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肝硬化中肝星状细胞信号分子的研究 2010级普外专业班李孝平（2010108）王军宏（2010101）张斌（2010098）张臣民（2010106）摘要：肝硬化是一种常见的慢性肝病，是多原因引起的肝脏损害，肝星状细胞（HSC）在肝硬化、肝纤维化病程中起关键作用。多种信号分子都能导致HSC的活化激活。近年来的研究发现，尽管不同病因导致肝病的发病机制不同，但肝纤维化发生的共同途径均是HSC。对HSC激活的多信号分子复杂网络系统的研究，可以为HSC的基因治疗提供系统的理论基础，从而使HSC的基因治疗具有高靶向性、高效性和低免疫原性，达到理想的肝纤维化治疗效果。关键词：肝硬化；肝星状细胞；信号分子The Research of Signaling Molecules of Hepatic Stellate Cells（HSC）in Cirrhosis ZHANG Jin-liang,YANGDAN Cai-rang,FAN Hai-ning.(Department of Pancreatic Surgery,Affiliated Hospital of Qinghai University,Qinghai 810001,China）Abstract: Cirrhosis is a common chronic liver disease and liver injury caused by many factors, HSC plays a important role in Cirrhosis and liver fibrosis.Many kinds of signaling molecules could lead to HBC activing.From recent years researches is that,although different factors caused the different pathogenesis of liver disease,the final common pathway of liver fibrosis is HSC.The research of multi-signal complex network system in HSCs activation could provide systematic theory basis for HSCs gene therapy in liver fibrosis.HSCs high gene targeting, efficiency and Low immunogenicity.So that the gene therapy of hepatic stellate cells with high targeting，efficiency, and low immunogenicity，to achieve the desired therapeutic effect of liver fibrosis.Key words:Cirrhosis; Hepatic stellate cells; Signal molecule 肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）增生、活化使肝细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度纤维化增生是肝硬化的病理基础。有效阻止HSC的增生和纤维化成为治疗肝硬化的有效方法。近年来, HSC死亡和ECM的降解成为抗肝纤维化的研究热点。各种致纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞，通过使其转化为肌成纤维细胞这一共同复杂的网络系统，参与肝纤维化的发生和进展。当各种致病因素持续作用于肝脏时，通过复杂机制激活HSC，活化的HSC通过旁分泌与自分泌作用合成分泌多种ECM，同时合成、释放大量基质金属蛋白酶抑制剂抑制胶原酶、明胶酶等金属蛋白酶活性，减少ECM降解，导致ECM合成大于降解，最终过量积聚在肝内形成肝纤维化。1 HSC的主要信号分子HSC与肝脏炎性反应的关系非常密切，在许多慢性肝病中，肝实质的炎症与肝纤维化同时存在。肝脏发生炎症时，通过激活Kupffer细胞和单核细胞释放促炎介质对肝脏造成损害，损伤的肝细胞Kupffer细胞、内皮细胞释放细胞因子，如转化生长因子bl(transforming growth factor b1，TGF-b1)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)、肿瘤坏死因子a(tumor necrosis factor a，TNF-a）、白细胞介素（interleukin,IL）1、IL-6等，直接或间接地促进HSC的激活，激活的HSC合成大量的ECM，加重纤维化。