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制药工艺复习整理第一章 绪论GLP（Good Laboratory Practice） 药物非临床研究质量管理规范GCP (Good Clinical Practice) 药物临床试验质量管理规范GMP（Good Manufacturing Practice ）药物生产质量管理规范1. 研究对象药物生产过程共性规律及应用，包括制备原理+工艺路线+质量控制2. 主要内容a) 实验室(小试)工艺工艺路线设计与选择，反应与产物合成的动力学及其影响因素，质控标准与方法学b）中试放大工艺工艺参数的影响因素，工业化工艺研究与优化c）在车间生产若干批号后，制定生产工艺规程制定或修订生产工艺规程，工艺验证，产品的安全有效生产3. 药物生产过程分类化学制药、生物制药、中药制药、制剂工艺学4. 制药工艺要求最安全、最经济、最便捷、绿色工艺（三废：废水、气、渣）5. 生物制药工艺以生物体和生物酶反应过程为基础，生产制造出商品化药物的工艺。上游工艺/生物加工过程:以生物材料为核心，目的在于获得药物，包括菌株与细胞系的建立、微生物发酵/细胞培养工艺等下游工艺/生物分离过程:以药物后处理为核心，包括提取、分离、精制工艺、产品质量检测及保证等。6. 化学制药工艺学全合成制药：磺胺嘧啶，阿司匹林，普鲁卡因半合成制药：多烯紫杉醇，头孢类抗生素手性制药：阿托伐他汀，阿奇霉素7. 传统生物制药技术a) 天然生物材料的提取b) 微生物发酵制药c) 动物细胞培养技术制药8. 现代生物技术制药a) 基因工程技术制药b) 抗体工程技术制药c) 合成生物技术制药第十一章 抗生素发酵生产工艺11.1概述一、 定义与命名1. 定义由微生物、植物和动物产生的（或化学合成获得的）能在低微浓度下选择性抑制或杀灭其他生物的有机物质。2. 命名原则根据来源生物的属名。青霉素根据化学结构的性质。四环素一些习惯性俗名、发现的地名等。井岗霉素二、 分类三、 抗生素生产工艺技术的研究l 第一条途径：微生物发酵生产工艺。多数。成本低，周期长。l 第二条途径：全化学合成生产工艺。结构相对简单的抗生素。l 第三条途径：半合成生产工艺，利用化学方法修饰改良生物合成的抗生素，扩大抗菌谱、提高疗效和降低毒副作用等，获得新抗生素。l 微生物合成抗生素包括上游发酵和下游提取两部分，对于剂型产品，还需经过相应的制剂工艺11.2 青霉素的生产工艺一、 概述(1) 作用机理l 细胞壁合成中 肽多糖合成的第三阶段，肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽类似物竞争性与转肽酶结合，使转肽酶不能催化多肽链之间的交联l 生长中的细胞有效，静止细胞无效l 高效、安全的抗细菌感染药(2) 应用l 临床抗感染治疗：多数革兰氏阳性菌和某些阴性菌及螺旋体等。毒性小，但需要皮试。l 各种半合成抗生素的原料：氨苄青霉素，黄苄青霉素，乙氧萘青霉素，头孢菌素母核。(3) 理化特性l 易溶于醇、酸、醚、酯等l 水中溶解度小，很快失去活性l 能与无机碱或有机碱形成盐l Ph5-7较稳，ph6-6.5最稳l 青霉素盐易溶于水，不溶于乙醚、氯仿等，易溶于低级醇l 产品：钠、钾、普鲁卡因、二苄基二乙二胺盐二、 生产菌的生物特性(1) 产黄青霉形态特征 孢子：绿、黄。 菌落:平坦/褶皱，圆形。青霉穗：分生孢子链状。深层培养菌丝：球状、丝状。(2) 细胞学变化 第1期：分生孢子萌发，具有小泡第2期：菌丝繁殖，嗜碱性，类脂肪小颗粒第3期：脂肪包涵体，贮藏物，嗜碱性强第4期：空泡，嗜碱性减弱，开始产生抗生素第5期：大空泡，中性染色大颗粒，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高第6期：个别细胞自溶，胞内无颗粒，释放氨，ph上升第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁(3) 镜检控制l 规定时间取样，显微镜观察7个时期的形态变化，控制发酵l 1-4期为菌丝生长期，3期的菌体适宜为种子l 4-5期为生产期，生产能力最强，通过工程措施，延长此期，获得高产l 6期到来之前结束发酵(4) 流程框图三、 发酵工艺过程1. 