胞浆蛋白核蛋白膜蛋白抽提试剂盒(真核细胞).docx

胞浆蛋白/核蛋白/膜蛋白抽提试剂盒(真核细胞)
(Catalog #DBI-1021 ; DBI-1022; Store kit at 4℃)
描述:
本试剂盒提供了蛋白抽提试剂A，蛋白抽提抽提试剂B，蛋白抽提试剂C
三种具有独特组分的缓冲液。所有试剂采用PIPES缓冲系统。通过实验，
可以得到：
细胞胞浆蛋白（其中含有含有可溶性的骨架蛋白）；
细胞膜蛋白（其中包含细胞质膜蛋白和细胞器膜蛋白）；
细胞核蛋白；
其最后剩余的沉淀为难溶性的胞质骨架和纤维蛋白。
提取方法简单，可靠，快速。获得的各种部分蛋白纯度高，可用于PAGE
电泳、Western Blot、免疫共沉淀、EMSA等后续研究。该试剂盒所得到
的蛋白溶液适合用Bradeford法（DBI生物产品：DBI-1045,1046）蛋白定
量和BCA方法（DBI生物产品：DBI-1047,1048）进行定量。
II 试剂盒组分:
III.蛋白质抽提步骤:
A. 注意事项和试剂准备:
• 打开试剂盒后，于4度保存蛋白抽提液；于-20度保存蛋白酶抑制剂，
样品缓冲液（6×）。
• 使用前, 加10ul的蛋白酶抑制剂于1ml蛋白抽提试剂A中，使成为蛋白
抽提混合试剂(该混合物被称为Extraction Buffer Mix ——A)；加
2ul的蛋白酶抑制剂于200ul蛋白抽提试剂B中，使成为蛋白抽提混合
试剂(该混合物被称为Extraction Buffer Mix ——B)；加2ul的蛋白酶
抑制剂于200ul蛋白抽提试剂C中，使成为蛋白抽提混合试剂(该混
合物被称为Extraction Buffer Mix ——C)；
试剂盒组分
DBI-1021 DBI-1022 包装
50 次100 次颜色
蛋白抽提试剂A
蛋白抽提试剂A-1
蛋白抽提试剂B
蛋白抽提试剂C
混合型蛋白酶抑制剂(100×)
SDS-PAGE 样品缓冲液(6×)
50ml
500ul
50ml
25ml
1支
5支
100ml
1000ul
100ml
50ml
1支
10支
棕色
棕色
棕色
棕色
棕色
绿色
• 在试验过程中确保抽提混合物始终保存在在碎冰中。
• 需要自己提供的试剂：90% acetone，PBS
抽提所使用的蛋白抽提试剂使用量
抽提步骤
Ⅰ. 准备细胞
1. 将培养好的细胞用预冷的PBS 清洗2-3 次。
2. 选择合适的方法进行悬浮细胞和贴壁细胞的蛋白抽提：
如果样品为悬浮细胞；蛋白抽提试剂的使用量依赖于培养细胞的湿重或细
胞数量。
a) 转移悬浮细胞培养液到一个预先称重的离心管中，简单的离心。
b) 弃去上清培养基，称量其重量，计算出悬浮细胞的重量。
c) 按照实验II 进行下面的实验。
如果样品为单层贴壁细胞： 蛋白抽提试剂的使用量取决于培养细胞
的器皿大小或细胞数量。
a) 按照实验III 进行下面实验。
Ⅱ. 悬浮细胞蛋白抽提实验步骤
1. 吸取取5 倍体积细胞湿重的蛋白抽提试剂A ，加入到已经清洗好的细胞
沉淀中。用移液器小心吹打，使细胞悬浮。
2. 冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约10 分钟。使95-100%的细胞
胞浆流出细胞。
注意：在实验过程中，每个步骤的时间要保持连贯性。
3. 以480g 的离心速度，4 度离心10 分钟。
4. 转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为胞浆蛋白。（ 标
记为上清1）。于-70℃保存该样品。.
5. 吸取取3 倍体积细胞湿重的蛋白抽提试剂B，加入到沉淀中。用移液器
小心吹打，使沉淀悬浮。
6. 冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约30 分钟。
7. 以5000g 的离心速度，4 度离心10 分钟。
8. 转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞质膜蛋白。
（标记为上清2）。于-70℃保存该样品。
9. 吸取取1.5 倍体积细胞湿重的蛋白抽提试剂C，加入到沉淀中。用移液器
小心吹打，使沉淀悬浮。. 漩涡混合器上高速振荡30 秒，或转移到玻璃
匀浆器中高速匀浆30 秒。
10. 以6780g 的离心速度，4 度离心10 分钟。
11. 转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞核蛋白。
（标记为上清3）。于-70℃保存该样品。
Ⅲ. 单层贴壁细胞的蛋白抽提
对于贴壁细胞，用细胞刮将细胞刮掉，用PBS 清洗细胞3 次。600g，离
心5 分钟，收集细胞。下面实验适用于约5×106 个细胞。
1. 吸取取1ml 的蛋白抽提试剂A，加入到已经清洗好的细胞沉淀中。用移
液器小心吹打，使细胞悬浮。
2. 冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约10 分钟。使95-100%的细胞
胞浆流出细胞。
注意：在实验过程中，每个步骤的时间要保持连贯性。
3. 以480g 的离心速度，4 度离心10 分钟。
4. 转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为胞浆蛋白。（ 标
记为上清1）。于-70℃保存该样品。.
5. 吸取取500ul 蛋白抽提试剂B，加入到沉淀中。用移液器小心吹打，使沉
淀悬浮。
6. 冰上孵育细胞，并且轻微振荡，时间为大约30 分钟。
7. 以5000g 的离心速度，4 度离心10 分钟。
8. 转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞质膜蛋白。
（标记为上清2）。于-70℃保存该样品。
9. 吸取250ul 蛋白抽提试剂C，加入到沉淀中。用移液器小心吹打，使沉淀
悬浮。. 漩涡混合器上高速振荡30 秒，或转移到玻璃匀浆器中高速匀浆30
秒。
10. 以6780g 的离心速度，4 度离心10 分钟。
11. 转移上清到一个干净的离心管中。记录上清的体积，此即为细胞核蛋白。
（标记为上清3）。于-70℃保存该样品。
Ⅳ. 蛋白浓度测定
可使用BCA 定量法（DBI-018）和Bradford(DBI-016)进行蛋白浓度测定。
具体程序请参照相关说明书。
该试剂盒所获的的相关部分蛋白质是进行后续实验的最佳蛋白来源。
1. 该试剂盒所获的的相关部分蛋白质浓度很高，可以用相关的缓冲液进行稀
释使用，因此最大限度的避免了去垢剂的影响。
2. 该试剂盒中的蛋白抽提试剂可以和各种蛋白酶抑制剂混合使用，而不影响
其抽提效果。
3. 利用该试剂盒所得到的蛋白抽提液以成功用于SDS-PAGE，WB，EMSA，
IP 等各种实验，蛋白抽提试剂中的去垢剂完全不影响实验。

内容总结

（1）胞浆蛋白/核蛋白/膜蛋白抽提试剂盒(真核细胞)
(Catalog #DBI-1021
（2）Store kit at 4℃)
描述:
本试剂盒提供了蛋白抽提试剂A，蛋白抽提抽提试剂B，蛋白抽提试剂C
三种具有独特组分的缓冲液
（3）• 使用前, 加10ul的蛋白酶抑制剂于1ml蛋白抽提试剂A中，使成为蛋白
抽提混合试剂(该混合物被称为Extraction Buffer Mix ——A)