制药工艺复习整理.docx

制药工艺复习整理
第一章 绪论
GLP（Good Laboratory Practice） 药物非临床研究质量管理规范
GCP (Good Clinical Practice) 药物临床试验质量管理规范
GMP（Good Manufacturing Practice ）药物生产质量管理规范
1. 研究对象
药物生产过程共性规律及应用，包括制备原理+工艺路线+质量控制
2. 主要内容
a) 实验室(小试)工艺
工艺路线设计与选择，反应与产物合成的动力学及其影响因素，质控标准与方法学
b）中试放大工艺
工艺参数的影响因素，工业化工艺研究与优化
c）在车间生产若干批号后，制定生产工艺规程
制定或修订生产工艺规程，工艺验证，产品的安全有效生产
3. 药物生产过程分类
化学制药、生物制药、中药制药、制剂工艺学
4. 制药工艺要求
最安全、最经济、最便捷、绿色工艺（三废：废水、气、渣）
5. 生物制药工艺
以生物体和生物酶反应过程为基础，生产制造出商品化药物的工艺。
上游工艺/生物加工过程:以生物材料为核心，目的在于获得药物，包括菌株与细胞系的建立、微生物发酵/细胞培养工艺等
下游工艺/生物分离过程:以药物后处理为核心，包括提取、分离、精制工艺、产品质量检测及保证等。
6. 化学制药工艺学
全合成制药：磺胺嘧啶，阿司匹林，普鲁卡因
半合成制药：多烯紫杉醇，头孢类抗生素
手性制药：阿托伐他汀，阿奇霉素
7. 传统生物制药技术
a) 天然生物材料的提取
b) 微生物发酵制药
c) 动物细胞培养技术制药
8. 现代生物技术制药
a) 基因工程技术制药
b) 抗体工程技术制药
c) 合成生物技术制药
第十一章 抗生素发酵生产工艺
11.1概述
一、 定义与命名
1. 定义
由微生物、植物和动物产生的（或化学合成获得的）能在低微浓度下选择性抑制或杀灭其他生物的有机物质。
2. 命名原则
根据来源生物的属名。青霉素
根据化学结构的性质。四环素
一些习惯性俗名、发现的地名等。井岗霉素
二、 分类
三、 抗生素生产工艺技术的研究
l 第一条途径：微生物发酵生产工艺。多数。成本低，周期长。
l 第二条途径：全化学合成生产工艺。结构相对简单的抗生素。
l 第三条途径：半合成生产工艺，利用化学方法修饰改良生物合成的抗生素，扩大抗菌谱、提高疗效和降低毒副作用等，获得新抗生素。
l 微生物合成抗生素包括上游发酵和下游提取两部分，对于剂型产品，还需经过相应的制剂工艺
11.2 青霉素的生产工艺
一、 概述
(1) 作用机理
l 细胞壁合成中 肽多糖合成的第三阶段，肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽类似物竞争性与转肽酶结合，使转肽酶不能催化多肽链之间的交联
l 生长中的细胞有效，静止细胞无效
l 高效、安全的抗细菌感染药
(2) 应用
l 临床抗感染治疗：多数革兰氏阳性菌和某些阴性菌及螺旋体等。毒性小，但需要皮试。
l 各种半合成抗生素的原料：氨苄青霉素，黄苄青霉素，乙氧萘青霉素，头孢菌素母核。
(3) 理化特性
l 易溶于醇、酸、醚、酯等
l 水中溶解度小，很快失去活性
l 能与无机碱或有机碱形成盐
l Ph5-7较稳，ph6-6.5最稳
l 青霉素盐易溶于水，不溶于乙醚、氯仿等，易溶于低级醇
l 产品：钠、钾、普鲁卡因、二苄基二乙二胺盐
二、 生产菌的生物特性
(1) 产黄青霉
形态特征 孢子：绿、黄。 菌落:平坦/褶皱，圆形。青霉穗：分生孢子链状。深层培养菌丝：球状、丝状。
(2) 细胞学变化
第1期：分生孢子萌发，具有小泡
第2期：菌丝繁殖，嗜碱性，类脂肪小颗粒
第3期：脂肪包涵体，贮藏物，嗜碱性强
第4期：空泡，嗜碱性减弱，开始产生抗生素
第5期：大空泡，中性染色大颗粒，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高
第6期：个别细胞自溶，胞内无颗粒，释放氨，ph上升
第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁
(3) 镜检控制
l 规定时间取样，显微镜观察7个时期的形态变化，控制发酵
l 1-4期为菌丝生长期，3期的菌体适宜为种子
l 4-5期为生产期，生产能力最强，通过工程措施，延长此期，获得高产
l 6期到来之前结束发酵
(4) 流程框图