孢子制备工艺l 斜面种子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的固体培养基培养l 米孢子：移植到小米或大米固体培养基上，生长7天，25l 注意:每批孢子必须进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。2. 种子罐培养工艺 一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝1) 培养基:葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫剂等2) 空气流量：体积比1：3， 300-350rpm,Ph自然，温度27+-1，40h 二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。接种量10%a) 培养基：葡萄糖，玉米浆，玉米油，消沫剂等b) 空气流量:1:1-1:1.5, 250-280rpm,ph自然，25+-1，10-14h质量:菌丝致密，菌丝粗壮，期，倍增期6-8h3. 生产罐培养工艺 三级罐：生产罐，接种量20%a) 培养基:花生粉饼，葡萄糖，尿素，硝酸铵，硫代硫酸钠，苯乙酰胺，碳酸钙，玉米油，硅油b) 通气量：1：0.8-1.2； 150-200rpm。 c) 前60h：ph6.4-6.6，26， 60h后，ph6.7，244. 发酵培养与过程控制1) 发酵培养. 操作方式：反复分批发酵. 发酵罐:100M3,装料80M3. 带放：6-19次，带放量10%，间隔24h. 发酵周期：180-220h2) 过程控制补料分批操作控制基质浓度l 概述 40h：培养基中的主要营养物 40h后，低速连续补加葡萄糖、氮源、苯乙酸等，维持一定的最适浓度 半饥饿状态：延长合成期，提高产量 碳源占成本12%以上，采用糖化液流加，降低成本 糖与6-氨基青霉烷酸结合形成糖基-6-氨基青霉烷酸，影响青霉素产量l 流加碳源控制 根据残糖、ph、尾气中CO2和O2含量 葡萄糖的波动范围窄，浓度低使抗生素合成速度减慢或停止，高导致呼吸活性下降甚至引起自溶 残糖0.3-0.6%左右，ph开始升高时流加糖 浓度：500kg/M3，流速1.0-2.5kg/M3hl 流加氮源控制 玉米浆：最好，含多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。玉米浆质量不稳定，可用花生饼粉或棉籽饼粉取代 补加无机氮源：硫酸铵，氨水，尿素 氨基氮浓度：0.01-0.05l 盐离子控制 无机盐:硫磷镁钾等 铁对青霉素合成有毒，30-40ug/ml一下 罐壁涂环氧树脂保护层3) 添加青霉素侧链前体. 时期：合成阶段. 种类:苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、本乙酰甘氨酸. 毒性：抑制细胞生长和青霉素合成. 策略:低浓度流加. 浓度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08%. 控制：保持供应速率略大于生物合成需要提高产量的其他物质流加. 表面活性剂：新洁尔灭、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、单油酸酯、单月桂酸酯、三油酸酯. 可溶性高分子化合物：聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇. 其他：剪切保护剂、分散剂4) 温度控制. 适宜菌丝生长温度30，分泌青霉素20（青霉破坏少，周期长）. 变温控制，不同阶段不同温度l 生长阶段：温度较高，缩短生长时间l 生产阶段:适当降低，利于青霉素合成前期控制26左右，后期降温控制245) Ph控制. 合成适宜ph6.4-6.6左右，避免超过7.0. 直接加酸或碱：自动控制. 