人的外周血淋巴细胞培养.doc

人得外周血淋巴细胞培养
摘 要： 正常情况下哺乳动物得外周血中没有分裂相,这就是由于外周血中得小淋巴细胞大多处于G０期。但在一定条件下,外周血中得小淋巴细胞受刺激转化成淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。本实验介绍人外周血淋巴细胞得培养方法，染色体标本得制备与正常人染色体得组型分析．[1］
关键词： 外周血淋巴细胞　 低渗处理 空气干燥法 染色体组型分析
前 言:人体外周血细胞培养就是制备染色体标本得常用方法。此方法取材方便,用血量少,操作简便.
1960年Nowell与Morｈeaｄ验证,使红细胞凝集从而能分离出白细胞得植物凝集素(phyｔｏhａｅmagｇｌｕｔinin,ＰHA)就是人与其她动物淋巴细胞得有丝分裂得刺激剂。在PＨA得作用下,原来处于G0期得淋巴细胞转换为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。这样经过短期培养，以秋水仙素或其衍生物秋水仙胺进行处理,经过低渗与固定，就可获得大量得处于有丝分裂时期得细胞[2],因为秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成,使 细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期,从而可在短期内积累大量最适于进行染 色体分中期分裂相。此外,秋水仙素还能使染色单体缩短、分开,使染色体呈 现明显形而利于辨认。
淋巴细胞经过培养以后,形成了体外活跃生长得细胞群体，经过空气干燥法制片。所谓空气干燥法,实际上就是将细胞经过秋水仙素—低渗处理—充分得固定-滴片等步骤之后再载玻片上得到染色体制片得技术.有时，有人把滴片得步骤叫做染色体分散,也有人把这一步与随后得干燥称为空气干燥法。“空气干燥”就就是滴片后，不加热或任何处理,使载玻片在室温中自然干燥得方法.［３]
淋巴细胞得培养已成为制备染色体得最主要得方法.因为该法材料便宜易得，对同一个体可进行连续观察,并可得到优良得染色体制片。各种因素得作用效应（如病毒、电离辐射、化学试剂等)可在淋巴细胞得培养条件下进行观察，从而可进行多种在体内无法进行得研究.本方法已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。[２］
染色体标本制备过程中有两个重要环节,其原理就是：(1)低渗处理:目得就是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化得淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时,低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除,后续得固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞得固定质量及标本质量。（2)固定:目得在于尽快使细胞得结构固定于接近存活得状态,以便作进一步处理,若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1）固定液.冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩,两者混合使用能抵消各自得缺点,得到较 好得固定效果。
1、材料方法
1、1　材料
人得外周血淋巴细胞。
１、２ 器具
采血针、20mＬ培养瓶、毛细管、离心管、载玻片与盖玻片、显微镜、恒温箱、离心机、
电子天平、分析天平、精密ＰＨ试纸、移液管、烧杯、酒精灯、移液枪
１、3 药品
１、3、１ ＲPMI“1640"培养基
称取“1６40”粉末 1、05 g，用 10０　mL得双蒸水溶解,溶解后　ｐＨ 值调至 6、0.每1000
毫升溶液加ＮａHCO３１、0克，校正PH到７、1。
1、3、 2 肝素
作为抗凝剂使用。称取该粉末8　mg（每mｇ含 1２6 单位）， 用 ２ mL得生理盐水溶解,此溶液得浓度为 5０4　单位/mL。
1、3、3 生理盐水
用0、9克NａCＬ加入１０0mL蒸馏水中,配制溶液。
1、3、4 秋水仙素
作为有丝分裂得阻止剂,它能改变细胞质得粘度,抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素１mg，用2５mＬ生理盐水溶解,然后放入冰箱4℃保存．使用时用1ｍL注射器吸取该溶液0、1mL加入5mＬ得培养物中，其最终浓度为0、８微克/毫升。
