第二章--细胞破碎与提取要点.ppt

第二章第二章蛋白质的制备蛋白质的制备-细胞破碎细胞破碎(psu)与萃取与萃取第一页，共九十二页。第一节第一节蛋白质制备蛋白质制备(zhbi)总则总则 来源来源(liyun)(liyun)、胞内（胞外）、胞内（胞外）、可溶性、可溶性、分子大小、分子大小、等电点、等电点、稳定性稳定性（对温度、（对温度、pHpH、蛋白酶、金属离子的耐受性）、蛋白酶、金属离子的耐受性）等等二、方法二、方法(fngf)选择依据：选择依据：根据不同蛋白质的根据不同蛋白质的性质性质和和研究目的研究目的一、目标：高效率、高收率、高纯度、高活性一、目标：高效率、高收率、高纯度、高活性1 1、蛋白质的性质：、蛋白质的性质：第二页，共九十二页。工业化应用工业化应用(yngyng)(yngyng)：经济性（高收率，纯度次要）：经济性（高收率，纯度次要）一般研究：一般研究：80%-90%80%-90%纯度纯度 结构研究：结构研究：95%95%以上纯度以上纯度 医疗：全面分析医疗：全面分析2 2、研究、研究(ynji)(ynji)目的：目的：越到后面的纯化越困难，增加越到后面的纯化越困难，增加(zngji)(zngji)成本，延长操作时间，收率低成本，延长操作时间，收率低 考虑产品的质量、数量和经济性考虑产品的质量、数量和经济性第三页，共九十二页。三、确立三、确立(qul)有效成分的测定方法有效成分的测定方法1、蛋白质初步提取、蛋白质初步提取(tq)和浓缩和浓缩l 吸附法吸附法l超滤法超滤法l沉淀法（盐析沉淀法（盐析(ynx)、有机溶剂沉淀、等电点沉淀）、有机溶剂沉淀、等电点沉淀）l透析透析第四页，共九十二页。三、确立三、确立(qul)有效成分的测定方法有效成分的测定方法2、蛋白质高效、蛋白质高效(o xio)分离纯化分离纯化l 色谱法色谱法（凝胶过滤、离子交换、亲和色谱等）（凝胶过滤、离子交换、亲和色谱等）l电泳电泳(dinyn)法法（聚丙烯酰胺凝胶、等电聚焦、毛细管电泳等）（聚丙烯酰胺凝胶、等电聚焦、毛细管电泳等）第五页，共九十二页。3、根据、根据(gnj)蛋白质性质确立分离方法蛋白质性质确立分离方法l溶解度不同溶解度不同：等电点，有机溶剂，盐析：等电点，有机溶剂，盐析l电荷不同电荷不同：电泳，离子交换：电泳，离子交换l分子分子(fnz)形状大小不同：形状大小不同：离心，透析，凝胶过滤离心，透析，凝胶过滤第六页，共九十二页。四、蛋白质的制备四、蛋白质的制备(zhbi)流程：流程：原料原料(yunlio)(yunlio)液液细胞分离细胞分离(fnl)(fnl)(离心，过离心，过滤滤)细胞胞内产物细胞胞内产物细胞破碎细胞破碎碎片分离碎片分离清液胞外产物清液胞外产物粗分离粗分离(盐析、萃取、超过滤等盐析、萃取、超过滤等)纯化纯化(层析、电泳层析、电泳)脱盐脱盐(凝胶过滤、超过滤凝胶过滤、超过滤)浓缩浓缩(超过滤超过滤)精制精制(结晶、干燥结晶、干燥)包含体包含体溶解溶解(加盐酸胍、脲加盐酸胍、脲)复性复性第七页，共九十二页。首先首先(shuxin)：l材料的选择和预处理材料的选择和预处理l细胞细胞(xbo)的破碎和细胞的破碎和细胞(xbo)组分分离组分分离l有效成分的萃取有效成分的萃取第八页，共九十二页。第二节第二节材料的选择材料的选择(xunz)、预处理与保存、预处理与保存一、原料选择(xunz)原则：有效成分含量高、原料来源有效成分含量高、原料来源(liyun)丰富，易得；丰富，易得；原料中杂质含量少；原料中杂质含量少；原料成本低等；原料成本低等；植物采收植物采收具有季节性具有季节性微生物生长微生物生长的对数期的对数期注意动物的注意动物的年龄与性别年龄与性别第九页，共九十二页。微生物：微生物：及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜(bo xin)处理。处理。二、原料(yunlio)的预处理：动物原料：动物原料：采集后要立即处理，去除结缔组织、采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速脂肪组织等，并迅速(xn s)冷冻贮存。冷冻贮存。植物原料：植物原料：要择时采集并就地去除不用的的部分，要择时采集并就地去除不用的的部分，有用部分保鲜处理。有用部分保鲜处理。第十页，共九十二页。（3 3）防腐剂保鲜）防腐剂保鲜：常用常用常用常用(chn(chn yn yn)乙醇、苯酚等。适用于液体原乙醇、苯酚等。适用于液体原乙醇、苯酚等。适用于液体原乙醇、苯酚等。适用于液体原 料，如发酵液、提取液等。料，如发酵液、提取液等。料，如发酵液、提取液等。