微生物学检验第3版2012不动杆菌与脑脊液.pptx

1脑脊液标本的微生物检查脑脊液标本的微生物检查及不动杆菌的培养鉴定及不动杆菌的培养鉴定不动杆菌不动杆菌v革兰阴性球杆菌，单个或成双排列，有时呈革兰阴性球杆菌，单个或成双排列，有时呈丝状或链状；无芽孢、无荚膜，无鞭毛。丝状或链状；无芽孢、无荚膜，无鞭毛。v不动杆菌属的细菌进行革兰染色时不易脱色，不动杆菌属的细菌进行革兰染色时不易脱色，有时易染成革兰阳性，误认为是革兰阳性球有时易染成革兰阳性，误认为是革兰阳性球菌，应注意鉴别。菌，应注意鉴别。3 3v氧化酶氧化酶:-:-vO/FO/F：O Ov硝酸盐还原硝酸盐还原:-:-v KIA:K/K KIA:K/Kv 动力：动力：-v 枸櫞酸盐利用枸櫞酸盐利用:+:+v注意与形态相似的奈瑟菌鉴别；注意注意与形态相似的奈瑟菌鉴别；注意与不分解糖的产碱杆菌鉴别与不分解糖的产碱杆菌鉴别5 5目的要求目的要求v1.1.掌握脑脊液标本的细菌学检验和报告方掌握脑脊液标本的细菌学检验和报告方法。法。v2.2.掌握不动杆菌的培养特征、主要微生物掌握不动杆菌的培养特征、主要微生物特性及鉴定方法。特性及鉴定方法。6 6器材和试剂器材和试剂v 1 1、标本：脑脊液标本、标本：脑脊液标本v 2 2、菌种：不动杆菌、菌种：不动杆菌v 3 3、培养基：血平板、中国蓝平板、巧克、培养基：血平板、中国蓝平板、巧克力平板、克氏双糖斜面培养基、半固体培力平板、克氏双糖斜面培养基、半固体培养基、非发酵菌微量生化管。养基、非发酵菌微量生化管。7 7v 4 4、试剂：氧化酶纸片、试剂：氧化酶纸片、3%3%过氧化氢、革过氧化氢、革兰染色液、无菌生理盐水及生化管配套试兰染色液、无菌生理盐水及生化管配套试剂剂 v 5 5、其它、其它 ：显微镜、培养箱、小试管、载：显微镜、培养箱、小试管、载玻片、接种针、接种环、酒精灯、火柴、玻片、接种针、接种环、酒精灯、火柴、非发酵菌生化编码表等。非发酵菌生化编码表等。器材和试剂器材和试剂8 8由临床医师以无菌方法采集脑脊液由临床医师以无菌方法采集脑脊液1-3ml1-3ml，置于无菌试管中立即送检。置于无菌试管中立即送检。标本的采集标本的采集9 9脑脊液标本脑脊液标本离心沉淀离心沉淀革蓝染色革蓝染色显微镜观察显微镜观察初步报告初步报告抗酸染色抗酸染色墨汁染色墨汁染色血平板血平板巧克力平板巧克力平板罗氏培养罗氏培养沙保弱培养沙保弱培养菌落、形态、生化菌落、形态、生化血清学鉴定血清学鉴定药敏试验药敏试验最终报告最终报告检验程序检验程序1010 1 1、涂片检查涂片检查：将脑脊液：将脑脊液3000r3000rminmin离心离心10-15min10-15min，取沉淀涂片。取沉淀涂片。1)1)革兰染色镜检革兰染色镜检：如查见革兰阴性、凹面相对的双球菌，：如查见革兰阴性、凹面相对的双球菌，分布在细胞内或外时，可报告分布在细胞内或外时，可报告“找到革兰阴性双球菌，位于找到革兰阴性双球菌，位于细胞内细胞内(外外)，形似脑膜炎奈瑟菌，形似脑膜炎奈瑟菌”；如查见革兰阳性、矛头；如查见革兰阳性、矛头状的双球菌，有明显的荚膜存在，可报告状的双球菌，有明显的荚膜存在，可报告“找到革兰阳性双找到革兰阳性双球菌，形似肺炎链球菌球菌，形似肺炎链球菌”。进一步用肺炎链球菌全价血清做。进一步用肺炎链球菌全价血清做荚膜肿胀试验，阳性者报告荚膜肿胀试验，阳性者报告“荚膜肿胀试验检出肺炎链球菌荚膜肿胀试验检出肺炎链球菌”。如查见其他革兰阳性、阴性细菌，则根据细菌形态和染。如查见其他革兰阳性、阴性细菌，则根据细菌形态和染色性，报告色性，报告“找到革兰找到革兰性性菌菌”。脑脊液标本检验操作流程脑脊液标本检验操作流程及报告方式及报告方式 1111 2)2)墨汁染色墨汁染色：用墨汁负染，在黑暗的背景中见到：用墨汁负染，在黑暗的背景中见到折光性很强的菌体及周围透明的宽大荚膜，有时可折光性很强的菌体及周围透明的宽大荚膜，有时可见到长出的单芽，可报告见到长出的单芽，可报告“墨汁负染找到宽厚荚膜墨汁负染找到宽厚荚膜的单芽细胞，形似新型隐球菌的单芽细胞，形似新型隐球菌”。