免疫胶体金标记手册.doc

浙江大学电子显微镜室 浙江大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班技术资料胡东维 洪 健 徐 颖浙江大学01年10月一、胶体金得制备根据不同得制备方法,可以制备出直径100nm得胶体金粒子,但做为免疫标记探针，其直径应在n范围内。在氯化金(HAuCl4)水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量得还原剂，可以控制所产生得粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂与还原核得数量。还原剂浓度越高,核浓度也越高，氯化金得还原也就从更多得还原中心开始,因此产生得胶体金粒子数量越多,但体积也越小.粒子直径每增加一倍,数量减少为原来得1/8以柠檬酸钠与单宁酸做还原剂,能够制备大小相对一致、直径16nm得胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备得胶体金粒子直径范围较窄,而且残留得多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子得结合。此时在溶液中添加、10、2%得H2O能够去除这些残基。双标记或制备51 nm得胶体金时建议使用该方法。利用柠檬酸为还原剂，可以制备12150 nm直径得胶体金但制备大体积得胶体金时,胶体金粒子得误差也同时增加。因此做单标记时,建议使用该方法制备26 m直径得胶体金。除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备5 m得胶体金,它避免了单宁酸残基得问题,但所形成得金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒,制备得残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存(0、5g或g）,因此在配制氯化金溶液时一次配完,暂时不用得可以用1、 ml试管分装为1ml保存（-2).注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理(1%双氯硅烷/氯仿浸泡1小时，烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水,随后再用、2mm微孔滤膜过滤后使用.三角瓶可反复多次使用,不用时应密封保存，以防污染。制备好得胶体金保存寿命较长,可4保存6个月以上或室温下保存2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用.但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。1、单宁酸/柠檬酸钠法制备316 nm胶体金(1) 取一250ml三角瓶,加入79 l双蒸水与1 l 1氯化金,预热至6070。(2) 取一50 ml烧杯,加入4 ml %柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入不同用量得单宁酸及等量得5 M K2CO3。预热至070.2C3得作用就是保持溶液得中性pH。因此如果单宁酸得量少于0、5 m时,对pH得影响不大，KCO3可以省略。(3) 将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温10分钟.自然冷却。柠檬酸钠（ml）单宁酸(ml)胶体金（nm）000340045006412084701041162、白磷还原法制备5nm胶体金(1) 取50 ml三角瓶一个,加7ml双蒸水,1ml1%氯化金,并用0、25M KCO3将溶液调至中性(pH7、0）。(2) 取0、2m饱与磷/乙醚溶液加到1、5 ml试管中,再加0、8 ml乙醚,混匀取0、 ml加入溶液(1）中（磷有毒且易燃,操作请带手套，多余得磷溶液用CuSO进行中与）。(3) 室温下轻轻摇匀15 mi，然后加热沸腾并保持5 mi,自然冷却。3、柠檬酸三钠法制备1230 n胶体金（ren, 7)(1) 取20ml三角瓶一个,加100m双蒸水及1l1%氯化金，加热沸腾;柠檬酸钠(ml)胶体金(nm)5124163242、830(2) 取不同量得1%柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀，再保持沸腾30 m,溶液颜色首先变黑,再逐渐变红,粒子体积较小时，溶液呈桔红色,而粒子体积较大时,则颜色偏向紫色。