料，如发酵液、提取液等。三、原料的保存(bocn)方法（1 1）冷冻法）冷冻法：适用于所有生物原料适用于所有生物原料适用于所有生物原料适用于所有生物原料(yunlio)(yunlio)。常用。常用。常用。常用-40-40速冻。速冻。速冻。速冻。（2 2）有机溶剂脱水法：）有机溶剂脱水法：丙酮，该法适用于原料少而价值高、丙酮，该法适用于原料少而价值高、丙酮，该法适用于原料少而价值高、丙酮，该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。第十一页，共九十二页。第三节第三节细胞细胞(xbo)破碎破碎一、破碎一、破碎(p su)(p su)方法的原则和依据方法的原则和依据 原则原则(yunz)(yunz)：最大提取、不易变性、减少干扰：最大提取、不易变性、减少干扰具体须从具体须从材料特性材料特性和和目的物特性目的物特性综合考虑。综合考虑。第十二页，共九十二页。1、材料细胞、材料细胞(xbo)的特性的特性l动物细胞无细胞壁，易破碎，只需用温和方法动物细胞无细胞壁，易破碎，只需用温和方法l植物细胞植物细胞(xbo)有细胞有细胞(xbo)壁难破碎，须用中等或强度大的方壁难破碎，须用中等或强度大的方法法l微生物细胞较复杂，一般用较强的方法微生物细胞较复杂，一般用较强的方法第十三页，共九十二页。2、目的物的特性、目的物的特性(txng).处理量处理量l 有些有些(yuxi)(yuxi)处理量大，如组织捣碎机等。处理量大，如组织捣碎机等。l 有些处理量少，如超声波破碎等。有些处理量少，如超声波破碎等。细胞中的位置细胞中的位置游离状：只需温和破碎游离状：只需温和破碎(p su)(p su)，除去不溶部分。，除去不溶部分。结合状：结合在膜或细胞器内，先收集膜或细胞器，再破碎结合状：结合在膜或细胞器内，先收集膜或细胞器，再破碎敏感性敏感性 温度、温度、pHpH、氧、剪切力、杂酶等影响、氧、剪切力、杂酶等影响第十四页，共九十二页。机械机械(jxi)法法1.组织组织(zzh)捣碎机：捣碎机：适用：动植物组织适用：动植物组织二、破碎二、破碎(p su)(p su)方法方法l原理：机械运动产生剪切力的作用破细胞原理：机械运动产生剪切力的作用破细胞l具体方法：具体方法：2.匀浆器匀浆器 适用：较柔软、易分散的组织细胞适用：较柔软、易分散的组织细胞3.研钵研钵 适用：微生物（细菌）与植物细胞适用：微生物（细菌）与植物细胞第十五页，共九十二页。物理物理(wl)法法1超声波破碎超声波破碎(psu)2渗透压冲击法：渗透压冲击法：适用：处理胞壁较脆弱的微生物。适用：处理胞壁较脆弱的微生物。细胞放在高渗溶液中，由于细胞放在高渗溶液中，由于(yuy)渗透压作用，细胞内水分向外渗出，渗透压作用，细胞内水分向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于缓冲液中，由于(yuy)渗透压发生突然变化，胞外的水分迅速渗入胞渗透压发生突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂内，使细胞快速膨胀而破裂第十六页，共九十二页。3反复冻融法：反复冻融法：-15-20，适用：动物材料适用：动物材料将待破碎的细胞冷至将待破碎的细胞冷至15到到20，然后放于室温，然后放于室温(或或40)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。这种方法简单方便，但液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化要注意那些对温度变化(binhu)敏感的蛋白质不宜采用此法。敏感的蛋白质不宜采用此法。4急热骤冷法：急热骤冷法：8590数分钟，冰浴冷却数分钟，冰浴冷却适用：细菌适用：细菌(xjn)及病毒中对热不太敏感的物质及病毒中对热不太敏感的物质第十七页，共九十二页。化学法化学法2表面活性剂法表面活性剂法破坏细胞膜，释放破坏细胞膜，释放(shfng)目的物（需与其它方法结合应用）。目的物（需与其它方法结合应用）。1溶剂处理溶剂处理(chl)法：法：丙酮、氯仿、甲苯等丙酮、氯仿、甲苯等溶解胞膜上脂质化合物，使细胞结构破坏。溶解胞膜上脂质化合物，使细胞结构破坏。第十八页，共九十二页。（四）酶解法（四）酶解法(jif)2外加酶法外加酶法 将细胞壁分解，使内含物释放出来。将细胞壁分解，使内含物释放出来。