三、 发酵工艺过程
1. 孢子制备工艺
l 斜面种子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的固体培养基培养
l 米孢子：移植到小米或大米固体培养基上，生长7天，25℃
l 注意:每批孢子必须进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。
2. 种子罐培养工艺
Ø 一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝
1) 培养基:葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫剂等
2) 空气流量：体积比1：3， 300-350rpm,Ph自然，温度27+-1℃，40h
Ø 二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。接种量10%
a) 培养基：葡萄糖，玉米浆，玉米油，消沫剂等
b) 空气流量:1:1-1:1.5, 250-280rpm,ph自然，25+-1℃，10-14h
质量:菌丝致密，菌丝粗壮，Ⅲ期，倍增期6-8h

3. 生产罐培养工艺
Ø 三级罐：生产罐，接种量20%
a) 培养基:花生粉饼，葡萄糖，尿素，硝酸铵，硫代硫酸钠，苯乙酰胺，碳酸钙，玉米油，硅油
b) 通气量：1：0.8-1.2； 150-200rpm。
c) 前60h：ph6.4-6.6，26℃， 60h后，ph6.7，24℃
4. 发酵培养与过程控制
1) 发酵培养
①. 操作方式：反复分批发酵
②. 发酵罐:100M3,装料80M3
③. 带放：6-19次，带放量10%，间隔24h
④. 发酵周期：180-220h
2) 过程控制——补料分批操作控制基质浓度
l 概述
①　 40h：培养基中的主要营养物
②　 40h后，低速连续补加葡萄糖、氮源、苯乙酸等，维持一定的最适浓度
③　 半饥饿状态：延长合成期，提高产量
④　 碳源占成本12%以上，采用糖化液流加，降低成本
⑤　 糖与6-氨基青霉烷酸结合形成糖基-6-氨基青霉烷酸，影响青霉素产量
l 流加碳源控制
①　 根据残糖、ph、尾气中CO2和O2含量
②　 葡萄糖的波动范围窄，浓度低使抗生素合成速度减慢或停止，高导致呼吸活性下降甚至引起自溶
③　 残糖0.3-0.6%左右，ph开始升高时流加糖
④　 浓度：500kg/M3，流速1.0-2.5kg/M3·h
l 流加氮源控制
①　 玉米浆：最好，含多种氨基酸及其前体苯乙酸和衍生物。玉米浆质量不稳定，可用花生饼粉或棉籽饼粉取代
②　 补加无机氮源：硫酸铵，氨水，尿素
③　 氨基氮浓度：0.01-0.05％
l 盐离子控制
①　 无机盐:硫磷镁钾等
②　 铁对青霉素合成有毒，30-40ug/ml一下
③　 罐壁涂环氧树脂保护层
3) 添加青霉素侧链前体
①. 时期：合成阶段
②. 种类:苯乙酸及其衍生物，苯乙酰胺、苯乙胺、本乙酰甘氨酸
③. 毒性：抑制细胞生长和青霉素合成
④. 策略:低浓度流加
⑤. 浓度：苯乙酸0.1%，苯乙酰胺0.05-0.08%
⑥. 控制：保持供应速率略大于生物合成需要
提高产量的其他物质流加
①. 表面活性剂：新洁尔灭、聚氧乙烯、山梨糖醇酐、单油酸酯、单月桂酸酯、三油酸酯
②. 可溶性高分子化合物：聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚乙二胺、聚乙烯吡咯烷醇
③. 其他：剪切保护剂、分散剂
4) 温度控制
①. 适宜菌丝生长温度30℃，分泌青霉素20℃（青霉破坏少，周期长）
②. 变温控制，不同阶段不同温度
l 生长阶段：温度较高，缩短生长时间
l 生产阶段:适当降低，利于青霉素合成
前期控制26℃左右，后期降温控制24℃
5) Ph控制
①. 合成适宜ph6.4-6.6左右，避免超过7.0
②. 直接加酸或碱：自动控制
③. 流加葡萄糖:恒速变速依赖于ph变化的快慢
④. Ph下降补加碳酸钙、通氨、尿素或提高通气量
⑤. Ph下降补加糖、生理酸性物质（硫酸铵、油脂）
6) 溶氧控制
①. <30%饱和度，产率急剧下降；<10%，造成不可逆损害
②. 临界溶氧浓度：30%
③. 通气比：1：0.8-1.5
④. 适宜的搅拌速度：保证气液混合，提高溶氧
⑤. 调整搅拌转速：各阶段的生长和耗氧量不同
7) 消沫
①. 天然油脂：玉米油
②. 化学消沫剂:泡敌
③. 策略：少量多次
④. 注意:前期不宜多加，影响呼吸代谢
四、 提炼工艺
1. 性质
1) 青霉素不稳定，遇酸碱热分解失活
2) 水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定。易溶于有机溶剂，水中溶解度很小
3) 青霉素盐很稳定，降解产物具有致敏性
4) 防止降解，条件温和、快速