注 意:(1) 由于使用试剂质量及其它方面可能存在得误差,以及制备过程中得其它问题,胶体金粒子得大小及一致性与理论值可能有偏差,因此,在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太大，粒子凝聚,粒子边缘不清晰等问题,须重新制备.(2) 胶体金溶液最好保存在4冰箱中；也可保存在室温下,一般可保存1-个月。但决不可保存在以下，否则金粒子发生凝聚。二、蛋白金复合体得制备一般认为胶体金粒子表面为一层ACl,因此,粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒子之间相互排斥,形成稳定悬浮得胶体金溶液.金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白)来稳定与保护这些粒子,以免受外来电解质得影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白得吸附作用取决于H值,这就是因蛋白得净电荷取决于溶液得p值，在H=I时为中性。由于在H=pI时蛋白溶解度最小,因此这时它水化程度最小,最溶液吸附到疏水得金粒子表面。但在实际得胶体金探针制备中,一般胶体金调整为pH=P+0、,这样蛋白带正电,有利于结合更稳定.胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理，其目得在于(）去除高浓度得盐分,高浓度得盐分往往干扰蛋白与胶体金得吸附结合，或导致胶体金粒子得凝聚，这一步往往采用低浓度缓冲液中进行。（)使蛋白分子尽量分散为单体,冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子,可同时与多个胶体金粒子结合,影响标记得灵敏度与定量分析。（3)使蛋白具有适当得分子量。蛋白分子量过小(30 k),形成得蛋白复合体往往就是不稳定,可短时间内失活。而分子量过大时，被认为影响探针得灵敏度,特别就是已知蛋白得结构与活性中心得情况下，去除对活性武影响得结构部分就是提高标记灵敏度,延长探针寿命(防止凝集）得有效办法。把分子量过小得蛋白与其它蛋白(如BA,牛血清蛋白等）结合后,能制备出稳定性更佳得探针。当蛋白前处理完成后,接着要确定胶体金与蛋白结合得最佳pH值。对于理化性质不确定得蛋白这一步尤为重要。过量得蛋白与不同pH值得胶体金结合后,只有某一特定pH值能够形成结合最稳定得探针.在高浓度电解质(如NCl）作用下不会凝聚。不同蛋白得适宜pH范围得宽窄大不相同.一般选择最小适宜pH值为最佳pH值。但有些探针得实际情况并不完全如此,最稳定发探针并不完全代表活性最好这要靠实验验证。在确定最佳pH值后，最后要确定最小蛋白量，即能够形成稳定探针得蛋白得最小量。如果在制备探针时加入太多得蛋白，不仅造成浪费,而且更为严重得就是容易造成探针凝聚,并严重影响标记活性。因为探针溶液中得游离蛋白容易抢先与标记位点结合,起到“封闭”(Bcking）作用，而胶体金探针标记不上.在标记位点希少、被标记物含量较少得情况下要特别注意。这里需要特别指出得就是，使用不同直径得胶体金与同一蛋白结合时，除了蛋白量完全不同外，往往最佳pH也有一定变化。因此,在探针制备每一环节应随时监测探针对分布情况、负染结合及活性。1、抗血清得前处理一般抗血清中IgG得含量为1-，而绝大部分为其它蛋白。用抗血清直接制备探针其标记活性与特异性均不理想。因此需去除其中多数杂蛋白。但处理环节不宜太繁，在实验室设备与经验缺乏得情况下更就是如此,否则会导致Ig活性得大幅降低。如果您得实验室在蛋白纯化方面有很强得技术支持,高度纯化后效果会更好。大量工作表明,只用硫酸铵沉淀就可以得到足够纯度及高活性得IgG蛋白。其基本步骤如下:(1) 取抗血清0、 m;(2) 加生理盐水(0、85 NaCl）、3 ，混匀；(3) 逐滴加入饱与 （NH4)O4 0、5 ml,充分振荡混匀,静置 h;(4) 1000rpm/min离心0min,弃上清；(5) 加、5 m生理盐水重悬浮,混匀；(6) 逐滴加、5 ml饱与 ()24,充分振荡混匀,4静置1 h;(7) 10000 rm/min离心20 min,弃上清;(8) 重复5步骤一次;(9) 加生理盐水、5ml重悬浮,混匀;(10) 生理盐水中透析1224 h；(11) 在0、 MH 9、硼酸缓冲液透析224 ;(12) 分装,即将使用时4保存,备用0保存。