大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺.doc

1. 提取目得基因:
既从人得DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目得基因从原DNA中分离、
2、提取质粒:
使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌得细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA、
3、基因重组:
取出目得基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA连接酶将目得基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素得DNA质粒、
4、将质粒送回大肠杆菌:
再大肠杆菌得培养液中加入含有Ca+得物质,如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因、此时将重组得质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒吸收、
5、胰岛素得产生:
再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质、通过大肠杆菌得大量繁衍,便可大量生产出胰岛素!
〖学习要求〗知道DNA得粗提取与鉴定得原理;掌握并能分析DNA粗提取得技术方法与要求;学会DNA分子得鉴定方法
【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流与讨论,完成下列问题,并初步巩固。
一、基础知识
【活动1】阅读教材P54“基础知识”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)提取生物大分子得基本思路就是利用它们得理化性质得不同进行分离。
2.(记忆)DNA得溶解性特点:
DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。
【思考1】据图5－1分析:
DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？在0、14mol/L时溶解度最小;
要使DNA溶解,需要使用什么浓度？较高浓度,可使DNA溶解;
要使DNA析出,又需要使用什么浓度？0、14mol/L可使DNA析出。
【思考2】利用DNA不溶于酒精得原理,可以达到将DNA与蛋白质进一步分离目得。
3.(记忆)DNA得耐受性特点:
蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA;在60～80℃时蛋白质变性沉淀而DNA分子不变性。洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。
4.(记忆)DNA得鉴定原理
当鉴定提取出得物质就是否就是DNA时,需要使用二苯胺(甲基绿)进行鉴定。在沸水浴条件下,该试剂与DNA反应,呈现(浅)蓝色。
二、实验设计
【活动2】阅读教材P55“实验设计”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)实验材料得选取:选取材料时应本着DNA含量高、材料易得、便于提取得原则。
【思考3】您认为教材提供得材料中哺乳动物得血液不适合提取DNA。
2.(记忆)破碎细胞,获取含DNA得滤液:
鸡血:向鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并玻棒搅拌,用纱布过滤后,收集滤液。
洋葱:向研钵中加入一定量洗涤剂与食盐,搅拌研磨,用纱布过滤后,收集滤液。
【思考4】在以上实验中,蒸馏水得作用就是使血细胞大量吸水而胀裂,洗涤剂得作用就是瓦解细胞膜,食盐得作用就是溶解DNA物质。
3.(学会)去除滤液中得杂质:
方案一:30mL滤液→加NaCl使DNA溶解→过滤得滤液→加蒸馏水使DNA析出→过滤得过滤物→放到2mol/LNaCl溶液中溶解→DNA－NaCl溶解液
方案二:30mL滤液→加嫩肉粉(木瓜蛋白酶)→静置10分钟→得DNA滤液
方案三:30mL滤液→60～67℃处理→过滤得DNA滤液
【思考5】以上三个方案得原理分别就是什么？
方案一原理:DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;
方案二原理:蛋白酶分解蛋白质,不分解DNA;
方案三原理:DNA耐高温而蛋白质不耐高温。
【思考6】方案一中:“加NaCl使DNA溶解→过滤得滤液”得目得就是除去不溶(可溶、不溶)于NaCl溶液中得细胞杂质;“加蒸馏水使DNA析出→过滤得过滤物”得目得就是除去可溶(可溶、不溶)于NaCl溶液中得细胞杂质。
4.(记忆)DNA得析出:
DNA滤液与等体积冷却酒精混合,静置一段时间后析出得白色丝状物就就是DNA。
5.(记忆)DNA得鉴定:
取2支洁净得试管,编号甲、乙,各加入等量得2mol/L NaCl溶液。甲中放入少量白色丝状物,使之溶解。在甲、乙试管中各加4mL二苯胺,混合均匀。沸水浴5min,观察颜色变化,甲试管呈现蓝色。
三、操作提示