1.1 TGF-b TGF-b1是肝脏中含量最高，并有生物活性的转化生长因子。其功能是抑制体内大多数细胞增殖和诱导凋亡，但能刺激纤维细胞增殖产生ECM。几乎所有体细胞中均存在TGF受体，主要分3种：TGF-bRI(ALK5)、R、R，与TGF-b信号转导相关的主要为R和R2。正常情况下，TGF-b的表达极少维持细胞的正常生理活动，而肝损伤时其表达明显增加，促进肝纤维化进程。细胞表达的TGF-b与HSC细胞膜上特异性受体(TbR/)结合，再通过细胞内Smad通路和非Smad通路转导至核内，使 HSC转化为肌成纤维样细胞，并能诱导活化的HSC收缩，在HSC活化早期刺激ECM的合成与沉积。TGF-b作用于HSC膜型受体主要抑制细胞增殖，作用于型受体促进ECM合成。TGF-b也能诱导其他信号通路，如结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路等。研究发现，CTGF启动子序列128162位置上存在着一个重要的TGF-b1调控元件，因此认为CTGF是TGF-b1导致肝纤维化信号通路的直接下游应答因子。1.2 PDGF PDGF是目前已知的多肽生长因子中对HSC作用最强的有丝分裂原。PDGF由A、B两条肽链组合而成，其中PDGF-BB可促进HSC分裂、增殖和活化,使其表达PDGF受体而启动肝纤维化进程，促进ECM 的合成，使肝脏发生纤维化沉积。各种肝损伤可导致PDGF受体的上调和PDGF分泌的增加，其机制为PDGF与PDGF受体结合后引起PDGF受体自身磷酸化，多种细胞内信号转导分子作为PDGF受体的底物与其自身磷酸化位点结合并活化。可启动多种下游蛋白级联磷酸化反应信号转导通路，主要有Ras蛋白/细胞外调解蛋白激酶、丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酶C等，并且其信号转导通路之间常存在“交谈”调节核内转录因子的转录。1.3 CTGF CTGF是一种间质细胞生长因子，具有明显的丝裂原性和趋化性，可以启动一系列介导与组织创伤修复和再生相关的生物学过程。Sedlaczek等8研究发现，分泌在环境中的CTGF会与肝脏ECM发生连接，在基质周围积聚。推测CTGF可通过与HSC膜上表达的受体结合，刺激HSC来增加ECM成分的表达。另据研究发现，转染抗CTGF的siRNA能显著诱导大鼠原代HSC周期处于静止状态，抑制HSC增殖及CTGF蛋白的表达。1.4 肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF） HGF是一种多效性物质，具有强大的促肝细胞再生、抑制肝细胞凋亡的作用，而且具有促进纤维化肝组织重建、新血管形成的作用。HGF对肝纤维化的抑制作用是通过降低TGF-b基因的转录水平，抑制HSC激活以及上调胶原酶、尿激酶原基因的表达来实现的。LIN等发现转染外源性HGF基因到纤维化大鼠，可使HGF受体表达上调，肝细胞增殖明显。因此，HGF有可能成为基因治疗的一种有效手段。1.5 表皮生长因子、角质细胞生长因子和肝再生增强因子 表皮生长因子、角质细胞生长因子和肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration，ALR)均能促进肝细胞再生，减轻肝纤维化。比HGF具有更强的促进肝细胞增殖的能力和更高的特异性。它通过肝细胞表面受体介导的信号转导通路调节肝细胞活性，其更重要的功能在于可促进活跃再生的细胞中细胞核和线粒体转录体的合成与稳定。有研究显示，ALR是通过上调干扰素g的表达，抑制肝脏自然杀伤细胞的活性，从而起到促进肝细胞再生和逆转肝纤维化的作用。此外，ALR还可以抑制金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1）表达，从而逆转肝纤维化。Tanigawa等发现在肝病患者的肝组织中，ALR mRNA表达较正常对照组明显升高。在部分肝切除大鼠肝组织ALR mRNA在术后12 h明显升高，24 h达到高峰，表明肝脏损伤后即可启动ALR基因表达，参与肝细胞的再生调控。1.6 干扰素g 干扰素g是目前研究最广泛的抗纤维化细胞因子，由活化T细胞产生，能够直接抑制HSC合成ECM。Zhang等将重组干扰素g腺病毒转染大鼠HSC，实验证实，外源性干扰素g可明显抑制HSC的激活和ECM的产生。体外实验显示，干扰素g使HSC的激活受到抑制，a平滑肌肌动蛋白和TIMP-1、TGF-b mRNA表达减少。