RD细胞复苏、传代、冻存.doc

RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞培养操作
1〕复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，参加 4mL 培养基混合均匀。在1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液参加培养瓶中培养过夜〔或将细胞悬液参加 10cm 皿中，参加约 8ml 培养基，培养过夜〕。第二天换液并检查细胞密度。
2〕细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。
     1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。
     2. 加 1ml 消化液〔0.25%Trypsin-0.53mM EDTA〕于培养瓶中，置于 37℃培 养箱中消化 1-2 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，假设细胞大局部变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
     3. 按 6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM 条件下离心 4 min，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。
     4. 将细胞悬液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。
3〕细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类；
1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后参加 1ml 胰酶，细胞变圆 脱 落后，参加 1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量参加血清和 DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为 10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液，注意冻存管做好标识。
     3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，2h以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
内容总结

〔1〕RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞培养操作
1〕复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，参加 4mL 培养基混合均匀
〔2〕2〕细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养
〔3〕3〕细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存
〔4〕3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，2h以后转入液氮灌储存
〔5〕记录冻存管位置以便下次拿取

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