也可用。也可用O.1O.1甲苯甲苯胺蓝染色法，新型隐球菌菌体呈红色，荚膜不着色，胺蓝染色法，新型隐球菌菌体呈红色，荚膜不着色，白细胞深蓝色，红细胞不着色。白细胞深蓝色，红细胞不着色。3)3)抗酸染色抗酸染色：取沉淀做小而集中的涂片，用抗酸：取沉淀做小而集中的涂片，用抗酸染色后镜检，发现有红色的抗酸杆菌，可报告染色后镜检，发现有红色的抗酸杆菌，可报告“找找到抗酸杆菌到抗酸杆菌”。脑脊液标本检验操作流程脑脊液标本检验操作流程及报告方式及报告方式 1212 2 2、培养、培养普通培养普通培养：将脑脊液直接或经离心沉淀后，接种：将脑脊液直接或经离心沉淀后，接种在血平板和巧克力平板上，分别放置在普通培养箱在血平板和巧克力平板上，分别放置在普通培养箱和和5 5-10-10COCO2 2培养箱中，培养箱中，3535孵育孵育18-24h18-24h。观察。观察菌落形态，涂片染色观察。菌落形态，涂片染色观察。如为中等大小、半透明、灰蓝色、湿润的菌落，如为中等大小、半透明、灰蓝色、湿润的菌落，革兰阴性双球菌，氧化酶和触酶均阳性，只分解葡革兰阴性双球菌，氧化酶和触酶均阳性，只分解葡萄糖和麦芽糖，可报告萄糖和麦芽糖，可报告“检出脑膜炎奈瑟菌检出脑膜炎奈瑟菌”。就。就可参照可参照 “奈瑟菌属奈瑟菌属”的鉴定。的鉴定。脑脊液标本检验操作流程脑脊液标本检验操作流程及报告方式及报告方式 1313 如在血平板上有草绿色溶血、扁平的小菌落生长，如在血平板上有草绿色溶血、扁平的小菌落生长，革兰阳性双球菌，触酶阴性，参照革兰阳性双球菌，触酶阴性，参照 “链球菌属链球菌属”进进行鉴定。行鉴定。如果怀疑新型隐球菌感染或直接涂片发现有新如果怀疑新型隐球菌感染或直接涂片发现有新型隐球菌，则接种沙保弱琼脂或血琼脂平板分别于型隐球菌，则接种沙保弱琼脂或血琼脂平板分别于2525及及3535培养，一般培养，一般2-32-3天长出白色或淡褐色菌落。天长出白色或淡褐色菌落。非致病性菌落非致病性菌落3535不生长。根据菌落形态、涂片染不生长。根据菌落形态、涂片染色、荚膜和生化反应等进行鉴定。参照色、荚膜和生化反应等进行鉴定。参照 “隐球菌属隐球菌属”。如为其他形态的菌落和细菌，则参照相关均属如为其他形态的菌落和细菌，则参照相关均属进行鉴定。进行鉴定。如经如经3 3天的培养未见细菌生长，可报告天的培养未见细菌生长，可报告“经经3 3天天培养无细菌生长培养无细菌生长”。脑脊液标本检验操作流程脑脊液标本检验操作流程及报告方式及报告方式 1414革兰阳性细菌革兰阳性细菌革兰阴性细菌革兰阴性细菌球菌球菌 金黄色葡萄球菌、化脓性金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、链球菌、B B群链球菌、肺群链球菌、肺炎链球菌、消化链球菌炎链球菌、消化链球菌 脑膜炎奈瑟菌、卡他脑膜炎奈瑟菌、卡他布兰汉菌布兰汉菌 杆菌杆菌 结核分枝杆菌、产单核李结核分枝杆菌、产单核李斯特菌斯特菌 流感嗜血杆菌、大肠流感嗜血杆菌、大肠埃希菌、产气肠杆菌、埃希菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯菌、变形肺炎克雷伯菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌、杆菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌不动杆菌、脑膜炎败、脑膜炎败血黄杆菌、类杆菌血黄杆菌、类杆菌 其它其它 新型隐球菌、白色念珠菌新型隐球菌、白色念珠菌 钩端螺旋体钩端螺旋体 脑脊液标本常见的分离菌脑脊液标本常见的分离菌1515注意事项注意事项v 1 1、标本采集应在抗菌药物使用前采取。