2. 工艺
1) 预处理
①　 青霉素存在部位：发酵液
②　 浓度较低:10-30kg/M3
③　 含有大量杂质：菌体细胞、核酸、杂蛋白质、细胞壁多糖等、残留的培养基、色素、盐离子、代谢产物等
④　 目的：浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程
⑤　 预处理:发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白
2) 过滤
①　 鼓式真空过滤机过滤：一次滤液——ph6.2-7.2，略浑，棕黄或棕色，蛋白质含量0.5-2.0%（菌丝体粗长10um，用鼓式真空过滤机过滤，滤渣形成紧密饼状，容易从滤布上刮下，需要进一步出去蛋白质）
②　 板框式过滤机过滤:硫酸调节ph4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶（PPB），0.07%硅藻土为助滤剂
③　 二次滤液——澄清透明，用于提取（收率90%）
3) 溶剂萃取
①　 原理：青霉素是游离酸，易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水
②　 萃取剂：青霉素分配系数高的有机溶剂，工业上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。
③　 除去蛋白质：加0.05-0.1%乳化剂PPB
④　 萃取2-3次
逆流萃取过程
⑤　 正相萃取:酸化ph1.8-2.0，加0.05-0.1%乳化剂PPB
滤液：醋酸丁酯=1：0.3，碟片式离心机分离 （浓缩1.5-2.1）
⑥　 反相萃取:ph6.8-.7.4（磷酸盐、碳酸盐缓冲液）。把青霉素从丁酯中提取到缓冲液中。有机相：水相=3-4：1
萃取2-3次，达到结晶要求
萃取条件:10℃以下，萃取罐冷冻盐水冷却
4) 脱色
萃取液中添加活性炭除去色素\热源→过滤，除去活性炭
5) 结晶——直接结晶
原理：青霉素钾盐在醋酸丁酯中溶解度很低。在2次丁酯萃取液中：
加醋酸钠-乙醇溶液：得到青霉素钠盐
加醋酸钾-乙醇溶液：得到青霉素钾盐
6) 结晶——共沸蒸馏结晶
①　 萃取液，再用0.5M NaOH溶液萃取
②　 Ph6.4-6.8下得到钠盐水浓缩液
③　 加3-4倍体积丁醇，16-26℃，真空0.67-1.3KPa下蒸馏
④　 水和丁醇形成共沸物而蒸出，钠盐结晶析出
⑤　 结晶经过洗涤、干燥（60℃真空16h），磨粉，装桶，得到青霉素产品

第十一章 氨基酸发酵生产工艺
12.1概述
一、 氨基酸的种类与命名
a) 羧酸中α碳上的一个原子被氨基取代而成的一类化合物，属于氨基取代羧酸
b) R为其他基团，不同氨基酸在于R不同
c) 手性碳原子，旋光性和D、L两种异构体
d) 氨基酸常用其英文三字母或单字母简写
e) 组成蛋白质的氨基酸有20种，L-型右旋性。其他有D型氨基酸
f) 氨基酸是初级代谢产物
g) 应用于药品、食品、饲料和化工等领域
二、 分类
氨基酸和羧基数目
中性：甘氨酸、丙氨酸等
酸性：谷氨酸、天冬氨酸
碱性：赖氨酸、精氨酸、组氨酸
氨基酸的极性
非极性氨基酸：甘氨酸、丙氨酸等
极性氨基酸：谷氨酸、天冬氨酸
亲水性疏水性
亲水性：丝氨酸、苏氨酸等
疏水性：缬氨酸、亮氨酸等
三、 功能
1. 构成人体基本物质，是生命的物质基础
a) 合成组织蛋白质
b) 变成酸、激素、抗体、肌酸等含氨物质
c) 转变为碳水化合物和脂肪
d) 氧化成CO2和水及尿素，产生能量
2. 在食物营养中的地位和作用
蛋白质在机体内的消化吸收通过氨基酸完成；氮平衡；转变为糖或脂肪；参与构成酶、激素、部分维生素；成人必需氨基酸的需要量约为蛋白质需要量的20%-37%
3. 在医疗中的作用
四、 氨基酸的FDA相关法规
1.主要成分（非牛来源）
口服制剂，全输液注射营养品，大体积输液用药
2. 辅料
缓冲液（Gly，His），稳定剂（Gly），抗氧化剂（Met，Cys）
3. 试剂
缓冲液的成分，多肽合成的成分，细胞培养基成分
4. 不同用途对氨基酸的来源和生产方法有法规的制约
5. 纯度和安全性至关重要
12.2谷氨酸发酵生产工艺
一、 氨基酸生产工艺分类
a) 微生物发酵生产工艺：成本低，周期长
b) 酶法转化工艺：手性制药，占总量的10%。适合D-氨基酸和DL-氨基酸的手性拆分。特点：工艺简单、转化率高、副产物少、易精制。
c) 全化学合成生产工艺：不受氨基酸品种限制，理论上课生产天然氨基酸和非天然氨基酸。但产物是D L-型外消旋体，必须拆分才得单一对映体。不对称合成工艺可制备得到L-氨基酸。占总量的20%，在经过分离纯化制备各种氨基酸
二、 谷氨酸的生产工艺概述
1. 谷氨酸生产菌特性
1) 棒状杆菌属，短杆菌属、小短杆菌属和节杆菌
2) 革兰阳性：球、棒状、短杆型，无芽孢，无鞭毛
3) 三羧酸循环、戊糖磷酸途径突变，耐高浓度谷氨酸并向胞外分泌。生物素缺陷型，脲酶活性强。
4) 国外：甘蔗糖蜜或淀粉水解糖为原料强制发酵
国内：甜菜糖蜜或淀粉水解糖为原料生物素亚适量发酵
5) 操作方式：连续式或分批式、分批流量发酵。
PS：谷氨酸棒杆菌，非致病菌，具有高产性（>100g/L），改造后用于其他氨基酸的生产
2. 谷氨酸生物合成途径代谢过程
1） EMP： 丙酮酸，ATP,NADH2 （NADPH2→α酮戊二酸还原氨基化必需的供氢体）
2） HMP：6—磷酸果糖→丙酮酸
3-磷酸甘油醛→丙酮酸
3） TCA循环:生成谷氨酸前体物质→α-酮戊二酸
4） CO2固定反应：补充草酰乙酸
5） 乙醛酸循环：使琥珀酸、延胡索酸和苹果酸的量得到补充，维持TCA循环的正常运转
6） 还原氨基化反应：α-酮戊二酸经谷氨酸脱氢酶作用下形成谷氨酸