l细菌：加溶菌酶（结合反复细菌：加溶菌酶（结合反复(fnf)(fnf)冻融或加冻融或加EDTAEDTA）l酵母：采用酵母：采用-葡聚糖酶葡聚糖酶l霉菌：添加几丁质酶霉菌：添加几丁质酶l植物材料：加纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等。植物材料：加纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等。1自溶法自溶法保温一定时间，通过保温一定时间，通过(tnggu)细胞本身的酶将细胞破坏。细胞本身的酶将细胞破坏。第十九页，共九十二页。例：外源蛋白例：外源蛋白(dnbi)在大肠杆菌中的积累在大肠杆菌中的积累蛋白蛋白0 0产物占菌体总蛋白产物占菌体总蛋白/%/%外源蛋白的积累外源蛋白的积累人胰岛素人胰岛素50%50%形成包形成包含含体体-丙酰胺酶丙酰胺酶20%20%在细胞间区在细胞间区-人体干扰素人体干扰素25%25%形成包形成包含含体体凝乳酶原凝乳酶原形成包形成包含含体体牛生长激素牛生长激素30%30%形成包形成包含含体体-内酰胺酶内酰胺酶形成间区包形成间区包含含体体人胰岛素原人胰岛素原5%26%5%26%形成包形成包含含体体三、包含三、包含(bohn)(bohn)体及其纯化体及其纯化第二十页，共九十二页。l包涵体（inclusion bodies），或包含体，是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。细胞破碎后，包涵体呈颗粒状，致密，低速离心就可以沉淀。包涵体难溶于水中，在变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中才能溶解。在这些溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被破坏(phui)，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏(phui)。因此当除去变性剂时，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质的复性。第二十一页，共九十二页。l包涵体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物(chnw)。这些基因表达产物(chnw)没有生物活性。为此，欲获得天然活性态的目标产物(chnw)，必需分离包涵体后，溶解包涵体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。所以，包涵体的出现不仅增加了生化工程师生物分离设计的难度，也为生物化学家的蛋白质折叠（protein folding）机理研究提出了新的课题。第二十二页，共九十二页。l重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，开辟了现代生物技术发展的新纪元。但是，人们在分离纯化基因工程表达产物时遇到了意想不到的困难，很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物（如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白细胞介素、人干扰素等）不仅不能分泌到细胞外、而且在细胞内凝聚(nngj)成没有生物活性的固体颗粒包涵体（inclusion bodies IBs)。第二十三页，共九十二页。2、包含、包含(bohn)体的构成体的构成l基因表达基因表达(biod)(biod)产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。所以没有生物活性。l分离包含体后，需使目标分离包含体后，需使目标(mbio)(mbio)蛋白恢复应有的天然活性。蛋白恢复应有的天然活性。（蛋白质折叠）（蛋白质折叠）l 包含体主要包含体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。第二十四页，共九十二页。3 3、包含包含(bohn)(bohn)体特点体特点:l是无定形的蛋白质的聚集是无定形的蛋白质的聚集(jj)(jj)，不被任何膜所包围，不被任何膜所包围。l包含包含(bohn)体难溶于水，易溶于变性剂（如盐酸胍、脲）。体难溶于水，易溶于变性剂（如盐酸胍、脲）。l细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密，离心（细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密，离心（5000-20000g15min）就可以沉淀。）