为最大限度保持抗体活性,整个过程应在4下进行。对于冻干抗血清或长时间保存得血清，将生理盐水透析改为3 KCS透析，促使聚合得多聚体解聚。如果抗血清效价较低时,不宜准备胶体金探针。2、亲与纯化抗体得处理亲与纯化抗体多就是一些商品化得通用抗体,即二抗。一般为羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人得抗体.这些抗体一般有两个问题,一就是I分子往往聚集为多聚体分子,二就是往往含有较多得盐分。因此前处理得目得在于脱盐与解聚。其基本步骤如下:(1) 将亲与纯化抗体用生理盐水稀释为0、5-1 mg/m浓度(2) 在 M KCS(硫氰酸钾）溶液中透析12h(3) 在2 mMol pH 9、得硼酸缓冲液中透析2 h（更换透析液数次）(4) 分装备用其它蛋白可参考此方法进行。但注意后一种透析液得p值应与交联时p值一致。在实际运用中,一般省略去3 KCN透析这一步,特别就是当蛋白分子量较小,且为非糖蛋白时。我们建议在制备通用探针（如二抗G，Prtei A,Potein G，treptaidin)等时，严格使用该方法,而制备直接标记探针时,也可以忽略处理步骤。3、Ig Fab片段得制备一般来说体积较小得探针具有相对较高得标记活性。主要原因在于胶体金颗粒较小时有利于在标记溶液中得扩散运动；在胶体金直径一定时，蛋白分子量越小,金表面吸附得蛋白分子越多，活性位点也越密集,也容易于靶位点结合.Ig分子量为50 kD左右,由4个亚基组成,即两条重链（）与两条轻链(L）用水解酶(木瓜蛋白酶)水解后可得到两种片段,即Fab与Fc其中Fab就是具有抗原识别活性得部分，回收后制备探针。c能够与Potein 与Proten G特异性结合。但这种分离只能在有条件得实验室进行。其基本过程如下：(1) 用PBS（pH7、,含10 mMEDA,20 盐酸半胱氨酸)溶解纯化得IgG(2) 加固化木瓜蛋白酶(3) 37处理5h(4) 离心,去除固化木瓜蛋白酶（沉淀)(5) 过rein 柱(6) 纯化得Fab片段按前文方法做进一步处理注:Fa与胶体金结合得pH值为、54、蛋白与胶体金结合最佳pH测定(例纤维素酶,pI未知）(1) 取若干个1、5m试管,分别加入1 m 10nm胶体金;(2) 用25 M KCO3将pH分别调为3，4,5，6,7，8，9,1;(3) 取一孔培养板,按p从低到高分别将上述胶体金分别取10 ml加入孔中,重复三次；(4) 每孔分别加入 ml浓度为1 g/ml得纤维素酶,混合,室温下放置115mn；(5) 每孔分别加入20 ml浓度为 NaCl溶液,混合，室温下放置10 min;(6) 观察胶体金颜色变化，记录保持红色得最低pH（X);(7) 重复(1)-（)步，pH梯度为X0、；X0、3；X;+0、3;X+、6;+1。(8) 观察胶体金颜色变化直到室温下放置2小时,记录仍保持红色得最低H。注意：.如胶体金粒子直径较小(36nm),加al需放置较长时间（几个甚至十几个小时）后才能观察到颜色变化.必要时可放大反应体积（1 ml胶体金)，并借助离心来判断.2.有些蛋白最佳H范围较窄,设置得梯度不能太大。、最小蛋白浓度得确定(1) 用、2 mm微孔滤膜过滤或高速离心去除蛋白中残物或多聚体;(2) 取一6孔滴定板，每个重复为若干个孔,分别加入最佳pH得胶体金100ml,重复3次；(3) 各孔依次加入不同量得蛋白（一般浓度为0、00、1g/m)20 ml,混匀，室温下放置min；(4) 加入 ml 1% Nal,室温下放置1min；(5) 颜色仍保持红色得最小蛋白用量即最小蛋白浓度。(6) 为确保结果准确性,可放大反应体积重复以上步骤。注:在实际探针制备工作中,蛋白浓度往往为最小浓度得130.6、IgGgold得制备(1) 取两个1、5 ml试管,分别加入1、2 ml 0 nm胶体金;(2) 加入适量25 mM 2CO3把pH调整为9、；(3) 分别加入10 ml浓度为 mg/l gG，混匀，室温放置10mi;(4) 分别加入12 ml 2% G2000,室温放置5mn;(5) 100 rpm离心20 min,轻轻吸除上清；(6) 用20 m B溶液重悬浮松散得胶体金沉淀，并集中到新管中；(7) 分别加20 ml 甘油,充分混匀;(8) -20保存备用。