3. 谷氨酸生物合成途径
谷氨酸发酵时，糖酵解经过EMP和HPM两个途径。生物素充足菌HMP所占比例约为38%，控制生物素亚适量的结果表明在发酵产酸期，EMP所占比例更大，约为74%。
生成丙酮酸后：
一部 分氧化脱羧生成乙酰辅酶A，一部分固定二氧化碳生成草酰乙酸或苹果酸，草酰乙酸和乙酰辅酶A在柠檬酸合成酶催化下缩合为柠檬酸，在经过氧化还原共轭的氨基化反应生成谷氨酸。

4. 谷氨酸生产菌的生化特征
l 有苹果酸和丙酮酸羧化酶
l α-酮戊二酸脱氢酶活性弱，异柠檬酸脱氢酶活性强，异柠檬酸裂解酶活性弱。
l 谷氨酸脱氢酶活性高，经呼吸链氧化NADPH2的能力弱
l 菌体本身利用谷氨酸的能力低
三、 谷氨酸发酵工艺过程
淀粉糖化→菌种制备→发酵培养→分离纯化→精制成盐

1. 培养基组成及制备
1） 淀粉糖化工艺
a) 酸水解和酶水解
b) 液化：淀粉原料加盐酸，ph1.5
c) 糖化：蒸汽加热，300kpa作用，25min
d) 冷却：80℃
e) 中和:加碱，ph4.5。析出蛋白质和胶体
f) 脱色：除去色素和杂质（抑制发酵）。活性炭吸附和树脂
g) 过滤：得到糖液。制备培养基，进入发酵阶段。
糖蜜原料：含有丰富的生物素，不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源
（自己补充：培养液的生物素含量是影响谷氨酸发酵最重要的因素。过多的生物素会降低细胞膜的通透性，造成谷氨酸排出障碍，需控制在亚适量水平）
预处理办法：活性炭或树脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素，也可以在发酵液中加入表面活性吐温60或添加青霉素
（自己补充：青霉素阻止细胞壁的合成，控制菌体的增殖，同时清除代谢产物的通透性障碍，便于使谷氨酸在菌体外部大量积累）
2） 氮源：铵盐、尿素、氨水
  C/N=100: 15-21，实际高达100:28
因为: 1) 用于调整PH；2)分解产生的NH3从发酵液中逸出
产酵阶段:
  NH4+不足: 使a一酮戊二酸积蓄而很少有谷氨酸生产。
  NH4+过量:促使谷氨酸生成谷氨酰胺。
3) 无机盐:磷酸盐、镁、钾、钠、铁、锰、铜，其中磷酸盐对发酵 有显著影响:
不足:糖代谢受抑制，菌体生产不足。
过多:细胞膜磷脂生成量多，不利于谷氨酸排出。
   促使丙酮酸和乙醛(由丙酮酸脱羧生成)缩合生成缬氨酸的前体物 α-乙醛乳酸，使缬氨酸在发酵液中积蓄。
4) 生长因子:生物素
作用:影响细胞膜通透性和代谢途径。
l 作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰COA的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，进而影响磷脂的合成。
l 浓度过大: 促进菌体生长，谷氨酸产量低。因为:
乙醛酸循环活跃， a-酮戊二酸生成量减少
. 转氨酶活力增强，谷氨酸转变成其他氨基酸。