就可以沉淀。第二十五页，共九十二页。几种常见的工艺几种常见的工艺(gngy)(gngy)路线（一）路线（一）机械机械(jxi)(jxi)破碎破碎(高压匀浆、高速珠磨）高压匀浆、高速珠磨）差速离心提取差速离心提取(tq)出包含体出包含体加变性剂溶解加变性剂溶解除变性剂复性除变性剂复性基因工程包含体的纯化方法基因工程包含体的纯化方法第二十六页，共九十二页。路线路线(lxin)(lxin)1 1 的特点的特点 特点特点:用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素分开，摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单等杂质，使后面的分离纯化简单(jindn)(jindn)。缺点缺点:要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。工时间较长。基因工程包含基因工程包含(bohn)体的纯化方法体的纯化方法第二十七页，共九十二页。几种几种(j zhn)(j zhn)常见的工艺路线（二）常见的工艺路线（二）机械机械(jxi)(jxi)破碎破碎膜分离除可溶性蛋白膜分离除可溶性蛋白(dnbi)(dnbi)加变性剂溶解包含体加变性剂溶解包含体除变性剂复性除变性剂复性基因工程包含体的纯化方法基因工程包含体的纯化方法第二十八页，共九十二页。路线路线(lxin)(lxin)2 2 的特点的特点l优点：优点：应用了膜分离技术应用了膜分离技术(jsh)(jsh)，用微孔膜除去可溶性蛋白质，用微孔膜除去可溶性蛋白质，封闭式操作，不污染环境也不受环境污染。封闭式操作，不污染环境也不受环境污染。基因工程包含基因工程包含(bohn)体的纯化方法体的纯化方法缺点：缺点：细胞碎片和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵细胞碎片和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常导致可溶性蛋白质的滞留。塞和浓差极化常导致可溶性蛋白质的滞留。第二十九页，共九十二页。几种几种(jzhn)常见的工艺路线（三）常见的工艺路线（三）化学化学(huxu)(huxu)破碎破碎（加变性剂）（加变性剂）离心除细胞离心除细胞(xbo)(xbo)碎片碎片除变性剂复性除变性剂复性基因工程包含体的纯化方法基因工程包含体的纯化方法第三十页，共九十二页。路线路线(lxin)(lxin)3 3 特点：特点：基因工程基因工程(jyngngchng)包含体的纯化方包含体的纯化方法法优点：优点：化学法破碎，所采用的试剂化学法破碎，所采用的试剂(shj)(shj)既可以破碎又可以既可以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。比前两者更适合于实验室操作。缺点：缺点：所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。带来困难。第三十一页，共九十二页。一、概述一、概述(ish)第四节第四节 萃取萃取(cuq)(cuq)1、基本概念及分类、基本概念及分类概念：概念：萃取是利用萃取是利用(lyng)溶质在互不混溶的两相之间分配溶质在互不混溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的技术。系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的技术。第三十二页，共九十二页。液液-固萃取固萃取(cuq)液液-液萃取液萃取(cuq)化学化学(huxu)萃取萃取物理萃取物理萃取双水相萃取双水相萃取超临界萃取超临界萃取萃取原理萃取原理参与溶质参与溶质分配的两分配的两相不同相不同分类：分类：第三十三页，共九十二页。概念概念：用某种溶剂：用某种溶剂(rngj)(rngj)把有用物质从固体原料中提取把有用物质从固体原料中提取到溶液中的过程称为固到溶液中的过程称为固-液萃取，也称液萃取，也称浸取或浸出浸取或浸出。应用：应用：v用温水从甜菜中提取糖，用温水从甜菜中提取糖，v用有机溶剂从大豆用有机溶剂从大豆(ddu)(ddu)、花生等油料作物中提取食用油，、花生等油料作物中提取食用油，v用水或有机溶剂从植物中提取药物、香料或色素等。用水或有机溶剂从植物中提取药物、香料或色素等。液液-固萃取固萃取(cuq)第三十四页，共九十二页。