流加葡萄糖:恒速变速依赖于ph变化的快慢. Ph下降补加碳酸钙、通氨、尿素或提高通气量. Ph下降补加糖、生理酸性物质（硫酸铵、油脂）6) 溶氧控制. 30%饱和度，产率急剧下降；100g/L），改造后用于其他氨基酸的生产2. 谷氨酸生物合成途径代谢过程1） EMP： 丙酮酸，ATP,NADH2 （NADPH2酮戊二酸还原氨基化必需的供氢体）2） HMP：6磷酸果糖丙酮酸3-磷酸甘油醛丙酮酸3） TCA循环:生成谷氨酸前体物质-酮戊二酸4） CO2固定反应：补充草酰乙酸5） 乙醛酸循环：使琥珀酸、延胡索酸和苹果酸的量得到补充，维持TCA循环的正常运转6） 还原氨基化反应：-酮戊二酸经谷氨酸脱氢酶作用下形成谷氨酸3. 谷氨酸生物合成途径谷氨酸发酵时，糖酵解经过EMP和HPM两个途径。生物素充足菌HMP所占比例约为38%，控制生物素亚适量的结果表明在发酵产酸期，EMP所占比例更大，约为74%。生成丙酮酸后：一部 分氧化脱羧生成乙酰辅酶A，一部分固定二氧化碳生成草酰乙酸或苹果酸，草酰乙酸和乙酰辅酶A在柠檬酸合成酶催化下缩合为柠檬酸，在经过氧化还原共轭的氨基化反应生成谷氨酸。4. 谷氨酸生产菌的生化特征l 有苹果酸和丙酮酸羧化酶l -酮戊二酸脱氢酶活性弱，异柠檬酸脱氢酶活性强，异柠檬酸裂解酶活性弱。l 谷氨酸脱氢酶活性高，经呼吸链氧化NADPH2的能力弱l 菌体本身利用谷氨酸的能力低三、 谷氨酸发酵工艺过程淀粉糖化菌种制备发酵培养分离纯化精制成盐1. 培养基组成及制备1） 淀粉糖化工艺a) 酸水解和酶水解b) 液化：淀粉原料加盐酸，ph1.5c) 糖化：蒸汽加热，300kpa作用，25mind) 冷却：80e) 中和:加碱，ph4.5。析出蛋白质和胶体f) 脱色：除去色素和杂质（抑制发酵）。活性炭吸附和树脂g) 过滤：得到糖液。制备培养基，进入发酵阶段。糖蜜原料：含有丰富的生物素，不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源（自己补充：培养液的生物素含量是影响谷氨酸发酵最重要的因素。过多的生物素会降低细胞膜的通透性，造成谷氨酸排出障碍，需控制在亚适量水平）预处理办法：活性炭或树脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素，也可以在发酵液中加入表面活性吐温60或添加青霉素（自己补充：青霉素阻止细胞壁的合成，控制菌体的增殖，同时清除代谢产物的通透性障碍，便于使谷氨酸在菌体外部大量积累）2） 氮源：铵盐、尿素、氨水C/N=100:15-21，实际高达100:28因为:1)用于调整PH；2)分解产生的NH3从发酵液中逸出产酵阶段:NH4+不足:使a一酮戊二酸积蓄而很少有谷氨酸生产。NH4+过量:促使谷氨酸生成谷氨酰胺。3) 无机盐:磷酸盐、镁、钾、钠、铁、锰、铜，其中磷酸盐对发酵有显著影响:不足:糖代谢受抑制，菌体生产不足。过多:细胞膜磷脂生成量多，不利于谷氨酸排出。促使丙酮酸和乙醛(由丙酮酸脱羧生成)缩合生成缬氨酸的前体物-乙醛乳酸，使缬氨酸在发酵液中积蓄。4) 生长因子:生物素 作用:影响细胞膜通透性和代谢途径。l 作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰COA的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，进而影响磷脂的合成。l 浓度过大: 促进菌体生长，谷氨酸产量低。因为:乙醛酸循环活跃， a-酮戊二酸生成量减少.转氨酶活力增强，谷氨酸转变成其他氨基酸。2.生产种子制备工艺l 斜面菌种: 葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、NaCl等，PH7.0-7.2。30C-34 C,18-24h。l 一级种子: 葡萄糖、尿素、硫酸镁、玉米浆、磷酸氢二钾，少量硫酸亚和硫酸锰。恒温通气培养12h, OD达0.5 以上，残糖0.5%以下。l 二级种子: 水解糖取代葡萄糖等，pH6.5-7.0。接种量0.8%-1.0%，7-8h,通气比1:0.3-0.5。OD净增加0.5，残糖1.0%以下。