌细胞在循环中播散，因在外周血中癌细胞遇到红细胞比遇到白细胞的机中播散，因在外周血中癌细胞遇到红细胞比遇到白细胞的机会多会多50050010001000倍。当癌细胞表面结合有抗体与补体时，则倍。当癌细胞表面结合有抗体与补体时，则可通过红细胞表面的可通过红细胞表面的C3bC3b受体，使癌细胞粘附于红细胞，故受体，使癌细胞粘附于红细胞，故容易被吞噬细胞捕捉与吞噬，从而防止癌细胞的转移容易被吞噬细胞捕捉与吞噬，从而防止癌细胞的转移(zhuny)(zhuny)与扩散。与扩散。n n红细胞还有吞噬细胞样的功能，因为在其细胞膜表面具有过氧化红细胞还有吞噬细胞样的功能，因为在其细胞膜表面具有过氧化物酶，该酶是典型的溶酶体酶，它可起着巨噬细胞样的杀伤作用。物酶，该酶是典型的溶酶体酶，它可起着巨噬细胞样的杀伤作用。第五页，共二十二页。2.2 红细胞的免疫红细胞的免疫(miny)(miny)粘附作用粘附作用 n n免疫粘附免疫粘附免疫粘附免疫粘附是指抗原是指抗原-抗体复合物与补体抗体复合物与补体C3bC3b结合后，可粘附于结合后，可粘附于灵长目或非灵长目的红细胞与血小板上，这一现象统称为灵长目或非灵长目的红细胞与血小板上，这一现象统称为“血细胞免疫粘附作用血细胞免疫粘附作用”。红细胞的免疫粘附活性是通过。红细胞的免疫粘附活性是通过I I型补型补体受体（体受体（complement receptor type Icomplement receptor type I，CR1)CR1)为基础实现的。为基础实现的。血循环中免疫复合物血循环中免疫复合物(IC)(IC)的清除主要由红细胞的清除主要由红细胞CR1CR1携带至肝携带至肝脾网状内皮系统交给巨噬细胞消灭。脾网状内皮系统交给巨噬细胞消灭。CR1CR1成簇分布，人类每成簇分布，人类每个红细胞大约表达个红细胞大约表达(biod)(biod)200200500500个个CR1CR1分子，主要配体为分子，主要配体为C3bC3b。该受体为糖蛋白，分子量为。该受体为糖蛋白，分子量为205 205，000000。红细胞上的。红细胞上的C3bC3b受体占血循环中受体占血循环中C3bC3b受体总数的受体总数的9595以上。因此，血循环以上。因此，血循环中的抗原中的抗原-抗体复合物遇到红细胞比遇到白细胞的机会多抗体复合物遇到红细胞比遇到白细胞的机会多5005001 0001 000倍。倍。第六页，共二十二页。2.3 防御防御(fngy)(fngy)感染感染 n n红细胞与细菌、病毒等微生物免疫粘附后，不仅可以通过过氧化物酶红细胞与细菌、病毒等微生物免疫粘附后，不仅可以通过过氧化物酶对它们产生对它们产生(chnshng)(chnshng)直接的杀伤作用，而且还可以促进吞噬细胞对它直接的杀伤作用，而且还可以促进吞噬细胞对它们的吞噬作用。因此，红细胞的免疫功能可以看作是机体抗感染免疫们的吞噬作用。因此，红细胞的免疫功能可以看作是机体抗感染免疫的因素之一。的因素之一。n n小结：小结：小结：小结：目前已知红细胞具有以下免疫功能：目前已知红细胞具有以下免疫功能：(1)(1)识别携带抗原；识别携带抗原；(2)(2)清除循环中免疫复合物；清除循环中免疫复合物；(3)(3)增强增强T T细胞依赖反应；细胞依赖反应；(4)(4)效效应细胞样作用；应细胞样作用；(5)(5)促进吞噬作用。而这些免疫功能的生理促进吞噬作用。而这些免疫功能的生理学基础即为红细胞免疫粘附作用。学基础即为红细胞免疫粘附作用。第七页，共二十二页。3 红细胞免疫功能异常红细胞免疫功能异常(ychng)(ychng)与疾病与疾病n n近年研究证实在某些病理状态近年研究证实在某些病理状态(zhungti)(zhungti)下，红细胞的免疫粘下，红细胞的免疫粘附活性可发生改变。附活性可发生改变。SiegelSiegel等检查了等检查了2323名宫颈癌、胃癌和直名宫颈癌、胃癌和直肠癌患者的红细胞免疫粘附功能，发现这些患者的红细胞粘肠癌患者的红细胞免疫粘附功能，发现这些患者的红细胞粘附抗原附抗原-抗体抗体-补体复合物的能力较正常人显著降低。