用溶剂用溶剂从溶液中抽提物质从溶液中抽提物质(wzh)(wzh)叫液叫液-液萃取，也称溶液萃取，也称溶剂萃取剂萃取。经典的液。经典的液-液萃取指的是有机溶剂萃取液萃取指的是有机溶剂萃取液液-液萃取液萃取(cuq)有机溶剂萃取法广泛应用于抗生素、有机酸、维生素、有机溶剂萃取法广泛应用于抗生素、有机酸、维生素、激素等发酵产物工业规模激素等发酵产物工业规模(gum)(gum)的提取上。的提取上。应用应用比化学沉淀法分离程度高；比化学沉淀法分离程度高；比离子交换法选择性好、传质快；比离子交换法选择性好、传质快；比蒸馏法能耗低；比蒸馏法能耗低；生产能力大、周期短、便于连续操作、易实现自动化控制生产能力大、周期短、便于连续操作、易实现自动化控制优点优点第三十五页，共九十二页。溶剂萃取法和其他新型溶剂萃取法和其他新型(xnxng)分离技术相结合，产生分离技术相结合，产生了一系列新型分离技术：了一系列新型分离技术：q超临界流体萃取超临界流体萃取（Supercritical fluid extraction）q反胶团萃取反胶团萃取（Reversed micelle extraction）q双水相萃取技术双水相萃取技术（Partition of two aqueous phase system）液液-液萃取液萃取(cuq)用于高品质的天然物质、胞内物质（胞内酶、用于高品质的天然物质、胞内物质（胞内酶、蛋白质、多肽、核酸等）的分离蛋白质、多肽、核酸等）的分离(fnl)提取上。提取上。第三十六页，共九十二页。根据(gnj)萃取原理分类的 基本概念化学萃取化学萃取利用脂溶性萃取剂与溶质之间发生利用脂溶性萃取剂与溶质之间发生(fshng)化学反应生成化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相分配的过程。脂溶性复合分子实现溶质向有机相分配的过程。物理萃取物理萃取溶质根据相似相溶的原理溶质根据相似相溶的原理(yunl)在两相间达到分配在两相间达到分配平衡而进行萃取的分离过程。平衡而进行萃取的分离过程。第三十七页，共九十二页。2、萃取技术的操作(cozu)特点l萃取过程具有选择性萃取过程具有选择性l能与其他能与其他(qt)纯化步骤相配合纯化步骤相配合l适用于各种不同的规模适用于各种不同的规模l传质速度快，生产周期短，便于连续操作传质速度快，生产周期短，便于连续操作 第三十八页，共九十二页。3、萃取需要考虑下列(xili)问题l生物系统的错综复杂生物系统的错综复杂(cuzngfz)和多组分特和多组分特性性l产物产物(chnw)的不稳定性的不稳定性l相分离性能相分离性能第三十九页，共九十二页。v把目标物质从第一个液相中依靠更强大的把目标物质从第一个液相中依靠更强大的溶解力抽提到第二个液相中。溶解力抽提到第二个液相中。v物质的溶解和相似相溶原理。物质的溶解和相似相溶原理。v萃取是通过溶质萃取是通过溶质(rngzh)(rngzh)在两个液相之间的在两个液相之间的竟争性溶解（分配）而实现的。竟争性溶解（分配）而实现的。二、溶剂萃取技术(jsh)（液-液萃取）第四十页，共九十二页。影响萃取影响萃取(cuq)(cuq)操作的因素：操作的因素：a.a.温度温度(wnd)(wnd)b.b.pHpH值值c.c.盐分盐分温度温度互溶性增大；互溶性增大；温度温度产物稳定性提高，粘度产物稳定性提高，粘度(zhn d)(zhn d)增加，扩散性能减小。增加，扩散性能减小。影响分配系数，影响物质解离情况影响分配系数，影响物质解离情况无机盐类如硫酸铵、氯化钠等一般可降低产物在水中的无机盐类如硫酸铵、氯化钠等一般可降低产物在水中的溶解度而使其更易于转入有机溶剂相中，另一方面还能溶解度而使其更易于转入有机溶剂相中，另一方面还能减小有机溶剂在水相中的溶解度。减小有机溶剂在水相中的溶解度。盐分盐分分配系数分配系数第四十一页，共九十二页。d d乳化乳化(rhu)(rhu)分散分散(fnsn)非均相非均相一种一种(y zhn)另一种另一种乳剂乳剂均相均相（溶液）（溶液）l乳化即水或有机溶剂以微小液滴分散在有机相或水相中的现象。乳化即水或有机溶剂以微小液滴分散在有机相或水相中的现象。第四十二页，共九十二页。乳化剂类型乳化剂类型(lixng)乳状液乳状液 可分为可分为两大类型两大类型水包油，水包油，O/W，油分散在水中油分散在水中油包水，油包水，W/O，水分散在油中水分散在油中O/W(水包油型水包油型)W/O(油包水型油包水型)第四十三页，共九十二页。