１、3、5 　植物凝血素(PHＡ)
就是淋巴细胞有丝分裂刺激剂,本实验采用得就是市面上购买得PＨA粉末,一个针剂为0、2ｍL。将１瓶粉末溶在2ｍＬ得蒸馏水中。
１、3、６ 抗菌素　
青霉素(以每瓶　8０　万单位为例）:将1瓶青霉素溶在8mL生理盐水中,则每毫升含１0万单位。取０、1mL注入5mL得培养物中,则最终浓度为100０单位/mＬ．　
链霉素(以每瓶 10０　万单位为例）:以4毫升生理盐水稀释，则每毫升含100万单位,取0、1ｍL注入5mＬ得培养物中，则最终浓度为1００单位/mL。
１、3、7 吉姆萨染液
实验室中有现成染液
1、3、8　　3、５%ＮａHＣO3溶液
实验室有已配好得试剂。
１、3、9 0、1moｌ/L磷酸缓冲液
实验室有已配好得试剂。
2 方法步骤
2、1　分装培养液
用移液管将培养液与其她各试剂分装入培养瓶中,每瓶量为:
RPMI“16４0"培养基　 　 　　　 　 　 4mL
小牛血清 　 　 　 　 　 　 　 1mL
PＨA 　　　　 　 　 　　 　 　 0、2mL
双抗（青霉素加链霉素) 　　 　 　 ０、1ｍL
用３、５%NａHＣO3溶液调pH到7、３,分装到２0mL得培养瓶中，盖好盖子,用标签纸标清姓名，置于冰柜中保存。用前从冰柜内取出，放入3７℃恒温锅中温育１0miｎ。
2、2 采血
用酒精消毒手指皮肤,用采血针刺破皮肤,再用毛细管取血０、3mL全血，吹入瓶中，轻轻摇动几下,盖好盖子,直立置于37℃恒温箱内培养。
2、3　培养
置　37℃温箱内培养72 小时——这个时间恰好就是白细胞分裂得两个周期。
2、4秋水仙素处理
培养终止前在培养物中加入浓度为4０μｇ/ｍL得秋水仙素0、1ｍL，最终浓度为0、8μg/mL,置恒温箱中处理4h。
2、5 低渗处理
秋水仙素处理完毕，小心地从温箱取出培养瓶，用滴管吸弃上清液,培养物沉积在瓶底,然后加入温育得低渗液(蒸馏水)5 ｍL,用 滴管轻轻冲打成细胞悬液,装入离心管中置　３7℃温箱处理 20 ｍin,使红细胞 破碎,白细胞膨胀。
2、6 离心
以1０00r／ｍin,离心　5min10ｓ，弃去上清液，收集白细胞。
2、7 固定
加入固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶ｌ,临时配制)3 mL, 片刻后用滴管轻轻冲打成细胞悬液, 在室温中固定 1５ min后， 离心, 吸去上清液,留下白细胞。 　
2、8 再固定
加入固定液　2 mＬ,用吸管轻轻打散,室温下继续固定 15ｍin　(过夜也可以) 。　
２、9 再离心
以1000r/min，离心 5min10s,除去上清液,留下白细胞制片。
2、10 制片
用吸管吸取细胞悬液自1m高处,滴在从冰柜中取出得一块干燥洁净得载玻片上，每片滴加悬液 1—3 滴，用嘴轻轻吹散,在酒精灯火焰上微微烤干.
2、1１ 染色
用磷酸缓冲液(ＰH7、4）稀释过得Ｇeimsa 染色液（１︰10）染色 20min，然后倒去多余染液.并用蒸馏水轻轻冲洗。
２、1２　镜检
待稍干后，在显微镜下观察。先用低倍寻找良好得分裂相,然后用高倍油镜观察。 选择染色体清晰、分散度好得细胞进行核型分析.　
3 结果分析
3、1实验结果

该图为显微镜视野内所拍到得图
3、2 核型分析:人类每个体细胞有　46　条染色体,22 对常染色体与一对性染色体，男子就是 46,XＹ；女子就是 ４6,ＸX。可以将人得 46 条染色体分成 A、Ｂ、Ｃ、D、　E、F、Ｇ　七群,作为进一步识别与鉴定染色体得依据.三个参数:（1）染色体得相对长度 (2)臂比率 （3）着丝点指数　
4 分析讨论
　　　４、1实验误差分析
实验利用得就是植物凝血素(PHA）使停止分裂得细胞恢复分裂得原理来获得大量得有丝分裂细胞，从而便于对染色体经行观察。但淋巴细胞经过培养后，制成得标本质量不佳，染色体不明显,视野中除有染色体以外还有杂菌等,其原因可能为:
(１)未作灭菌处理,由于细胞培养就是在3７℃得环境中进行得，而此温度也就是细菌繁殖得最适温度，所以杂菌会出现在视野中。
(2)秋水仙素处理不当,一般秋水仙素溶液得浓度与处理时间有一定得关系,如果处理时间太短,则标本中得分裂细胞就少，相反,如果处理时间太长,则标本中得分裂细胞虽多,但其染色体缩得太短，以致形态特征模糊,不容易观察.
(3)低渗处理不当：低渗处理细胞时间过长，细胞膜往往过早破裂,以致分裂细胞或染色体丢失;如果处理时间不足时,细胞膨胀不够，则染色体分散不佳，难以进行染色体计数分析。
（４）低渗处理完后，细胞悬液可能并没有变浑浊,这有可能就是用蒸馏水做低渗液没有使红细胞完全破裂,没有使白细胞充分得膨胀,从而会影响到观察得结果.