活体实验显示肝纤维化进展受到抑制，血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶均显著降低。 推测干扰素g抗纤维化的可能机制为：通过抑制HSC的活化和增生，从而减少ECM的合成。降低成纤维细胞、型前胶原mRNA水平，使胶原合成减少，抑制ECM分泌并促进其降解。抑制其他影响肝纤维化的细胞因子而减少ECM的积聚。1.7 金属蛋白酶（Metalloproteinase，MMPs）和TIMP TIMP是通过抑制MMPs对ECM的降解作用从而促进和加重肝纤维化进程的，正常的肝脏ECM合成和降解处于动态平衡，MMP促进ECM 降解，TIMP是调节MMP活性的物质。HSC激活不仅表达多种MMP，还能合成MMP活性调节因子，如TIMP和纤溶酶原激活物抑制剂1等。Iimuro等研究发现，含有人MMP-1前体DNA的重组腺病毒，可使大鼠的肝纤维化减轻、激活HSC减少、肝细胞再生增加、型胶原生成减少。通过调控MMP和TIMP的活性促进ECM降解可以有效治疗肝损伤后的肝纤维化。1.8 IL IL-10可以抑制肝脏间质炎性反应，从而阻断肝纤维化进程。在肝纤维化进程中，内源性IL-10主要由库普弗细胞和HSC分泌。目前认为，HSC有可能是通过分泌IL-10等细胞因子，反馈调节库普弗细胞的功能，从而参与调节肝脏炎性反应及肝纤维化进程。IL- 10、 干扰素及干扰素a黑素细胞刺激素(a melanocyte-stimulating hormone，a-MSH) 均能抑制肝纤维化16。国外学者制备IL-10表达载体和带有启动子的a1型胶原表达载体，将两个载体共转染细胞，显示IL-10的表达对a1型胶原启动子的抑制率达40。1.9 a-MSH MSH是一种神经内分泌激素，分为a-MSH、b-MSH、g -MSH3种，a-MSH对动物成纤维细胞的生物学行为发挥着广泛的调节作用，a-MSH能够逆转小鼠肝纤维化，防止纤维化及炎性反应基因上调。Jacobsen通过用电穿孔的方法将a-MSH表达质粒导入硫代乙酰胺诱导的大鼠肝纤维化模型中，结果显示：a-MSH基因能降低肝脏TGF-b1、a1型胶原及细胞黏附分子的mRNA，同时减少a平滑肌肌动蛋白及环氧合酶2的表达，增强MMP的活性使TIMPs失活。因此，a-MSH有望成为肝纤维化基因治疗的另一有效方法。1.10 单核细胞趋化性肽1 单核细胞趋化性肽1能促进单核细胞趋化进入组织并分化为枯否细胞。促进氧化应激反应和核转录因子转录而启动炎性应答，进一步加重肝损伤。单核细胞趋化性肽1同时是致纤维化的重要细胞因子，可以直接激活HSC和上调TGF-b而介导胶原的合成过程。1.11 核因子kB 核因子kB是一类重要的核因子，其通过抑制TGF-b1介导的肝细胞凋亡和促进肝细胞再生而影响肝脏损伤后纤维化发生发展过程。在肝脏损伤后，其在激活的HSC中表达明显增多，进一步激活其下游的IL-6及细胞间黏附因子基因。通过阻断这一信号通路可以抑制肝脏纤维化发生、发展。1.12 活性氧 损伤后肝组织应激引起肝细胞、Kupffer细胞、嗜中性粒细胞等炎性细胞的过氧化损伤，所产生的活性氧及其他分泌产物进一步促进HSC活化，介导肝纤维化发生。近年研究发现，除上述旁分泌机制外，活性氧、超氧阴离子、亚甲基二苯胺、乙醛、花生四烯酸以及氧化修饰的低密度脂蛋白胆固醇等均可直接刺激HSC活化、增殖。维生素C、维生素E、牛磺酸以及柳氮磺吡啶等都可以抑制脂质过氧化反应，从而减轻肝纤维化的程度。此外尚有整合素、一氧化氮、肾素-血管紧张素-醛固酮系统等，在新生血管形成和肝纤维化进展中起到一定的作用，影响肝脏纤维化的发生、发展。2 展 望制备高效、高靶向性、低免疫原性的治疗基因，并将治疗基因及其载体一起转导入HSC，可明显抑制或逆转肝纤维化甚至肝硬化进程，显著改善临床症状。因此，系统认识HSC在肝纤维化中的分子机制为更有效地进行肝纤维环基因治疗提供了分子水平的理论基础。寻找治疗肝纤维化的有效基因靶点，采用多环节、多途径、多靶点、多阶段的措施，可以达到有效治疗肝纤维化的目的。在肝脏受到慢性损伤性刺激或发生肝纤维化后，针对肝纤维化发生的某些环节，即针对特定的细胞因子，在基因水平对这些细胞因子进行调控其表达，以达到阻止肝纤维化病理进程的目的。 参 考 文 献1 Prosser CC,Yen RD,Wu J.Molecular therapy for hepatic injury and fibrosis:where are we?J.World J Gastroenterol,2006, 12(4):509-515. 2 Ghosh AK,Wei J,Wu M,et al. 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