l 质量控制: 无污染，细胞健壮，密度108-109/ml3. 生产罐培养工艺l 接种量:0.5-1.5%l 温度：前期33-35，中后期36-38l 供氧：高氧量、高产率。通气比1：0.11-0.13l Ph：前期7.5左右，中后期7.-7.1左右，下降时多次少量流加尿素l 在中性和微碱性时积累产物，酸性时形成谷氨酰胺4、 发酵培养过程控制特点l 典型的代谢控制发酵：人为打破正常代谢调节机制，使代谢流按预期方向进行，过量积累产物。l 生物素的影响:不足，生长缓慢，周期长，低产高氧，过量，快，低pH，不产:限氧，过量，转向乳酸发酵。生物素适量控制:2-5ug/L.l 过程特点n 延滞期：2-4hn 对数期：ph，然后，溶氧急剧，然后维持，菌体浓度增大，12hn 生产期：菌体浓度基本不变，产物大量合成n 放罐：近中性ph，浅黄色，谷氨酸铵盐形式。湿菌体占发酵液5-8%，其他各种氨基酸含量低于1%，铵离子0.6-0.8%，残糖1%以下n 整个周期：30h左右l 细胞膜通透性得调节n 控制细胞膜形成v 利用生物素缺陷型菌种进行谷氨酸发酵时，限制谷氨酸发酵培养基中生物素的浓度。v 利用生物素过量的糖蜜原料进行谷氨酸发酵时，添加表面活性剂或饱和脂肪酸。v 利用油酸缺陷型，限制发酵培养基油酸的浓度。v 利用甘油缺陷型，限制甘油浓度n 控制细胞壁的形成v 细胞壁的骨架结构是肽聚糖，肽聚糖的合成及其调节控制就与细菌细胞膜的通透性密切相关v 青霉素是转肽酶的抑制剂，与转肽酶活性部位上的ser残基形成了共价键，使转肽酶受到不可逆抑制v 青霉素作为糖肽末端结构的类似物，竞争性抑制合成糖肽的底物，而与转肽酶的活性中心结合，使糖肽合成不能完成，结构形成不完整的细胞壁，使细胞膜处于无保护状态，易破损，增大谷氨酸通透性12.3分离纯化工艺过程一、分离纯化原理 等电点沉淀原理:ph3.2时，谷氨酸过饱和析出 二、操作过程 1.盐酸调ph4.5-4.5，出现晶核，育晶2h酸调ph3.0-3.2，搅拌20h降温至5，结晶沉淀静置6h，吸去上层菌体和其他氨基酸，下层得粗谷氨酸（麸酸） 关键在于控制适宜温度 2.纯化:活性炭脱色，热水洗涤，收集谷氨酸 三、谷氨酸钠 谷氨酸单钠:谷氨酸溶液中加Na2CO3 粗品:减压蒸发，除水，过饱和结晶析出 纯品:除铁，脱色，静置结晶 第13章 维生素发酵生产工艺 13.1概述 一、维生素种类与命名 1.概念:生物生长和代谢所必需的微量有机化合物，既不组成细胞结构，又不提供能量，起代谢调节作用。 2.根据溶解性分类：水溶性：VB1（硫胺素）,VB2（核黄素）,VB3(烟酸)，VB5（泛酸），VB6,VB9（叶酸），B12,VC（抗坏血酸），VH（生物素）等脂溶性：VA,VD,VE（生育酚）,VK3. 维生素命名a) 按英文b) 按化学本质c) 按生理功能二、维生素生理功能1.主要调节酶活性和代谢活性，以辅酶或辅基形式参与酶反应。人体内不能合成维生素，缺乏它会导致疾病2.维生素缺乏的原因： 1、食物供应严重不足，摄入不足；如：食物单一、 储存不当、烹饪破坏等。比如叶酸受热损失。 2、吸收利用降低；如：消化系统疾病或摄入脂肪 量过少从而影响脂溶性Vit的吸收（现代都市人 少见）。 3、维生素需要量相对增高；如：妊娠和哺乳期妇女、 儿童、特殊工种、特殊环境下的人群。 4、不合理使用抗生素会导致对维生素的需要量增加。 3.维生素生产工艺研究生产方式：微生物发酵、化学合成、天然提取，以化学合成为主，发酵为辅，少数提取。 13.2维生素C生产工艺 一、维生素C理化性质1.维生素C，水溶性，水果蔬菜中含量丰富。在氧化还原代谢反应中起调节作用，缺乏导致坏血病2.化学结构:己糖类食物，三元醇酮酸的内酯。 4种旋光异构体，只有 L (+)型活性最高，其他3种临 床效果很低或无活性。3.主要生理功能l 解毒：体内补充大量的维生素C后，可以缓解铅、汞、镉、 砷等重金属对机体的毒害作用。l 预防癌症：Vc可以阻断致癌物N-亚硝基化合物合成。 l 清除自由基协同作用：Vc和生育酚、还原型辅酶II在体内可协同清除自由基。4.理化性质 l 白色结晶或结晶性粉末，无臭，味酸。 熔点190-192度，同时分解。