注意:1)、不同直径胶体金所需要得蛋白量差别很大;2）、不同直径胶体金所需离心速度完全不同。以绝大部分探针形成松散沉淀为原则离心力太大,会产生不可逆得探针凝聚；离心力太小,探针无法沉下。最好能够直接用胶体金在不同转速下离心以确定适当得离心力。3）、在冷离心机中可适当延长离心时间,同时适当减小离心力,探针活性较好。4）、Ig得最佳交联p有多种报导，从7、4-、0。一般认为，7、4时胶体金结合得蛋白最多，9、时制备得探针最稳定.三、样品得固定、包埋与标记。固定为了减少对标记底物结构得破坏,细胞化学样品固定得时间相对较短，多为13小时。环境温度一般在C以下。低温固定剂一般采用2甲醛与1%戊二醛。甲醛分子量小、渗透快,对蛋白质结构影响小,可较好地保存其抗原活性。但对细胞整体得细微结构保存欠佳戊二醛对细胞得细微结构保存较好，但往往导致蛋白失去抗原活性.因此，在标记低物不就是蛋白质或多肽时（如纤维素、多酚类化合物、b,3葡聚糖、几丁质等),可用常规方法进行戊二醛与1%锇酸得双固定。2。包埋根据标记低物得不同,可以选择常规(常温)包埋剂或低温包埋剂包埋样品。如果标记物为蛋白质,特别就是性质不稳定或不清楚时，建议使用低温包埋剂包埋,以最大程度保存抗原活性。大量实验表明,4M就是目前使用最为普遍得低温包埋剂。当选择常温包埋剂时，建议使用Spurr包埋剂。Spurr包埋剂粘性小，易渗透,易操作;包埋块不吸潮,保存时间长.3。标记根据标记程序得不同,标记分直接与间接标记。直接标记指胶体金探针直接与被标记底物结合;而间接标记指胶体金探针通过一或多个中间标记物后与底物结合。直接标记 间接标记直接标记需要制备胶体金探针,其好处就是标记特异性好,背景小,能够做阴性对照。间接标记无需制备胶体金探针,可以直接购买通用二抗探针,缺点就是标记特异性较难把握，背景较高，不能够做阴性对照。在做病毒粒子标记时,直接标记法可用抗体直接富集低浓度或稀有病毒而不会增加任何背景.影响标记得因素主要包括以下方面：（1)pHH变化会对探针蛋白得结构与活性中心产生影响,继而影响到标记强度与特异性.在很多情况下探针作用得最佳pH值往往与该蛋白作用得最佳H值有一定差别。例如有一种来自真菌得纤维素酶本来在p4、8时活性最强,但结合到胶体金上后,pH在6、0左右时最强，当pH到7、2时仍有较强得标记活性。（2）离子环境有些蛋白只有在一定离子环境中才有生物活性,其中很多涉及a2,Mg2+,n2,C2等阳离子.有时溶液中Ca+、Cu2+等容易形成不溶性沉淀而导致标记失败;因此,在配制标记溶液时要注意各种阴阳离子得配伍,添加顺序及溶液p.(3）温度标记温度对标记活性及特异性影响最大,也最容易出问题.以水解酶类做成得胶体金探针对温度变化也更为敏感，不同温度、不同时间标记出得切片其视觉效果完全不一样。在此特别指出一点,在用内切得水解酶探针时,切忌温度过低，时间过长，否则会出现标记得扩散现象。建议在可能时尽量使用外切酶探针。在使用gG或rotein A，PrteiG探针时,有人认为在4下长时间标记特异性最好。但我们研究发现事实并非如此,在25以上得室温下标记060 min其特异性更好.一般来说,如果用来自植物或微生物得蛋白做探针,标记温度最好在25左右;用来自动物得蛋白做探针时，标记温度最好在30左右。（4)封闭液组成封闭液对封闭有关非特异性活性基团，特别就是醛基至关重要。在多数情况下封闭液与探针重悬浮液、标记溶液就是一样得。目前最常用得封闭液组分有BSA、卵清蛋白、脱脂奶粉、PEG2000等.在用IgG、rotinA、Prtein G等标记时,应优先选用BS(组分五）；在植物凝集素类探针标记时，应优先选用EG2000。也有人发现IgG探针标记时脱脂奶粉最佳.如果就是用交联蛋白做成得探针,那么封闭液中最好有载体蛋白得成分。4。样品得低温包埋得基本程序(1) 将新鲜样品切成13m3得小块,立即放入3甲醛与1戊二醛得磷酸缓冲液（0mM，p 7、)中下固定2 ;(2) 在4C依次用%、50乙醇溶液脱水，每步30mi；(3) 在20冰箱中依次用5%、7%、9%、10、10%、0乙醇溶液脱水,每步0 min；(注意乙醇溶液首先在冰箱中预冷!)(4) 在-2冰箱中依次用30%、70、00得KM渗透,每步120min;注意不断轻轻摇动样品使渗透完全。(5) 在4C KM树酯包埋。注意包埋剂应尽量装满,否则气泡中得氧气会抑制包埋剂得聚合。(6) 在-0C冰箱中长紫外线照射聚合2 h.室温下聚合4h。