（亲憎平衡（亲憎平衡(pnghng)(pnghng)值）值）lHLBHLB数即亲水与亲油平衡数即亲水与亲油平衡(pnghng)(pnghng)程度，程度，HLBHLB数越大，亲水性数越大，亲水性越强，形成越强，形成O/WO/W型乳浊液，型乳浊液，HLBHLB数越小，亲油性越强，形成数越小，亲油性越强，形成W/OW/O型乳浊液。型乳浊液。第四十四页，共九十二页。乳化乳化(rhu)与去乳化与去乳化(rhu)在发酵液中，蛋白质是引起乳化在发酵液中，蛋白质是引起乳化在发酵液中，蛋白质是引起乳化在发酵液中，蛋白质是引起乳化(rhu)(rhu)(rhu)(rhu)的最重要的表面活性物质。的最重要的表面活性物质。的最重要的表面活性物质。的最重要的表面活性物质。由蛋白质引起的乳化多为水包油型（由蛋白质引起的乳化多为水包油型（由蛋白质引起的乳化多为水包油型（由蛋白质引起的乳化多为水包油型（O/WO/W）。）。）。）。l乳化带来的问题：有机相和水相分相困难，出现乳化带来的问题：有机相和水相分相困难，出现(chxin)(chxin)夹带。夹带。第四十五页，共九十二页。破乳的方法破乳的方法(fngf)：1.加热加热(ji r)破乳破乳 升温加速乳状液液珠的布朗运动使絮凝速率加快，同时使升温加速乳状液液珠的布朗运动使絮凝速率加快，同时使界面粘度迅速降低界面粘度迅速降低(jingd)，使聚结速率加快，有利于膜的破裂。，使聚结速率加快，有利于膜的破裂。2.高压电破乳高压电破乳 高压电场的破乳较复杂不能只看作扩散双电层的破坏，高压电场的破乳较复杂不能只看作扩散双电层的破坏，在电场下液珠质点可排成一行，呈珍珠项链式，当电压升在电场下液珠质点可排成一行，呈珍珠项链式，当电压升到某一值时，聚结过程在瞬间完成。到某一值时，聚结过程在瞬间完成。第四十六页，共九十二页。3.过滤过滤(gul)破乳破乳 当乳状液经过一个当乳状液经过一个(y)多孔性介质时，由于油和水对固体多孔性介质时，由于油和水对固体润湿性的差别，也可引起破乳。润湿性的差别，也可引起破乳。4.化学化学(huxu)破乳破乳 化学破乳的原则是破坏吸附在界面上的乳化剂，使其失去乳化学破乳的原则是破坏吸附在界面上的乳化剂，使其失去乳化能力。常用的是使用破乳剂。破乳剂也是一种表面活性剂，有化能力。常用的是使用破乳剂。破乳剂也是一种表面活性剂，有很高的表面活性，能将界面上原来存在的乳化剂顶替走；但破乳很高的表面活性，能将界面上原来存在的乳化剂顶替走；但破乳剂分子一般具有分支结构，不能在界面上紧密排列成牢固的界面剂分子一般具有分支结构，不能在界面上紧密排列成牢固的界面膜，从而使乳状液的稳定性大大降低。膜，从而使乳状液的稳定性大大降低。第四十七页，共九十二页。5.电解质破乳电解质破乳 对于稀的乳状液，起稳定作用的是扩散对于稀的乳状液，起稳定作用的是扩散(kusn)双电层，加入电解质可破坏双电层，也能使乳状双电层，加入电解质可破坏双电层，也能使乳状液聚沉液聚沉第四十八页，共九十二页。三三反胶束萃取反胶束萃取(cuq)（反胶团萃取（反胶团萃取(cuq)）第四十九页，共九十二页。1、基本基本(jbn)术语术语胶胶束束(micelles):向向水水中中加加入入表表面面活活性性剂剂，水水溶溶液液的的表表面面张张力力随随S增增大大而而下下降降。当当S达达到到一一定定值值后后，溶溶液液的的表表面面张张力力不再随表面活性剂浓度的增大而降低不再随表面活性剂浓度的增大而降低(jingd)。临临界界胶胶束束浓浓度度(critical micelle concentration,CMC):S在在水溶剂中形成胶束的最低浓度。水溶剂中形成胶束的最低浓度。第五十页，共九十二页。l反胶束反胶束(reversemicelles):若向若向有机溶剂有机溶剂中加入中加入(jir)一定浓度一定浓度S和水，在有机溶剂中所会形成内部含少量水和水，在有机溶剂中所会形成内部含少量水的胶束。的胶束。l微水相或微水相或“水池水池”(waterpool)：反胶束内溶解反胶束内溶解的水。的水。第五十一页，共九十二页。第五十二页，共九十二页。2反胶束的溶解反胶束的溶解(rngji)作用作用微水池溶解微水池溶解(rngji)和分离作用和分离作用：反反胶胶团团的的微微水水池池的的水水可可溶溶解解氨氨基基酸酸、肽肽和和蛋蛋白白质质等等生生物物分分子子,为为生生物物分分子子提提供供易易于于生生存存的的亲亲水水微微环环境境.因因此此,反反胶胶团团萃萃取取可可用用于于氨氨基基酸酸、肽肽和和蛋蛋白白质质等等生生物物分分子子的的分分离离纯纯化化，特特别别是是蛋白质类生物大分子。蛋白质类生物大分子。第五十三页，共九十二页。