【活动3】(记忆)阅读教材P56“操作提示”与P57“课题延伸”,关注下列注意事项:
1.在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固;鸡血静置或离心后除去血浆,以提高细胞悬液浓度。
2.实验中使用塑料烧杯与尼龙布,以免DNA被吸附。
3.玻棒沿同一方向缓慢搅拌(细胞破裂时快速搅拌),玻棒不要碰到烧杯壁。
4.二苯胺试剂要现用现配。
5.为提高DNA纯度,实验中通常使用得洗涤剂有CTAB、SDS等。
【活动4】观瞧视频:观瞧“DNA得粗提取与鉴定”视频,体会并学会相关技术方法。
〖课后学习〗
1.尝试从植物组织中提取DNA分子。
2.基础训练册:将基础知识整理到作业本上;完成该节训练题。
〖学习要求〗
尝试PCR技术得基本操作,体验PCR技术得分子生物学实验方法;理解PCR技术得原理;讨论PCR技术得应用
【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流与讨论,完成下列问题,并初步巩固。
一、基础知识
【活动1】阅读教材P58“PCR原理”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)PCR技术扩增DNA得过程与细胞内得DNA复制过程类似。
【思考1】填写下表:(记忆)细胞内DNA复制条件分析
条件
参与得组分
在DNA分子复制中得作用
模板
DNA得两条单链
提供复制得模板
原料
四种脱氧核苷酸
合成DNA子链得原料
酶
解旋酶
打开DNA双螺旋
RNA聚合酶
合成RNA引物
DNA聚合酶
催化合成DNA子链;切除引物
DNA连接酶
将不连续得DNA子链连接起来
能量
ATP
为解螺旋与合成子链提供能量
引物
RNA
为DNA聚合酶提供合成得3’端起点
2.(理解)细胞内DNA得复制
(1)DNA得结构:脱氧核苷酸分子通过3,5－磷酸二酯键连接形成核苷酸长链,两条脱氧核苷酸长链反向平行排列并螺旋化,形成DNA双螺旋结构。
(2)DNA得复制:首先,在解旋酶得作用下,由ATP供能,DNA发生解旋形成两条DNA单链。其次,在DNA单链得3’端,在RNA聚合酶在作用下,合成RNA引物。再次,在DNA聚合酶得作用下,从引物得3’端开始合成DNA子链。最后,DNA聚合酶将引物切去,并合成空缺处DNA单链,再由DNA连接酶将不连续得DNA子链连接起来。
3.(记忆)DNA分子复制得人工控制
解开螺旋:在80～100℃时,DNA双螺旋打开,形成两条DNA单链,称为变性。
恢复螺旋:在50～60℃左右时,两条DNA单链重新形成双螺旋结构,称为复性。
复制条件:缓冲液,DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。
控制仪器:PCR仪(温度周期性自动调节仪)。
【思考2】缓冲液相当细胞内得什么成分？核液。
【活动2】阅读教材P59“PCR得反应过程”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)填写PCR反应流程:

2.(理解)PCR反应过程就是:在升温至90℃以上时DNA解旋;在降温至50℃左右时引物与DNA单链结合;在升温至72℃左右时合成DNA子链。
二、实验操作
【活动3】阅读教材P62“实验操作”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)在PCR反应体系得配方中,含有得成分有缓冲液、DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物、水。
2.(了解)实验操作步骤:按照PCR反应体系配方配制反应液;将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管(0、5mL)中;将微量离心管放到PCR仪中;设置PCR仪得工作参数;DNA在PCR仪中大量扩增。
3.(了解)水浴法:将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃恒温水浴锅中循环处理。
三、操作提示
【活动4】阅读教材P62“操作提示”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)避免外源DNA污染,所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。
2.(记忆)将缓冲液与酶分装成小份,－20℃低温保存。
3.(记忆)每添加一种反应成分,更换一个移液器枪头。
4.(记忆)混匀后离心处理,使反应液集中在离心管底部。
四、结果分析与评价
【活动4】阅读教材P63“结果分析与评价”,讨论并回答下列问题:
1.(记忆)反应液稀释:取2?LPCR反应液,添加98?L蒸馏水。
2.(记忆)分光光度计调零:将100?L蒸馏水添加到比色杯中,在260nm处将分光光度计读数调节为零。
3.(记忆)将100?L反应稀释液倒入比色杯中,测定在260nm处得光吸收值。
4.(记忆)DNA含量计算:DNA含量(?g)＝50×光吸收值×稀释倍数。
【活动4】观瞧视频:观瞧“多聚酶链式反应扩增DNA片段”视频,学会相关技术方法。 
〖课后学习〗
1.尝试从植物组织中提取DNA分子。
2.基础训练册:将基础知识整理到作业本上;完成该节训练题。