注意每天翻动次样品使紫外光照射均匀。(7) 聚合后得样品应及时切片，长时间放置会导致样品与包埋剂之间分离而无法切片。(8) 超薄切片应收集在镍网、金网或铍网上做胶体金标记.与其它标记用包埋剂相比,KM可在5C低温下仍保持较低得黏度;4有极性，亲水,易脱水,易标记;聚合后交联度高,易切片。K4得配方根据材料得性质确定。植物或坚硬得材料包埋剂得硬度要高；动物或幼嫩材料包埋剂得硬度要低。具体参见包埋剂说明.注意:(1) K4M有毒,须带PVC或PVD手套谨慎操作。溅入眼睛或皮肤时请立刻用清水冲洗。(2) 所有脱水乙醇须提前预冷(3) 脱水过程中防止样品结霜吸潮.5。样品常温包埋（常规)得基本程序（1） 将新鲜样品切成13mm3得小块，立即放入4%戊二醛得磷酸缓冲液(10mM, pH 7、)中4C下固定612 h;（2） 样品用磷酸缓冲液冲洗3次每次 min；然后在%锇酸溶液中固定 h；冲洗3次，每次5分钟。(通风橱中戴手套进行，含锇酸废液倒入食用油中!）（3） 在4或室温下依次用30%、50%、70%、90%、100%、0、100%乙醇溶液脱水,每步5 mn;（4） 依次用30、70、100%得Surr包埋剂渗透,每步120mi;然后在100得Sprr包埋剂中过夜。（5） Spurr包埋剂包埋。可包埋在0、5 ml得离心管中，每管加0、3 ml包埋剂即可。加入纸标签。（6） 在70温箱中聚合116 。（7） 聚合后得样品可长时间保存。超薄切片应收集在镍网、金网或铍网上做胶体金标记。6。胶体金直接标记基本程序(1) 在培养皿中铺上石蜡膜（arail);四周加吸水纸与水以保湿；(2) 加一滴dd 2O，镍网切片向下漂浮min;(3) 另滴0 m封闭液（BL),将镍网切片向下漂浮3 mi;(4) 另滴50 m封闭液（L）,加入2 ml胶体金探针，充分混匀;将镍网切片向下漂浮30 in;(5) 标记后镍网得在ddH2上漂洗除去未标记得胶体金探针,共漂洗3次,每次510 min;晾干;(6) 常规染色,观察。7。胶体金间接标记基本程序(1) 镍网切片向下在dd H2O上漂浮2min;(2) 在封闭液(BL)上漂浮30mn;(3) 把一抗用L稀释10000倍，将镍网切片向下漂浮00 i；(4) dd HO漂洗两次各5mn,除去多余一抗;(5) 在封闭液（BL）上漂浮3 n;(6) 用胶体金探针标记0 n;(7) H2O上漂洗除去未标记得胶体金探针,共漂洗3次,每次510 in；晾干;(8) 常规染色,观察。8。利用胶体金间接标记法进行双标记得基本程序(1) 镍网切片向下在dd H2O上漂浮 in;(2) 在封闭液(L）上漂浮30 in；(3) 把一抗用稀释10-00倍,将镍网切片向下漂浮30min;(4) ddH2O漂洗两次各5 mn，除去多余一抗A；(5) 在封闭液（BL）上漂浮30mn;(6) 用小颗粒胶体金探针标记30 n;(7) dd H2O漂洗两次各5 in，除去多余胶体金探针;(8) 重复步骤()-()，其中抗体与探针改用一抗与大颗粒胶体金探针B；(9) dd HO上漂洗除去未标记得胶体金探针,共漂洗3次,每次510mi;晾干;(10) 常规染色，观察。9。利用胶体金直接标记法进行双标记得基本程序如果两种探针得重悬浮液相同(如同为I-gld)，可直接混合,按上述5得方法进行.单混合时大颗粒胶体金得量要适当增加。如果两种探针得重悬浮液差别较大，可分别进行直接标记。步骤如下:(1) 镍网切片向下在dd H2O上漂浮 n;(2) 在封闭液1上漂浮3 min；(3) 用胶体金探针标记30 mn;(4) dd 2上漂洗除去未标记得胶体金探针，共漂洗次,每次5-10min;(5) 在封闭液上漂浮3n；(6) 用胶体金探针标记30 mn;(7) d H2上漂洗除去未标记得胶体金探针,共漂洗3次,每次0 in;晾干；(8) 常规染色,观察。10直接法标记粗提纯病毒(1) 取新覆膜镍网,在用BL稀释500倍得病毒抗血清上漂浮 mi;(2) 在病毒溶液上吸附10 min;(3) 封闭30n;(4) 一抗胶体金探针标记30-120 mi；(5) 水洗次,每次510min;(6) %醋酸双氧铀负染.注意:(1) 如果使用间接标记方法,不能采用或只能采用高度稀释得抗体吸附病毒.否则，高强度得标记背景影响正确判断。(2) 该方法允许多探针直接混合一步法同时标记多种病毒.特别适应于对未知病毒得检测.胶体金标记技术路线得选择1。包埋剂根据抗原或标记底物性质决定包埋剂种类。