2反胶束的溶解反胶束的溶解(rngji)作用作用溶解推动力溶解推动力A静电作用：静电作用：理理论论上上,当当溶溶质质所所带带电电荷荷与与表表面面活活性性剂剂相相反反时时,由由于于静静电电引引力力的的作作用用,溶溶质质易易溶溶于于反反胶胶团团,溶溶解解率率或或分分配配系系数数(xsh)(xsh)较较大大,反反之之,则则不不能能溶溶解解到反胶团相中到反胶团相中,左左图图为为pHpH值值对对不不同同蛋蛋白白质质的的溶溶解解率率急急剧剧变变化化,当当pH7,pH7,即即在在带带正正电电荷荷的的pHpH范范围围内内蛋蛋白白质质的的溶溶解解率率接接近近100%,100%,说说明明静静电电相相互互作作用用对对蛋蛋白白质质的的反反胶胶团团萃萃取取起起决决定性作用。定性作用。第五十四页，共九十二页。2、反胶束的溶解、反胶束的溶解(rngji)作用作用B B 空间相互作用空间相互作用 盐盐浓浓度度增增大大对对反反胶胶团团相相产产生生脱脱水水效效应应,含含水水率率W W0 0随随盐盐浓浓度度的的增增大大而而降降低低,反反胶胶团团直直径径减减小小,空空间间排排阻阻作作用用增增大大,propro溶溶解解下下降降.如如，AOT/AOT/异异辛辛烷烷系系统统的的含含水水率率与与I I-0.5-0.5成成正正比。比。图图还还示示：AOT/AOT/异异辛辛烷烷系系统统的的含含水水率率与与AOTAOT浓浓度度(nngd)(nngd)无无关关,这这是是多多数数反反胶团系统的共性胶团系统的共性.第五十五页，共九十二页。3、反胶束萃取、反胶束萃取(cuq)的影响因素的影响因素1)pH valueAOT=二-(2-已基已基)琥珀酸酯磺酸钠。第五十六页，共九十二页。2)盐浓度盐浓度盐浓度W0S&Pro Z选择性第五十七页，共九十二页。3)、盐离子、盐离子(lz)的种类的种类第五十八页，共九十二页。4)蛋白质分子量蛋白质分子量M第五十九页，共九十二页。5)、表面、表面(biomin)活性剂活性剂SA 种类B S第六十页，共九十二页。6)助表面助表面(biomin)活性剂活性剂第六十一页，共九十二页。4、应用、应用(yngyng)1)蛋白质分离蛋白质分离(fnl)第六十二页，共九十二页。2)胞内酶的提取胞内酶的提取(tq)第六十三页，共九十二页。四、超临界流体(lit)萃取Supercritical Fluid Extraction第六十四页，共九十二页。简介(jin ji)：l超临界流体萃取超临界流体萃取(SCF)是是20世纪世纪70年代后期迅速发展起年代后期迅速发展起来来(qli)的一种新兴的萃取分离技术，的一种新兴的萃取分离技术，是利用超临界流是利用超临界流体作为萃取剂，对物质进行溶解和分离的过程。体作为萃取剂，对物质进行溶解和分离的过程。l超临界流体具有气体和液体之间的性质，且对许多超临界流体具有气体和液体之间的性质，且对许多物质均具有很强的溶解能力，分离速率远比液体萃物质均具有很强的溶解能力，分离速率远比液体萃取快，可以实现高效的分离过程。取快，可以实现高效的分离过程。第六十五页，共九十二页。超临界流体超临界流体(lit)的发展的发展l1822年，首次报道年，首次报道l1879年，发现超临界流体年，发现超临界流体(lit)对固体有溶解能力对固体有溶解能力l1970年年从咖啡豆提取咖啡因从咖啡豆提取咖啡因l1992年，首先报道了超临界聚合反应年，首先报道了超临界聚合反应第六十六页，共九十二页。（一）、超临界流体的萃取（一）、超临界流体的萃取(cuq)的原理的原理1.流体的临界特征流体的临界特征l气相、液相、固相三相成平衡态共存气相、液相、固相三相成平衡态共存(gngcn)的点叫的点叫三相点。三相点。液、气两相成平衡状态的点叫临界点液、气两相成平衡状态的点叫临界点。在临。在临界点是所要求的温度和压力分别称为临界温度（界点是所要求的温度和压力分别称为临界温度（Tc）和临界压力（和临界压力（pc）。稳定的纯物质及由其组成的固定组分。稳定的纯物质及由其组成的固定组分混合物具有固有的临界状态点。混合物具有固有的临界状态点。第六十七页，共九十二页。超临界流体(lit)(SCF)第六十八页，共九十二页。2.超临界流体超临界流体(lit)的特征的特征l超临界流体超临界流体(SCF)是处于临界温度和临界压力以上的非凝是处于临界温度和临界压力以上的非凝缩性的高密度流体。缩性的高密度流体。超临界流体没有明显的气超临界流体没有明显的气-液界面，既液界面，既不是气体，也不是液体不是气体，也不是液体(yt)，是一种气，是一种气-液不分的状态，性质液不分的状态，性质介于气体和液体介于气体和液体(yt)之间。流体处于超临界状态时，其密度之间。流体处于超临界状态时，其密度接近液体接近液体(yt)密度，并且随流体压力和温度的变化发生十分密度，并且随流体压力和温度的变化发生十分明显的变化。