l 强还原剂，易受光、热、氧化等破坏，形成双酮基结构的氧化型维生素C，碱性或铜等金属，分解很快。l 易溶于水和甲醇，呈酸性反应，有旋光性。略溶于乙醇和丙酮，不溶于乙醚、氯仿、石油醚等有机溶剂。l 溶液由无色到浅黄色-黄色-棕色，干燥结晶状态较稳定。 褐变原因：內酯环水解后，发生脱羧而形成糠醛，聚合后变色。 l 保存条件：避光、避热、干燥、无金属离子或惰性气体容器。 二、 生产工艺路线的研究1、莱氏法化学合成工艺双酮糖法 l D-葡萄糖为原料，经过催化氢化生成D-山梨醇， 然后生物氧化转变为L-山梨糖，酸性液中丙酮化， 对-，-二仲醇进行保护。 l L-山梨糖高锰酸钾在碱性溶液中氧化为二丙酮-2-酮L -古洛糖酸，除去丙酮，內酯化和烯醇化，的 L -抗坏 血酸。 l 整个合成过程必须保持第4位碳原子的构型不变。2、两步发酵工艺3、两条工艺的比较l 以生物氧化取代化学氧化，工艺简洁。 l 省去了丙酮化反应和氧化反应。 l 节约丙酮、硫酸、高锰酸钾、氢氧化钠等原料试剂， 防爆设备。 l 三废和污染小，提高了生产能力。 三、两步发酵生产工艺过程1、 D -山梨醇的化学合成 l 策略：山梨醇和葡萄糖都是6碳糖类化合物，二者差别在于C1基团。D-葡萄糖C1上醛基还原成醇基，即D-山梨醇。 l 原理与方法：催化氢化D-葡萄糖，控制压力，氢作还原剂、镍作催化剂，将醛基还原成醇基，制备 D -山梨醇。l 工艺催化氢化 n 配料：70-75；搅拌，50%葡萄糖溶液；加入活性碳，过滤，石灰乳调节pH8.4。 n 压入氢化反应器，加入Raney镍催化剂。 通入氢气，3.43D106Pa，104 。 不吸收氢气为反应终点。 n 提取：静止沉降，除去催化剂，离子交换、脱色， 减压浓缩。60-70%粘稠液体。 n 质控：比旋度，控制副反应甘露醇含量。 葡萄糖差向异构化形成甘露糖，被还原成甘露醇。2、第一步发酵l 原料：D-山梨醇；产物；L-山梨糖 l 策略：C-2位羟基氧化物羰基，其他基团不变，微生物转化。l 黑醋酸杆菌， 生长30-36， 最适30-33 l 斜面保存，0-5 冰箱。 l 种子培养，30-33 振荡48h。菌形正常，无杂菌， 方可生产。l 发酵工艺 n 种子扩大培养，接入发酵罐，种子和发酵培养基主要包括山梨醇、玉米浆、泡敌、酵母膏、碳酸钙等成分，pH5.0-5.2。 n 山梨醇浓度控制在24-27%，温度29-30，通气比为1:1-0.7VVM。 n 测定发酵液中山梨糖，当浓度不再增加时，结束发酵， 约10h。 n D -山梨醇转化 L -山梨糖的生物转化率达98%以上。 发酵液经低温60 灭菌20min，冷却至30 ，作为第二步发酵的原料。3、第二步发酵l 策略： L -山梨糖到2-酮基L -古龙酸需要将C1位醇基氧化为羧基，保持其他基团不发生变化。 l 许多微生物能使 L -山梨糖转化为2-酮基L -古龙酸l 1）菌种特点 n 活力最强：醋酸杆菌、葡萄糖酸杆菌和芽孢杆菌。 工业生产中，采用氧化葡萄糖酸杆菌（俗称小菌） 和巨大芽孢杆菌（俗称大菌）搭配使用两种混合菌培养，产物收率达最高水平。 单独使用一种菌，一般产量很低。n 葡萄糖酸杆菌：革兰氏阴性，生鞭毛或不具鞭毛， pH4.5时生产。最适生产温度30-35 （弱氧化葡萄糖酸杆菌）或18-21 （氧化葡萄糖酸杆菌）l 2）可能的机理（看不懂）n 葡萄糖酸杆菌为产酸菌：L-山梨糖转化为L-艾杜糖（把C1位羟基氧化为醛基和羧基，艾杜酸）n 巨大芽孢杆菌为搭配菌：转化为2-酮基L -古龙酸 （把C2位羟基氧化为酮基）l 3）发酵工艺 n 种子和发酵培养基的成分类似，主要由 L -山梨糖、玉米浆、尿素、碳酸钙、磷酸二氢钾等，pH值为7.0。 n 大、小菌经二级种子扩大培养，接入含有第一步发酵液的发酵罐中，20-30下通入无菌空气。n 培养72h左右，温度略高（31-33 ）、pH在7.2 左右、残糖量0.5-0.8%以下，即为发酵终点。n 由 L -山梨糖生成2-酮基L -古龙酸转化率达70-85%。l 4）过程控制 n 发酵罐在100m3以上，瘦长型的气升式反应器，无机械搅拌。 n 发酵前期：菌体生长期，供氧充足，高溶解氧状态，促进生长，缩短前期。