2.生产种子制备工艺
l 斜面菌种: 葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、NaCl等，PH7.0-7.2。30C-34 "C,18-24h。
l 一级种子: 葡萄糖、尿素、硫酸镁、玉米浆、磷酸氢二钾，少量硫酸亚和硫酸锰。恒温通气培养12h, OD达0.5 以上，残糖0.5%以下。
l 二级种子: 水解糖取代葡萄糖等，pH6.5-7.0。接种量0.8%-1.0%，7-8h,通气比1:0.3-0.5。OD净增加0.5，残糖1.0%以下。
l 质量控制: 无污染，细胞健壮，密度108-109/ml
3. 生产罐培养工艺
l 接种量:0.5-1.5%
l 温度：前期33-35℃，中后期36-38℃
l 供氧：高氧量、高产率。通气比1：0.11-0.13
l Ph：前期7.5左右，中后期7.-7.1左右，下降时多次少量流加尿素
l 在中性和微碱性时积累产物，酸性时形成谷氨酰胺
4、 发酵培养过程控制特点
l 典型的代谢控制发酵：人为打破正常代谢调节机制，使代谢流按预期方向进行，过量积累产物。
l 生物素的影响:
不足，生长缓慢，周期长，低产
高氧，过量，快，低pH，不产:
限氧，过量，转向乳酸发酵。
生物素适量控制: 2-5ug/L.
l 过程特点
n 延滞期：2-4h
n 对数期：ph↑，然后↓，溶氧急剧↓，然后维持，菌体浓度增大，12h
n 生产期：菌体浓度基本不变，产物大量合成
n 放罐：近中性ph，浅黄色，谷氨酸铵盐形式。湿菌体占发酵液5-8%，其他各种氨基酸含量低于1%，铵离子0.6-0.8%，残糖1%以下
n 整个周期：30h左右
l 细胞膜通透性得调节
n 控制细胞膜形成
v 利用生物素缺陷型菌种进行谷氨酸发酵时，限制谷氨酸发酵培养基中生物素的浓度。
v 利用生物素过量的糖蜜原料进行谷氨酸发酵时，添加表面活性剂或饱和脂肪酸。
v 利用油酸缺陷型，限制发酵培养基油酸的浓度。
v 利用甘油缺陷型，限制甘油浓度
n 控制细胞壁的形成
v 细胞壁的骨架结构是肽聚糖，肽聚糖的合成及其调节控制就与细菌细胞膜的通透性密切相关
v 青霉素是转肽酶的抑制剂，与转肽酶活性部位上的ser残基形成了共价键，使转肽酶受到不可逆抑制
v 青霉素作为糖肽末端结构的类似物，竞争性抑制合成糖肽的底物，而与转肽酶的活性中心结合，使糖肽合成不能完成，结构形成不完整的细胞壁，使细胞膜处于无保护状态，易破损，增大谷氨酸通透性
12.3分离纯化工艺过程
一、分离纯化原理
等电点沉淀原理:ph3.2时，谷氨酸过饱和析出
二、操作过程
1.盐酸调ph4.5-4.5，出现晶核，育晶2h→酸调ph3.0-3.2，搅拌20h→降温至5℃，结晶沉淀→静置6h，吸去上层菌体和其他氨基酸，下层得粗谷氨酸（麸酸）
关键在于控制适宜温度
2.纯化:活性炭脱色，热水洗涤，收集谷氨酸
三、谷氨酸钠
谷氨酸单钠:谷氨酸溶液中加Na2CO3
粗品:减压蒸发，除水，过饱和结晶析出
纯品:除铁，脱色，静置结晶
第13章 维生素发酵生产工艺
13.1概述
一、维生素种类与命名
1.概念:生物生长和代谢所必需的微量有机化合物，既不组成细胞结构，又不提供能量，起代谢调节作用。
2.根据溶解性分类：
水溶性：VB1（硫胺素）,VB2（核黄素）,VB3(烟酸)，VB5（泛酸），VB6,VB9（叶酸），B12,VC（抗坏血酸），VH（生物素）等
脂溶性：VA,VD,VE（生育酚）,VK
3. 维生素命名
a) 按英文
b) 按化学本质
c) 按生理功能
二、维生素生理功能
1.主要调节酶活性和代谢活性，以辅酶或辅基形式参与酶反应。人体内不能合成维生素，缺乏它会导致疾病
2.维生素缺乏的原因： 1、食物供应严重不足，摄入不足；如：食物单一、 储存不当、烹饪破坏等。比如叶酸受热损失。 2、吸收利用降低；如：消化系统疾病或摄入脂肪 量过少从而影响脂溶性Vit的吸收（现代都市人 少见）。 3、维生素需要量相对增高；如：妊娠和哺乳期妇女、 儿童、特殊工种、特殊环境下的人群。 4、不合理使用抗生素会导致对维生素的需要量增加。
3.维生素生产工艺研究
生产方式：微生物发酵、化学合成、天然提取，以化学合成为主，发酵为辅，少数提取。
13.2维生素C生产工艺
一、维生素C理化性质
1.维生素C，水溶性，水果蔬菜中含量丰富。在氧化还原代谢反应中起调节作用，缺乏导致坏血病
2.化学结构:己糖类食物，三元醇酮酸的内酯。 4种旋光异构体，只有 L (+)型活性最高，其他3种临 床效果很低或无活性。
3.主要生理功能
l 解毒：体内补充大量的维生素C后，可以缓解铅、汞、镉、 砷等重金属对机体的毒害作用。
l 预防癌症：Vc可以阻断致癌物N-亚硝基化合物合成。
l 清除自由基协同作用：Vc和生育酚、还原型辅酶II在体内可协同清除自由基。
4.理化性质
l 白色结晶或结晶性粉末，无臭，味酸。 熔点190-192度，同时分解。
l 强还原剂，易受光、热、氧化等破坏，形成双酮基结构的氧化型维生素C，碱性或铜等金属，分解很快。
l 易溶于水和甲醇，呈酸性反应，有旋光性。略溶于乙醇和丙酮，不溶于乙醚、氯仿、石油醚等有机溶剂。
l 溶液由无色到浅黄色-黄色-棕色，干燥结晶状态较稳定。 褐变原因：內酯环水解后，发生脱羧而形成糠醛，聚合后变色。
l 保存条件：避光、避热、干燥、无金属离子或惰性气体容器。
二、 生产工艺路线的研究
1、莱氏法化学合成工艺
双酮糖法
l D-葡萄糖为原料，经过催化氢化生成D-山梨醇， 然后生物氧化转变为L-山梨糖，酸性液中丙酮化， 对-α，β-二仲醇进行保护。
l L-山梨糖高锰酸钾在碱性溶液中氧化为二丙酮-2-酮L -古洛糖酸，除去丙酮，內酯化和烯醇化，的 L -抗坏 血酸。
l 整个合成过程必须保持第4位碳原子的构型不变。