明显的变化。第六十九页，共九十二页。超临界流体超临界流体(lit)的性质的性质物理物理特征特征密度密度（g/cm3）粘度粘度（g/cm/s）扩散系数扩散系数（cm2/s）气体气体（0.6-2）*10-3（1-4）*10-40.1-0.4)*10-2液体液体0.6-1.6（0.2-3）*10-2（0.2-2)*10-5SCF0.2-0.9（1-9）*10-4（0.2-0.7)*10-3第七十页，共九十二页。超临界流体超临界流体(lit)的主要特性的主要特性l密度类似液体密度类似液体l压力和温度的变化均可改变相变压力和温度的变化均可改变相变l粘度粘度,扩散系数接近于气体扩散系数接近于气体lSCF的介电常数，极化率和分子行为与气液的介电常数，极化率和分子行为与气液两相均有着两相均有着(yuzhe)明显的差别明显的差别第七十一页，共九十二页。l溶质在超临界流体溶质在超临界流体(lit)中的溶解度随超临中的溶解度随超临界流体界流体(lit)密度的增大而增大。密度的增大而增大。2.超临界流体(lit)的特征超临界流体萃取正是利用这种性质，在较高压力下，将溶质超临界流体萃取正是利用这种性质，在较高压力下，将溶质(rngzh)溶解于流体中，然后溶解于流体中，然后降低流体溶液的压力或升高流体溶降低流体溶液的压力或升高流体溶液的温度，使溶解于超临界流体中的溶质因密度下降，液的温度，使溶解于超临界流体中的溶质因密度下降，溶解度降溶解度降低而析出，从而实现特定溶质的萃取。低而析出，从而实现特定溶质的萃取。第七十二页，共九十二页。可作为可作为(zuwi)超临界流体的物质：超临界流体的物质：l二氧化碳、二氧化碳、l一氧化亚氮、一氧化亚氮、l六氟化硫、六氟化硫、l乙烷、乙烷、l庚烷、庚烷、l氨等。氨等。第七十三页，共九十二页。常用的流体常用的流体(lit)介质介质l二氧化碳：二氧化碳：l临界温度临界温度(lnjiwnd)：31.1；临界压力：；临界压力：7.2MPal临界条件容易达到、化学性质不活泼、无色无临界条件容易达到、化学性质不活泼、无色无味无毒、安全性好、价格便宜、纯度高、容易味无毒、安全性好、价格便宜、纯度高、容易获得等优点获得等优点第七十四页，共九十二页。3.超临界流体萃取特点超临界流体萃取特点(tdin)(优点优点)l萃取和分离合二为一萃取和分离合二为一l压力和温度都可以成为调节萃取过程的参数压力和温度都可以成为调节萃取过程的参数l萃取温度低萃取温度低l临界临界CO2流体常态流体常态(chngti)下是气体，无毒下是气体，无毒l超临界流体的极性可以改变超临界流体的极性可以改变第七十五页，共九十二页。4.萃取萃取(cuq)技术的应用举例技术的应用举例l生物活性物质和生物制品的提取生物活性物质和生物制品的提取lCO2萃取技术主要应用萃取技术主要应用(yngyng)于有害成分成分的脱除、于有害成分成分的脱除、有效成分的提取、食品原料的处理等几个方面。例有效成分的提取、食品原料的处理等几个方面。例如：用如：用SFE从咖啡、茶中脱咖啡因；啤酒花萃取；从从咖啡、茶中脱咖啡因；啤酒花萃取；从植物中萃取风味物质；从各种动植物中萃取各种脂植物中萃取风味物质；从各种动植物中萃取各种脂肪酸、提取色素；从奶油和鸡蛋中去除胆固醇等。肪酸、提取色素；从奶油和鸡蛋中去除胆固醇等。第七十六页，共九十二页。例1 脱咖啡因l超临界流体超临界流体(lit)萃取技术得到最早大规模的工业化萃取技术得到最早大规模的工业化应用的是天然咖啡豆的脱咖啡因。应用的是天然咖啡豆的脱咖啡因。用用SF-CO2法从咖啡豆中脱出法从咖啡豆中脱出(tu ch)咖啡因工艺流程咖啡因工艺流程 第七十七页，共九十二页。例例2.啤酒花萃取(cuq)l普通的有机溶剂萃取法制取的啤酒花萃取液为暗绿普通的有机溶剂萃取法制取的啤酒花萃取液为暗绿色膏状（即啤酒花浸膏），含有色膏状（即啤酒花浸膏），含有(hnyu)许多不纯物许多不纯物质，而且还残留有机溶剂。液体质，而且还残留有机溶剂。液体CO2和和SC-CO2抽抽提的酒花萃取物颜色为微榄绿，在提的酒花萃取物颜色为微榄绿，在2025MPa，40萃取萃取4h，浸膏得率可，浸膏得率可14，硬树脂萃取，硬树脂萃取率仅为率仅为5.2%，而且不萃取农药，芳香成分不氧，而且不萃取农药，芳香成分不氧化。化。第七十八页，共九十二页。例例3.其他其他l从工业性应用的萃取分离角度，从工业性应用的萃取分离角度，SC-CO2萃取技术萃取技术在医药、食品、化妆品等工业领域中有较宽的应用面。在医药、食品、化妆品等工业领域中有较宽的应用面。医药工业医药工业l酶、维生素等的精制回收酶、维生素等的精制回收l动植物中药效