n 发酵中期：主要产酸期，产酸率和耗糖率为常数， 溶解氧浓度应该控制在适宜的范围内（20%）。 n 发酵后期：菌体活力下降，生产能力减慢，根据产酸浓度和残糖及时结束发酵。n 滴加碱液调pH值，使保持7.0左右。n 发酵关键：保持一定数量氧化葡萄糖酸杆菌。n 策略：根据芽孢（芽胞：细菌的休眠体）的形成时间来控制发酵。n 芽孢杆菌开始形成芽孢时：产酸菌株开始产生2-酮基L -古龙酸，直到完全形成芽孢后和出现游离芽孢时，产酸达高峰。 n 方法：显微镜检查。游离芽胞及残存芽孢杆菌菌体已逐步自溶成碎片，已无法区分两种细菌细胞的差别，整个产酸反应就结束了。l 5） 2-酮基L -古龙酸的分离纯化l 2-酮基L -古龙酸含量8%左右，残留菌丝体、蛋白质和悬浮的固体颗粒等杂质。 l 发酵液预处理：静置沉降，菌体蛋白质沉淀。l 上清液一次阳离子交换，控制流出液的pH值：收集流出液和洗脱液，调节pH至等电点，加热70，加入活性碳，升温90-95 维持10-15min，速冷，过滤。 l 二次阳离子交换：控制流出液pH1.5-1.7,酸化为2-酮基-L -古龙酸l 在45下减压浓缩，冷却结晶，离心分离，冰乙醇洗涤，得到2-酮基-L古龙酸，提取率80%以上。 四、维生素C的制备 1.原理： 2-酮基L -古龙酸C4位内酯化、C2位烯醇化得到维生素C。2.策略：酸或碱催化剂作用下实现。 1）酸转化工艺（被淘汰）设备简单，流程短，但维生素C破坏严重，质量差。设备腐蚀严重，三废问题没有解决。2）碱转化：目前的生产方法l 甲酯化：在无水甲醇中用浓硫酸催化生成2-酮基L 古龙酸甲酯。l 内酯化成盐：加NaHCO3转化生成维生素C钠盐，离心分离。 l 酸化脱色：经氢型离子交换树脂酸化。 l 在50-55下减压烘干，得到粗品维生素C. l 碱转化工艺流程较长，投资较大，设备腐蚀少， 质量较好。3） 维生素C的精制第十四章 基因工程制药工艺基因工程菌：以微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因，或过量表达或抑制自身基因的工程生物体。种类：基因工程大肠杆菌和酵母：重组蛋白质药物；基因工程技术改造出发菌：氨基酸、抗生素、载体激素、中间体生产。14.1 基因工程制药微生物表达系统14.1.1 大肠杆菌表达系统1、大肠杆菌（Eschericlia coli）形态特征细胞：G，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般无荚膜。裂殖。菌落:白色至黄白色，光滑，直径23mm。2、生化与遗传特性能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。基因工程中使用菌株：K12株的衍生菌株。基因组：4.6 Mb，3000多种蛋白质。染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒。3、产物表达形式不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体可溶性蛋白质：存在于细胞质周质表达: 外源蛋白被运输分泌到周质，可溶性。胞外表达：胞内可溶性蛋白质分泌到培养液中。4、优点和不足发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。遗传背景清楚、目标基因表达水平高（达70），培养周期短，抗污染能力强。不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达。细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素，具有抗原性，产生热源。N端增加的蛋氨酸容易引起免疫反应。14.1.2 酵母表达系统1、形态特征细胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。2、生长与遗传特征两个性别不同的单倍体细胞结合形成二倍体接合子。能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生长繁殖迅速，倍增期约2h。