这一资补体复合物的能力较正常人显著降低。这一资料提示在肿瘤的发展过程中，除可抑制白细胞免疫功能外，料提示在肿瘤的发展过程中，除可抑制白细胞免疫功能外，还可抑制红细胞的免疫功能。还可抑制红细胞的免疫功能。n n系统性红斑性狼疮（系统性红斑性狼疮（SLESLE）、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病，）、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病，是因为患者体内针对自身组织发生免疫反应所致。一般认为，自是因为患者体内针对自身组织发生免疫反应所致。一般认为，自身免疫病患者的细胞免疫和身免疫病患者的细胞免疫和/或体液免疫功能处于相对增强状态。或体液免疫功能处于相对增强状态。通过对此类病人红细胞免疫系统的研究结果表明，其免疫功能亦通过对此类病人红细胞免疫系统的研究结果表明，其免疫功能亦明显增强，且与白细胞免疫系统的功能改变相平行，这可能与自明显增强，且与白细胞免疫系统的功能改变相平行，这可能与自身免疫病患者血清中存在着红细胞身免疫病患者血清中存在着红细胞C3bC3b受体活性抑制因子有关。受体活性抑制因子有关。第八页，共二十二页。n n目前认为原发性癫痫和银屑病的发病也与自身免疫有关。郭峰等目前认为原发性癫痫和银屑病的发病也与自身免疫有关。郭峰等曾观察到这两种疾病患者的红细胞免疫功能的变化与曾观察到这两种疾病患者的红细胞免疫功能的变化与 SLE SLE 等其它等其它自身免疫病患者是一致的。自身免疫病患者是一致的。n n另外，再生障碍性贫血的患者，其红细胞的免疫粘附作用降低，另外，再生障碍性贫血的患者，其红细胞的免疫粘附作用降低，可能是由于患者造血功能障碍，所产生的红细胞数量少而且质量可能是由于患者造血功能障碍，所产生的红细胞数量少而且质量低劣，致使红细胞膜上的低劣，致使红细胞膜上的C3bC3b受体生成不足。慢性布氏菌病患者，受体生成不足。慢性布氏菌病患者，其红细胞免疫功能亦降低，致使清除其红细胞免疫功能亦降低，致使清除(qngch)(qngch)感染因子的能力减弱，感染因子的能力减弱，这种现象可能是引起该病经久不愈的原因之一。这种现象可能是引起该病经久不愈的原因之一。第九页，共二十二页。4 红细胞免疫功能红细胞免疫功能(gngnng)(gngnng)的检测及其临床意的检测及其临床意义义 4.1 红细胞红细胞C3b受体的测定受体的测定n n原理：原理：原理：原理：红细胞膜上的C3b受体(CR1)可与补体致敏的酵母菌粘附(zhn f)(zhn f)形成花环(RBC-C3bR花环)；同时红细胞膜上粘附(zhn f)(zhn f)的IC中C3b分子或抗原补体复合物中的C3b分子可与未致敏的酵母菌的酵母多糖粘附(zhn f)(zhn f)形成花环（RBC-IC花环）。第十页，共二十二页。n n意义：意义：意义：意义：RBC-C3bRRBC-C3bR花环率和花环率和RBC-ICRBC-IC花环率可作为红细胞天然免疫花环率可作为红细胞天然免疫粘附功能的指标。粘附功能的指标。（1 1）若两项指标都低下，判为原发性红细胞免疫功能低下，为红细）若两项指标都低下，判为原发性红细胞免疫功能低下，为红细胞膜胞膜C3bC3b受体受到破坏或遗传基因缺陷及其他影响所致。受体受到破坏或遗传基因缺陷及其他影响所致。（2 2）若）若RBC-C3bRRBC-C3bR花环率降低，而花环率降低，而RBC-ICRBC-IC花环率增高，则为继花环率增高，则为继发性红细胞免疫功能低下，是由于红细胞发性红细胞免疫功能低下，是由于红细胞CR1CR1上免疫复合物上免疫复合物或补体调理的抗原量增加所致。或补体调理的抗原量增加所致。（3 3）若这两项指标都上升，判断）若这两项指标都上升，判断(pndun)(pndun)为红细胞天然免疫功能亢进为红细胞天然免疫功能亢进与紊乱。与紊乱。第十一页，共二十二页。