、标本采集应在抗菌药物使用前采取。v 2 2、引起脑膜炎的细菌都比较娇嫩，容易、引起脑膜炎的细菌都比较娇嫩，容易死亡或自溶，因此应立即送检并尽快处理，死亡或自溶，因此应立即送检并尽快处理，最好床边接种。最好床边接种。流行性脑脊髓膜炎是法定传染病，从脑脊流行性脑脊髓膜炎是法定传染病，从脑脊液中分离并鉴定出脑膜炎奈瑟菌，应按规定液中分离并鉴定出脑膜炎奈瑟菌，应按规定报告法定部门。从脑脊液中分离到的流感嗜报告法定部门。从脑脊液中分离到的流感嗜血杆菌以血杆菌以B B型菌为多，能产生型菌为多，能产生TEMTEM型型-内酰胺内酰胺酶，对青霉素耐药，纸片法测定常不正确，酶，对青霉素耐药，纸片法测定常不正确，需单独测定需单独测定-内酰胺酶。内酰胺酶。1616v 3 3、脑膜炎奈瑟菌对外界环境抵抗力差，、脑膜炎奈瑟菌对外界环境抵抗力差，特别对寒冷和干燥敏感，因此要注意将标本特别对寒冷和干燥敏感，因此要注意将标本在在25-3725-37保温，不可放置冰箱冷藏或低温保温，不可放置冰箱冷藏或低温保存。防止标本干燥和避免日光直接照射。保存。防止标本干燥和避免日光直接照射。注意事项注意事项1717v一、脑脊液标本一、脑脊液标本 分区画线接种到分区画线接种到血平板、巧克力平板、中国蓝平板血平板、巧克力平板、中国蓝平板v二、提供的菌落二、提供的菌落v1 1、进行涂片、进行涂片G G染色观察细菌形态；染色观察细菌形态；v2 2、触酶试验、氧化酶试验；、触酶试验、氧化酶试验；v3 3、接种于半固体、克式双糖培养基；、接种于半固体、克式双糖培养基；v4 4、接种到各种非发酵菌生化鉴定培养基中；、接种到各种非发酵菌生化鉴定培养基中；v三、放入三、放入3535恒温培养箱进行培养恒温培养箱进行培养具体实验操作具体实验操作第一天的主要操作：第一天的主要操作：1818非发酵细菌生化鉴定编码表非发酵细菌生化鉴定编码表O-FO-F试验试验4 43 32 21 1氧氧化化酶酶拘拘橼橼酸酸盐盐麦麦芽芽糖糖精精氨氨酸酸酶酶精精对对 甘甘露露醇醇木木糖糖硝硝酸酸盐盐还还原原D DN NA A 酶酶乙乙酰酰氨氨酶酶厌氧厌氧需氧需氧淡绿淡绿黄色黄色无色无色 淡绿淡绿淡绿淡绿黄色黄色紫色紫色红色红色黄色黄色蓝色蓝色黄黄色色淡淡绿绿淡淡绿绿黄黄色色黄黄色色黄黄色色无无色色红红色色绿绿色色灰灰白白黄黄色色红红色色原来原来颜色颜色阳性阳性颜色颜色淡绿淡绿黄色黄色标记为红色的加石腊油标记为红色的加石腊油1919v1.1.取出标本分离培养的血平板、巧克力平取出标本分离培养的血平板、巧克力平板、中国蓝平板观察平板上的菌落形态、板、中国蓝平板观察平板上的菌落形态、颜色颜色具体实验操作具体实验操作第二天的主要操作：第二天的主要操作：2020v2.2.观察半固体培养基观察半固体培养基具体实验操作具体实验操作第二天的主要操作：第二天的主要操作：2121v3.3.观察观察克式双糖培养基克式双糖培养基具体实验操作具体实验操作第二天的主要操作：第二天的主要操作：2222v4.4.观察生化反应，查表鉴定观察生化反应，查表鉴定具体实验操作具体实验操作第二天的主要操作：第二天的主要操作：2323非发酵细菌生化鉴定编码表非发酵细菌生化鉴定编码表O-FO-F试验试验4 43 32 21 1氧氧化化酶酶拘拘橼橼酸酸盐盐麦麦芽芽糖糖精精氨氨酸酸酶酶精精对对 甘甘露露醇醇木木糖糖硝硝酸酸盐盐还还原原D DN NA A 酶酶乙乙酰酰氨氨酶酶厌氧厌氧需氧需氧淡绿淡绿黄色黄色无色无色 淡绿淡绿淡绿淡绿黄色黄色紫色紫色红色红色黄色黄色蓝色蓝色黄黄色色淡淡绿绿淡淡绿绿黄黄色色黄黄色色黄黄色色无无色色红红色色绿绿色色灰灰白白黄黄色色红红色色原来原来颜色颜色阳性阳性颜色颜色淡绿淡绿黄色黄色标记为红色的加石腊油标记为红色的加石腊油