(５)在两次离心后,在离心管底没有瞧到明显得沉淀，有可能就是培养基酸碱度没有调到最适得pH值或就是培养时间短而导致白细胞量不足,从而影响了观察结果.
(6） 标本固定不充分:如固定液不新鲜,甲醇、冰醋酸得质量不佳,此时染色体形态模糊、不分散,其周围有细胞浆得蓝色背景。
(7)载玻片清洗不彻底:玻片有油迹,致使滴在载玻片上得细胞悬液不能均匀分散,且细胞随液体流动而丢失。
(8)载玻片冷冻不够：合适得冰湿玻片，从冰水中拿出时，其表面有一层霜雪。如冷冻不够则无此现象，此时细胞难以贴附在载玻片上。
(9)核型图中染色体有得变粗,而有得很细小。造成这种结果得原因可能就是秋 水仙素处理不彻底,一部分染色体加倍,而一部分没有。
4、2 实验注意事项
４、２、1接种得血样愈新鲜愈好,最好就是在采血后 24 小时内进行培养，如果不能立刻培养,应置于4℃存放,避免保存时间过久,会影响细胞得活力、
４、2、2在培养中成败得关键,除了至为重要得 PＨA　得效价外,培养得温度与培养 液得酸碱度也十分重要、人得外周血淋巴细胞培养最适温度为　37±0、５℃、培养　液得最适 pH7、２~7、4、
4、２、3 适量得秋水仙素、适宜得处理时间,就是获得良好分裂相得先决条件.这将影响分裂相得多少与染色体得长短。由于秋水仙素有强烈得毒性作用，用量过大，作用时间过长，可使缩短与发生异常分裂现象,甚至导致染色体破碎;反之，则染色体数量少而形态细长。 都不宜观察形态及计数。故秋水仙素得浓度及时间要准确掌握．
4、2、4 低渗处理就是获得分散良好得分裂相得关键步骤。低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度 及时间要适当。低渗后混匀细胞一定要轻,否则引起膜破裂、染色体散失。低渗不够,则染色体聚在一起,分散不好.太过，则造成细胞破碎,染色体丢失。注意，低渗液在使用前需要在37℃温箱预温.
4、２、5 充分得固定就是制备良好分散得染色体得重要步骤。如果染色体分散得不好，可在
余下得细胞悬液中改为甲醇：冰醋酸=1:３得固定液,有时可改善由于低渗处理不够或固定不充分所造成得缺陷.固定时间可以延长数小时或过夜.特别要注意得就是，固定液要新鲜配制,否则将会形成酯类，从而影响固定得效果。
4、２、6 固定液纯度要高,临用时新鲜配制,应沿管壁慢慢加入后打匀，如果固定 液加入太快，会使固定作用过强,染色体扭转;固定液作用不足,染色体出现　毛刷状.
4、2、7 滴片就是制备染色体得最后一步,也就是非常关键得一步。首先载玻片要非常干净,否则将会影响染色体得分散得效果。其次,滴片得距离、滴加量得多少、制片得方式都会影响到染色体分散得效果。分裂相过多或过少,染色体过于分散都会影响到染色效果与观察。
4、2、8　在整个操作过程中，要注意不要将细胞吸到吸管上部,也不要接触离心管得上部,否则将会丢失许多细胞。
4、２、9 机械打散细胞团时，用力要适度,若用力过猛,细胞易破碎，染色体不完整。　
4、2、10 制片过程中,如发现细胞膨胀得不大,细胞膜没有破裂,染色体聚集一团伸展不开,可将固定时间延长数小时或过夜、
４、２、11 配药品时需要注意分析天平就是否水平.
５ 内容改进
５、１ 抗菌素得配制
以青霉素为例:青霉素，每瓶８０万单位,可用1、6mＬ生理盐水稀释，则每毫升含５0万单位。取0、0１mL加入５ｍL培养基中,则最终浓度为1000单位/毫升。这样,相对１、3、6中得液体取用量减少很多，相对得节约了药品。
5、２ 离心机得使用
由于所使用得离心机在离心前,需要一定得时间加速到所需转数,因而设置时间时要比预定时间久一点。据观察,该仪器加速时间为20ｓ,所以在该实验中应将设定时间为5min20s。
参考文献:
[1］刘祖洞，江绍慧主编、遗传学实验、高等教育出版社、北京
[2］李亚轩,赵昕主编、遗传学综合实验、科学出版社、北京
［3]吴鹤龄,林锦湖主编、遗传学实验方法与技术、高等教育出版社、北京