酿酒酵母有17条染色体。1996年完成其全基因组测序，遗传背景相对清楚。 3、优点与不足载体安全、无毒。营养缺陷选择外来质粒。培养条件简单、大规模培养技术成熟。亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。缺点：酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。14.2 基因工程大肠杆菌的构建技术14.2.1 构建流程 14.2.2 目标基因的克隆策略一、概述目标基因：是编码蛋白质或多肽的DNA序列。 正确克隆的重要性: 只要有一个碱基发生（错义、无义、移码）突变，就导致编码氨基酸的变化，影响产物蛋白质的功能和生物学活性。只要一个碱基发生同义突变，就可能导致生产过程和效率变化。核酸的一级化学结构：有头5磷酸端，有尾3羟基，骨架戊糖，连接的键磷酸二酯键基因克隆方法的选择方法优点缺点PCR扩增简单快速高效，数kb单基因克隆DNA聚合酶活性和保真性限制文库筛选长片段，无碱基错误，未知序列基因克隆繁琐，过程复杂，耗时，昂贵化学合成简便准确，已知序列，引物合成受合成仪性能限制，长度很短RT-PCR克隆目标基因流程反转录:起始材料RNA PCR ：起始材料DNA反转录反应的操作 样品变性：75水浴5 min，冰冷，引物与mRNA配对。 反转录：反转录酶42或37，cDNA第1链，1 h。 终止反应：使反转录酶失活，95加热5 min。 反转录酶：RNA依赖的DNA聚合酶，以RNA为模板， dNTP为底物，以DNA为引物，合成与RNA互补的 DNA。 AMV：在42下反应，合成片段较短； MMLV：在37下反应，合成片段较长。 注意事项：工作环境洁净度，防止RNase的污染。 所用水及相关试剂必须用DEPC处理，除去RNase。 二、PCR扩增（1）PCR技术PCR (Polymerase chain reaction, PCR)： 聚合酶链式反应：在引物指导下，以DNA为模板，由DNA聚合酶催化的扩增特定DNA序列聚合延伸形成互补序列的反应。本质：生物体的DNA复制原理在体外合成基因。 发明者：Mullis，生物技术革命性象征，1993年 获得诺贝尔化学奖。（2） PCR单反应原理与过程 （3）PCR扩增的反应体系组成 三、酶切反应l 概念：在特异位点上催化双链DNA分子的断裂， 产生相应的限制性片段。 l 酶切反应操作： 酶切体系组成：DNA，缓冲液，限制性内切酶。 反应条件：适宜温度(37)，1小时以上。 终止反应：加热；加入EDTA，螯合镁离子。 电泳检查：酶切完全性。四、 连接反应l 概念： DNA 双链上相邻的 3羟基和 5磷酸基因共价结合形成3-5磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来。 l 连接反应操作 连接体系：载体片段与基因片段，缓冲液，连接酶。 连接反应：16-26，数小时,或过夜。 终止反应：在70加热10分钟。五、 转化l 转化：把外源基因导入宿主细胞的过程。 l 大肠杆菌转化CaCl2法 感受态细胞制备:Ecoli经CaCl2处理（0-5），使细胞膜通透性增加，从而具有社区外援DNA的能力。 感受态细胞融化：置冰上，缓慢。 加入连接反应产物：混匀，置冰上30分钟。 热击：42，90秒。 置冰上，12分钟。 扩增培养：加入LB培养基，37，45分钟。 涂平板：含有抗生素的LB固体培养基上。 筛选培养：倒置平板，37，出现菌落。六、 筛选与鉴定（转化后的细胞类型 ） 非转化子：没有导入外源DNA的非转化宿主细胞 转化子：导入外源DNA的转化细胞 非重组子：仅含有空载体分子的转化子 重组子：含有重组DNA分子的转化子 目标重组子：含有连接正确的重组子（目的） 非目标重组子：连接不正确的重组子。（自己补充：原理：利用载体DNA分子所携带的选择性遗传标记基因筛选重组子。标记基因所对应的遗传表型与受体细胞是互补的，因此在培养基中施加合适的选择压力，可保证重组子显现，非重组子不现）（1） 筛选策略及方法n 抗生素筛选法：基于载体的抗生