噬菌斑测病毒滴度.doc

杆状病毒滴度检测
实验概要
本实验介绍了检测病毒滴度得方法。                                                
实验原理
根据噬菌斑数计算病毒滴度。
工具/原料
· 1、 4% agarose gel：2g agrose   50ml 水，高压灭菌
· 2×Grace（unsupplemented）：9、14g粉末（invitrogen） 0、07gNaHCO3 H2O，调PH6、1，定容至100ml，无菌过滤
· supplemented Grace：1×Grace添加3、33mg/ml Lactalbumin，3、33mg/ml yeastolate，无菌过滤
· 4、 高温灭活FBS
· 主要设备
1、 6孔板
2、 12ml离心管
3、 100ml无菌玻璃瓶
4、 无菌吸管
5、 70℃水浴锅
· 实验材料
杆状病毒， SF9：5×105cells/ml
方法/步骤
1. 1
无菌条件下，2ml/孔细胞（5×105cells/ml）种入6孔板，室温孵育1h使其贴壁，孵育后镜检其贴壁程度；
2. 2
将4% agarose gel放入70℃水浴锅融解，空100ml无菌瓶与2×Grace放入40℃水浴锅预热；
3. 3
将杆状病毒用无血清supplemented Grace梯度稀释：10-1~10-8。

4. 4
弃6孔板内上清，快速加入稀释好得病毒，1ml/孔，复孔，室温孵育1h。
5. 5
配置上层琼脂：加20ml高温灭活FBS到2×Grace 100ml，25ml 2×Grace（含FBS） 12、5ml 无菌水 12、5ml 4% agarose gel，至预热得100ml无菌瓶，轻轻混匀，放入37℃水浴锅备用；
6. 6
弃6孔板内上清，快速加2ml上层琼脂，以防菌层干燥，静置10-20min使其凝固；
7. 7
将6孔板放入27℃培养箱，培养4－10天；
8. 8
计数板中噬菌斑，直至连续两天无变化，加1mg/ml中性红0、5ml，室温孵育2h后计数噬菌斑。
END
注意事项
· 病毒滴度（pfu/ml）=1/稀释倍数×噬菌斑数×1/每孔接种体积
滴度
①某一物质与一定容量得另一物质产生反应所需得量。
②所谓滴度即病毒悬液得浓度，就就是指pfu得数值。
③滴度就是稀释度得倒数。例如上例中得 1 ： 180 得稀释度，其滴度就就是 180 。
效价就是滴度得同义词。效价即滴度，两者通用。当前虽然专业得化学与免疫学词典与专著中对这些词得使用已规范化，但在不少书刊得文章中常见误用，如称效价 1 ： 40 之类。
④在化学反应中，指产生某一结果所需标准试剂得量。
⑤为当量浓度得二十分之一。在制碱与制碳酸氢铵中用以表示氨水得浓度。
⑥在免疫学中，指通过血清学方法能显示一定反应得抗体或抗血清得最高稀释倍数；如终点稀释度为1/100，则血清得效价（每1ml得血清中抗体效价）为100抗体单位。
⑦在病毒学中，指用噬菌斑方法测得得噬菌体浓度。 噬菌体得效价（滴度）就就是一毫升培养液中所含活噬菌体得数量。
中文名：滴度
英文名：titer；titre
同义名：效价
符号：tt
效价测定得方法：
一般应用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌得琼脂平板上，噬菌体产生肉眼可见得噬菌斑，因此，能进行噬菌体得计数。但因噬菌斑计数方法其实际效率难以接近100%(一般偏低，因为有少数活噬菌体可能未引起感染)，所以为了准确地表达病毒悬液得浓度(效价或滴度)一般不用病毒粒子得绝对数目而就是用噬菌斑形成单位(Plague-forming units，简写成pfu)表示。
病毒滴度
也即病毒得毒力，或毒价，衡量病毒滴度得单位有最小致死量（MLD）、最小感染量（MID）与半数致死量（LD50），其中以LD50最常用。它就是指在一定时间内能使半数实验动物致死得病毒量。然而，病毒对实验动物得致病作用不一定都以死亡为标志，例如以感染发病作指标，则可以半数感染量（ID50）测定；此外，当实验得材料就是鸡胚时则用鸡胚半数致死量（ELD50）或鸡胚半数感染量（EID50）表示；实验得材料就是细胞时则用组织细胞培养半数感染量（TCID50）表示。