蛋白类,推荐使用K4M;包埋后立即切片标记。外泌蛋白可选择s。可长期保存使用。细胞结构组分，如纤维素、b1,3葡聚糖、几丁质、多酚化合物等,可选择sprr.胶体金体积精细定位如病毒、细胞器定位等选用5 nm胶体金.细胞壁组分采用520 nm胶体金。多标记时，胶体金直径推荐选用6 、10 n、15 n；稳定抗原采用较大颗粒胶体金。一般蛋白标记采用1nm。3。通用探针选择ggod:-20可保存1年;但定位时胶体金距离标记位点较远，不适于精细定位。Proen A/G：-20可保存3个月;但定位时胶体金距离标记位点较近，适于精细定位与多标记。oteinA与Proten G与不同抗体之间得亲与性抗体来源g类型与roin A得亲与性与Potei G得亲与性人gG(正常)+IgG1+Ig2+IgG3+Ig4+小鼠(mouse）IgG1+Ig2+IgGb+IgG3+大鼠(rat）IgG1-+IgG2a-+gG2+IgG2c+山羊(goat）G+绵羊（sep）IgG-/+家兔IgG+狗gG+猪G+鸡I-+马Ig+豚鼠(gieapi）IgG+仓鼠(hmster）Ig+猫g+小牛Ig+胶体金制备与标记中常见得缓冲液配方1。醋酸盐缓冲液(2mM)pH200mM aAc（ml)20 mM HAc(ml）pH200 mM ac(ml）200mM HA（ml)、60、59、254、85、9、13、81、08、85、7、03、0、01、88、25、7、92、14、2、67、4、6、44、4、35、69、10、4、64、95、15、89、40、620 M NaAc溶液得配制：NacHO定容于100毫升。2。磷酸盐缓冲液(S,200）p20mM Na2HPO (ml)200M aH2PO4 （）p20mNa2HP4 (m)200mMaH24 （ml）5、88、0927、0196、0、387、77、222、218、58、57、4816、426、57、871、637、52、891、58、5、4918、94、75、31 Na2HO4溶液得配制：18、5克Na2HP422O或358、22克212HO定容于10毫升。1M NH24溶液得配制:18克Na2PO4acH2O或56克NaPO4H2定容于10毫升。riHC缓冲液(50M)pH2C 7C200mM Trs(ml)10mMHCl（ml）pH23C 37C20M Ti(ml)10M Hl(ml）9、10 8、9525、08、0、0257、8、92 8、7825、5、6 7、82530、08、 、6210、7、87 7、72、58、62 8、82512、5、77、62535、08、0 8、725、0、6 7、5537、58、40 8、2717、57、5 7、02540、08、2 、18220、0、36 7、2225、58、2 8、0252、57、 、0525458、1 8、002525、5m rs溶液得配制:36、3克Tris定容于100毫升。4。硼酸盐缓冲液(20 m)pH50mM aB4O7(m)200mM H3BO3 （l）p5M N2BO7(ml）200m H3BO3 (ml)7、41、098、23、6、57、61、58、8、44、57、8288、7648、0379、02200 m H3B3溶液得配制:12、37克H3O3定容于000毫升.50m N2B47溶液得配制：19、07克Na2473H2O定容于1000毫升。5。碳酸盐缓冲液(10 mM）pH2C37C10 MN2O3(ml) mMNHCO3 (l)C 3C100 CO3（ml)100 M NaHCO3 (m）9、6 8、710、4 9、9964、40 9、121、28 10、0879、51 9、40310、 10、2829、79、50461、 1、57919、9 9、255100 mM a2C3溶液得配制:28、2克Na2CO3定容于1000毫升0M NaCO3溶液得配制:、克NaHCO定容于000毫升。本缓冲液临用前配制,不能长时间保存。实验系统中有a2+、Mg2时不能使用。图1、 IgG得基本结构H,重链;L,轻链;HC,重链保守区;HV,重链变异区;LC,轻链保守区;LV轻链变异区。箭头为木瓜蛋白酶与胃蛋白酶得酶切位点。Fab、Fc分别为木瓜蛋白酶水解后得两种片段。Protein A与Protein G可识别Fc部分。主要参考文献1. eesleJEed、 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