2、两步发酵工艺

3、两条工艺的比较
l 以生物氧化取代化学氧化，工艺简洁。
l 省去了丙酮化反应和氧化反应。
l 节约丙酮、硫酸、高锰酸钾、氢氧化钠等原料试剂， 防爆设备。
l 三废和污染小，提高了生产能力。
三、两步发酵生产工艺过程
1、 D -山梨醇的化学合成
l 策略：山梨醇和葡萄糖都是6碳糖类化合物，二者差别在于C1基团。D-葡萄糖C1上醛基还原成醇基，即D-山梨醇。
l 原理与方法：催化氢化D-葡萄糖，控制压力，氢作还原剂、镍作催化剂，将醛基还原成醇基，制备 D -山梨醇。
l 工艺—催化氢化
n 配料：70-75℃；搅拌，50%葡萄糖溶液；加入活性碳，过滤，石灰乳调节pH8.4。
n 压入氢化反应器，加入Raney镍催化剂。 通入氢气，3.43×D106Pa，104 ℃。 不吸收氢气为反应终点。
n 提取：静止沉降，除去催化剂，离子交换、脱色， 减压浓缩。60-70%粘稠液体。
n 质控：比旋度，控制副反应甘露醇含量。 葡萄糖差向异构化形成甘露糖，被还原成甘露醇。
2、第一步发酵
l 原料：D-山梨醇；产物；L-山梨糖
l 策略：C-2位羟基氧化物羰基，其他基团不变，微生物转化。
l 黑醋酸杆菌， 生长30-36℃， 最适30-33 ℃
l 斜面保存，0-5 ℃冰箱。
l 种子培养，30-33 ℃振荡48h。菌形正常，无杂菌， 方可生产。
l 发酵工艺
n 种子扩大培养，接入发酵罐，种子和发酵培养基主要包括山梨醇、玉米浆、泡敌、酵母膏、碳酸钙等成分，pH5.0-5.2。
n 山梨醇浓度控制在24-27%，温度29-30℃，通气比为1:1-0.7VVM。
n 测定发酵液中山梨糖，当浓度不再增加时，结束发酵， 约10h。
n D -山梨醇转化 L -山梨糖的生物转化率达98%以上。 发酵液经低温60 ℃灭菌20min，冷却至30℃ ，作为第二步发酵的原料。
3、第二步发酵
l 策略： L -山梨糖到2-酮基L -古龙酸需要将C1位醇基氧化为羧基，保持其他基团不发生变化。
l 许多微生物能使 L -山梨糖转化为2-酮基L -古龙酸
l 1）菌种特点
n 活力最强：醋酸杆菌、葡萄糖酸杆菌和芽孢杆菌。 工业生产中，采用氧化葡萄糖酸杆菌（俗称小菌） 和巨大芽孢杆菌（俗称大菌）搭配使用两种混合菌培养，产物收率达最高水平。 单独使用一种菌，一般产量很低。
n 葡萄糖酸杆菌：革兰氏阴性，生鞭毛或不具鞭毛， pH4.5时生产。最适生产温度30-35 ℃ （弱氧化葡萄糖酸杆菌）或18-21 ℃ （氧化葡萄糖酸杆菌）
l 2）可能的机理（看不懂）
n 葡萄糖酸杆菌为产酸菌：L-山梨糖转化为L-艾杜糖（把C1位羟基氧化为醛基和羧基，艾杜酸）
n 巨大芽孢杆菌为搭配菌：转化为2-酮基L -古龙酸 （把C2位羟基氧化为酮基）