4.2 红细胞红细胞CR1数量数量(shling)(shling)的测定的测定 4.2.1 4.2.1 红细胞红细胞红细胞红细胞CR1CR1密度密度密度密度(md)(md)相关基因多态性测定方法相关基因多态性测定方法相关基因多态性测定方法相关基因多态性测定方法 DNADNA提取提取 PCR PCR扩增扩增 限制性片段长度多态性酶切分析（限制性片段长度多态性酶切分析（RFLPRFLP分析）分析）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳第十二页，共二十二页。4.2.2 4.2.2 红细胞红细胞红细胞红细胞CR1CR1流式细胞仪测定方法流式细胞仪测定方法流式细胞仪测定方法流式细胞仪测定方法 n n原理：单个红细胞原理：单个红细胞CR1CR1数量比白细胞数量比白细胞CR1CR1低，为了低，为了提高提高(t go)(t go)试验的敏感度，采用间接免疫荧光染色法试验的敏感度，采用间接免疫荧光染色法流式细胞仪检测技术。用鼠抗人红细胞流式细胞仪检测技术。用鼠抗人红细胞CR1CR1单抗与单抗与一定量待测纯红细胞数反应洗涤，再加羊抗鼠一定量待测纯红细胞数反应洗涤，再加羊抗鼠IgGIgG荧光标记抗体反应洗涤后，上流式细胞仪测定，算荧光标记抗体反应洗涤后，上流式细胞仪测定，算出荧光染色红细胞平均强度，为红细胞出荧光染色红细胞平均强度，为红细胞CR1CR1数量指数量指标。标。第十三页，共二十二页。n n具体操作程序：具体操作程序：具体操作程序：具体操作程序：在编号试管中分别加冷在编号试管中分别加冷PBS 50 lPBS 50 l，加入鼠抗人红细胞，加入鼠抗人红细胞CR1(CD35)CR1(CD35)单抗单抗1.5 l1.5 l及待测枸橼酸钠抗凝新鲜血及待测枸橼酸钠抗凝新鲜血0.5 l0.5 l，充分吹打混匀，置室温下避，充分吹打混匀，置室温下避光光30 min30 min。加入。加入PBSPBS液液2 ml2 ml，1500 r/min 1500 r/min 离心离心5 min5 min，弃上清液；加入，弃上清液；加入荧光素标记荧光素标记(bioj)(bioj)的第二抗体的第二抗体 羊抗鼠羊抗鼠IgG-FITC 1 lIgG-FITC 1 l，吹打混匀，吹打混匀，置室温下避光置室温下避光30 min30 min；再加入；再加入PBSPBS液液2 ml2 ml，充分混匀、洗涤，充分混匀、洗涤，1500 1500 r/min r/min 离心离心5 min5 min，弃去上清夜后加入，弃去上清夜后加入PBS 300 lPBS 300 l，混匀后置流式测试，混匀后置流式测试管中，严格按照流式细胞仪操作程序测定样品和对照品，在计算机屏管中，严格按照流式细胞仪操作程序测定样品和对照品，在计算机屏幕上显示或记录各待测标本红细胞平均荧光强度。幕上显示或记录各待测标本红细胞平均荧光强度。第十四页，共二十二页。n n意义：红细胞意义：红细胞CR1CR1数量流式细胞仪测定结合数量流式细胞仪测定结合CR1CR1基因多态性及红基因多态性及红细胞细胞CR1CR1活性测定，对临床上红细胞免疫功能缺陷与亢进活性测定，对临床上红细胞免疫功能缺陷与亢进(kngjn)(kngjn)分型更为客观，对临床辅助诊断及疗效指标都具有重要分型更为客观，对临床辅助诊断及疗效指标都具有重要应用价值。应用价值。4.2.3 4.2.3 红细胞红细胞红细胞红细胞CR1CR1单抗免疫酶联法（单抗免疫酶联法（单抗免疫酶联法（单抗免疫酶联法（ELISAELISA法）法）法）法）第十五页，共二十二页。5 5 正常正常(zhngchng)(zhngchng)红细胞与异常红细胞毛细管电泳红细胞与异常红细胞毛细管电泳分离分离n n能直接反映颗粒能直接反映颗粒(kl)(kl)电性质的毛细管电泳具有高效、简便、灵敏度电性质的毛细管电泳具有高效、简便、灵敏度高、样品消耗少等优点，在生化领域已经广泛应用于蛋白质及其衍生高、样品消耗少等优点，在生化领域已经广泛应用于蛋白质及其衍生物、肽类、氨基酸、糖类物质、无机离子、手性物质等的分离与分析。物、肽类、氨基酸、糖类物质、无机离子、手性物质等的分离与分析。