l 3）发酵工艺
n 种子和发酵培养基的成分类似，主要由 L -山梨糖、玉米浆、尿素、碳酸钙、磷酸二氢钾等，pH值为7.0。
n 大、小菌经二级种子扩大培养，接入含有第一步发酵液的发酵罐中，20-30℃下通入无菌空气。
n 培养72h左右，温度略高（31-33 ℃ ）、pH在7.2 左右、残糖量0.5-0.8%以下，即为发酵终点。
n 由 L -山梨糖生成2-酮基L -古龙酸转化率达70-85%。
l 4）过程控制
n 发酵罐在100m3以上，瘦长型的气升式反应器，无机械搅拌。
n 发酵前期：菌体生长期，供氧充足，高溶解氧状态，促进生长，缩短前期。
n 发酵中期：主要产酸期，产酸率和耗糖率为常数， 溶解氧浓度应该控制在适宜的范围内（20%）。
n 发酵后期：菌体活力下降，生产能力减慢，根据产酸浓度和残糖及时结束发酵。
n 滴加碱液调pH值，使保持7.0左右。
n 发酵关键：保持一定数量氧化葡萄糖酸杆菌。
n 策略：根据芽孢（芽胞：细菌的休眠体）的形成时间来控制发酵。
n 芽孢杆菌开始形成芽孢时：产酸菌株开始产生2-酮基L -古龙酸，直到完全形成芽孢后和出现游离芽孢时，产酸达高峰。
n 方法：显微镜检查。游离芽胞及残存芽孢杆菌菌体已逐步自溶成碎片，已无法区分两种细菌细胞的差别，整个产酸反应就结束了。
l 5） 2-酮基L -古龙酸的分离纯化
l 2-酮基L -古龙酸含量8%左右，残留菌丝体、蛋白质和悬浮的固体颗粒等杂质。
l 发酵液预处理：静置沉降，菌体蛋白质沉淀。
l 上清液一次阳离子交换，控制流出液的pH值：收集流出液和洗脱液，调节pH至等电点，加热70℃，加入活性碳，升温90-95 ℃维持10-15min，速冷，过滤。
l 二次阳离子交换：控制流出液pH1.5-1.7,酸化为2-酮基-L -古龙酸
l 在45℃下减压浓缩，冷却结晶，离心分离，冰乙醇洗涤，得到2-酮基-L古龙酸，提取率80%以上。

四、维生素C的制备
1.原理： 2-酮基L -古龙酸C4位内酯化、C2位烯醇化得到维生素C。
2.策略：酸或碱催化剂作用下实现。

1）酸转化工艺（被淘汰）
设备简单，流程短，但维生素C破坏严重，质量差。设备腐蚀严重，三废问题没有解决。
2）碱转化：目前的生产方法

l 甲酯化：在无水甲醇中用浓硫酸催化生成2-酮基L 古龙酸甲酯。
l 内酯化成盐：加NaHCO3转化生成维生素C钠盐，离心分离。
l 酸化脱色：经氢型离子交换树脂酸化。
l 在50-55℃下减压烘干，得到粗品维生素C.
l 碱转化工艺流程较长，投资较大，设备腐蚀少， 质量较好。
3） 维生素C的精制

第十四章 基因工程制药工艺
基因工程菌：
以微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因，或过量表达或抑制自身基因的工程生物体。
种类：
基因工程大肠杆菌和酵母：重组蛋白质药物；
基因工程技术改造出发菌：氨基酸、抗生素、载体激素、中间体生产。
14.1 基因工程制药微生物表达系统
14.1.1 大肠杆菌表达系统
1、大肠杆菌（Eschericlia coli）形态特征
细胞：G－，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般无荚膜。裂殖。
菌落:白色至黄白色，光滑，直径2－3mm。
2、生化与遗传特性
能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无机盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。
基因工程中使用菌株：K－12株的衍生菌株。基因组：4.6 Mb，3000多种蛋白质。染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒。
3、产物表达形式
不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体
可溶性蛋白质：存在于细胞质
周质表达: 外源蛋白被运输分泌到周质，可溶性。
胞外表达：胞内可溶性蛋白质分泌到培养液中。
4、优点和不足
发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。
遗传背景清楚、目标基因表达水平高（达70％），培养周期短，抗污染能力强。
不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白表达。
细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内毒素，具有抗原性，产生热源。
N端增加的蛋氨酸容易引起免疫反应。
14.1.2 酵母表达系统
1、形态特征
细胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。
繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。
菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。
2、生长与遗传特征
两个性别不同的单倍体细胞结合形成二倍体接合子。能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生长繁殖迅速，倍增期约2h。酿酒酵母有17条染色体。1996年完成其全基因组测序，遗传背景相对清楚。
3、优点与不足
载体安全、无毒。营养缺陷选择外来质粒。培养条件简单、大规模培养技术成熟。
亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工，并具有良好的蛋白质分泌能力。
缺点：酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵。修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用。

14.2 基因工程大肠杆菌的构建技术

14.2.1 构建流程

14.2.2 目标基因的克隆策略
一、概述
❖目标基因：是编码蛋白质或多肽的DNA序列。
❖正确克隆的重要性: 只要有一个碱基发生（错义、无义、移码）突变，就导致编码氨基酸的变化，影响产物蛋白质的功能和生物学活性。只要一个碱基发生同义突变，就可能导致生产过程和效率变化。
❖核酸的一级化学结构：有头——5’磷酸端，有尾——3’羟基，骨架——戊糖，连接的键——磷酸二酯键
❖基因克隆方法的选择
方法
优点
缺点
PCR扩增
简单快速高效，数kb单基因克隆
DNA聚合酶活性和保真性限制
文库筛选
长片段，无碱基错误，未知序列基因克隆
繁琐，过程复杂，耗时，昂贵
化学合成
简便准确，已知序列，引物合成
受合成仪性能限制，长度很短
❖RT-PCR克隆目标基因流程
反转录:起始材料RNA
PCR ：起始材料DNA

❖反转录反应的操作
Ø 样品变性：75℃水浴5 min，冰冷，引物与mRNA配对。
Ø 反转录：反转录酶42℃或37℃，cDNA第1链，1 h。
Ø 终止反应：使反转录酶失活，95℃加热5 min。
Ø 反转录酶：RNA依赖的DNA聚合酶，以RNA为模板， dNTP为底物，以DNA为引物，合成与RNA互补的 DNA。
Ø AMV：在42℃下反应，合成片段较短； MMLV：在37℃下反应，合成片段较长。
Ø 注意事项：工作环境洁净度，防止RNase的污染。 所用水及相关试剂必须用DEPC处理，除去RNase。
二、PCR扩增
（1）PCR技术
PCR (Polymerase chain reaction, PCR)： 聚合酶链式反应：在引物指导下，以DNA为模板，由DNA聚合酶催化的扩增特定DNA序列聚合延伸形成互补序列的反应。
本质：生物体的DNA复制原理在体外合成基因。
发明者：Mullis，生物技术革命性象征，1993年 获得诺贝尔化学奖。
（2） PCR单反应原理与过程

（3）PCR扩增的反应体系组成

三、酶切反应
l 概念：在特异位点上催化双链DNA分子的断裂， 产生相应的限制性片段。
l 酶切反应操作：
Ø 酶切体系组成：DNA，缓冲液，限制性内切酶。
Ø 反应条件：适宜温度(37℃)，1小时以上。
Ø 终止反应：加热；加入EDTA，螯合镁离子。
Ø 电泳检查：酶切完全性。
四、 连接反应
l 概念： DNA 双链上相邻的 3′羟基和 5′磷酸基因共价结合形成3′-5′磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来。
l 连接反应操作
Ø 连接体系：载体片段与基因片段，缓冲液，连接酶。
Ø 连接反应：16℃-26℃，数小时,或过夜。
Ø 终止反应：在70℃加热10分钟。
五、 转化
l 转化：把外源基因导入宿主细胞的过程。
l 大肠杆菌转化——CaCl2法
感受态细胞制备:E·coli经CaCl2处理（0-5℃），使细胞膜通透性增加，从而具有社区外援DNA的能力。
Ø 感受态细胞融化：置冰上，缓慢。
Ø 加入连接反应产物：混匀，置冰上30分钟。
Ø 热击：42℃，90秒。
Ø 置冰上，1－2分钟。
Ø 扩增培养：加入LB培养基，37℃，45分钟。
Ø 涂平板：含有抗生素的LB固体培养基上。
Ø 筛选培养：倒置平板，37℃，出现菌落。
六、 筛选与鉴定（转化后的细胞类型 ）
Ø 非转化子：没有导入外源DNA的非转化宿主细胞
Ø 转化子：导入外源DNA的转化细胞
Ø 非重组子：仅含有空载体分子的转化子
Ø 重组子：含有重组DNA分子的转化子
Ø 目标重组子：含有连接正确的重组子（目的）
Ø 非目标重组子：连接不正确的重组子。
（自己补充：
原理：利用载体DNA分子所携带的选择性遗传标记基因筛选重组子。标记基因所对应的遗传表型与受体细胞是互补的，因此在培养基中施加合适的选择压力，可保证重组子显现，非重组子不现）
（1） 筛选策略及方法
n 抗生素筛选法：基于载体的抗生