n n运用毛细管电泳的方法可以对正常红细胞和被病毒感染的异常运用毛细管电泳的方法可以对正常红细胞和被病毒感染的异常红细胞进行比较，以此来反映鉴定不同状态的细胞。红细胞进行比较，以此来反映鉴定不同状态的细胞。第十六页，共二十二页。n n样品制备样品制备1)1)正常红细胞悬浮液正常红细胞悬浮液 用含用含6%6%葡萄糖的葡萄糖的0.1mol/L0.1mol/L，pH 7.4 pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释红细胞，的磷酸盐缓冲液稀释红细胞，通过血球板计数法，确定细胞浓度为通过血球板计数法，确定细胞浓度为1.86101.86107 7个个/mL/mL。2)2)异常红细胞悬浮液异常红细胞悬浮液 取上述浓度红细胞取上述浓度红细胞0.2 mL0.2 mL与与H1N1H1N1甲亚型流感病毒甲亚型流感病毒0.02 mL0.02 mL充分混充分混合合(hnh)(hnh)，常温，常温(25)(25)下反应下反应1 1。第十七页，共二十二页。n n电泳条件电泳条件 每天运行前用每天运行前用0.1 mol/L HCl0.1 mol/L HCl、0.1 mol/L NaOH0.1 mol/L NaOH、水、缓冲液分、水、缓冲液分别洗柱别洗柱3 3、6 6、3 3、3 min3 min；每轮运行前均用；每轮运行前均用0.1 mol/L NaOH 0.1 mol/L NaOH、水、水、缓冲液分别洗柱缓冲液分别洗柱3 3、1 1、1 min1 min；结束实验；结束实验(shyn)(shyn)时用时用0.1 mol/L 0.1 mol/L HCl HCl、0.1 mol/L NaOH 0.1 mol/L NaOH和水分别洗柱和水分别洗柱5 5、1010、5 min5 min，最后将毛，最后将毛细管内壁吹干保存。正极进样，负极检测，均在室温下进行。细管内壁吹干保存。正极进样，负极检测，均在室温下进行。进样压力进样压力3.448 kPa3.448 kPa，进样时间，进样时间5 s5 s；分离电压；分离电压20 kV20 kV；紫外检测；紫外检测波长波长214 nm214 nm；分离温度；分离温度2525。第十八页，共二十二页。n n感染病毒后，在病毒作用下红细胞表面荷电量会发生感染病毒后，在病毒作用下红细胞表面荷电量会发生改变，致使细胞电泳改变，致使细胞电泳(din y(din y n n)速度和速度和zetazeta电位发生改变。电位发生改变。实验证明，被病毒感染的红细胞与正常的红细胞的出实验证明，被病毒感染的红细胞与正常的红细胞的出峰时间有明显的差别（被病毒感染的红细胞出峰时间峰时间有明显的差别（被病毒感染的红细胞出峰时间要比正常的红细胞出峰时间晚），且峰形有了显著的要比正常的红细胞出峰时间晚），且峰形有了显著的变化。变化。第十九页，共二十二页。n n细胞的电泳行为与细胞表面的电荷量直接相关，而细胞表细胞的电泳行为与细胞表面的电荷量直接相关，而细胞表面的电荷量是由细胞膜上的生物大分子的化学基团的离子面的电荷量是由细胞膜上的生物大分子的化学基团的离子化和表面吸附的离子决定的，病变的细胞其表面成分发生化和表面吸附的离子决定的，病变的细胞其表面成分发生改变，其带电性也有所改变，因此通过检测细胞的电泳行改变，其带电性也有所改变，因此通过检测细胞的电泳行为，了解细胞损伤程度为，了解细胞损伤程度(chngd)(chngd)，有助于预测疾病的发生。，有助于预测疾病的发生。第二十页，共二十二页。谢谢 谢！谢！第二十一页，共二十二页。内容(nirng)总结红细胞免疫功能及其测定方法。系统性红斑性狼疮（SLE）、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病(jbng)，是因为患者体内针对自身组织发生免疫反应所致。限制性片段长度多态性酶切分析（RFLP分析）。运用毛细管电泳的方法可以对正常红细胞和被病毒感染的异常红细胞进行比较，以此来反映鉴定不同状态的细胞。谢 谢第二十二页，共二十二页。