细胞培养技术原理及应用.doc

细胞培养技术原理及应用研究进展姓名：赵鹏 学号：158033038 专业：流行病与卫生统计学摘要：细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术，已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法。文章对细胞培养技术的应用作一综述。关键词：细胞培养；应用；研究进展细胞是构成机体的基本单位，是生命活动的基本单位。一切有机体（除病毒）都是由细胞组成的。细胞具有独立的、有序的自控代谢体系。因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、征服疾病的关键。细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术。细胞培养技术的优点是可以直接观察活细胞的形态结构、生命活动及其变化；提供大量生物性状相似的试验对象，特别是研究大型动物（奶牛）时具有耗资少的优点。但模拟体内环境仍与实际有很大的差异，因此利用细胞培养技术的试验结果不可以轻易做出与体内等同的结论。动物组织（细胞）培养开始于20世纪初，现已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法1 。随着细胞培养技术的不断发展，现在也广泛应用于动物生产研究。20 世纪 60 年代，该技术应用于水产动物的病毒分离和纯化，对于鱼类疾病的防治具有重要作用。近年来研究发现单一种子细胞难以完成构建复杂组织的需要，因此产生了联合培养细胞技术。联合培养下的细胞之间存在着精细的相互调控关系，因而更符合仿生学的原理且更有利于种子细胞的增殖与分化，为复杂的细胞诱导分化以及体外组织构建提供了新思路、新方法2 。1 细胞培养细胞培养是将活体组织或细胞从试验动物体内取出，放在模拟体内生存环境的体外环境（无菌、适温、营养丰富）中，使高体细胞生长、发育的一种方法。按照培养的结构成分不同，将其分为组织培养、细胞培养及器官培养等。根据细胞是否在支持物上生长，将其分为贴壁型和悬浮型。一般来说，圆形细胞如淋巴细胞属于悬浮型，而胞体梭型（成纤维型细胞）、扁平不规则（上皮型细胞）等属于贴壁型，贴壁型细胞必需贴附在支持物表面生长。细胞培养开始于 1906 年，Harrison 用蛙新鲜淋巴液培养蛙胚神经组织 4 周，首次成功地利用体外培养液培养神经元，标志着组织细胞的体外培养模式的基本建立。随着细胞培养技术的不断发展和完善，20 世纪 50 年代进入繁盛阶段，细胞培养逐渐被基础研究与应用领域所应用，特别是在医学领域得到迅速的发展。目前，细胞培养技术已经涉及到生物学、农业、环境保护等领域 3 。目前，在细胞培养过程中，只能根据离体细胞的特点和培养条件，提供满足其生长和发育的一些基本生理条件。必须在无菌条件下进行，细胞感染微生物后，会因被夺营养物质而导致细胞生长缓慢或停滞，甚至死亡。需要提供适宜的温度和pH，一般哺乳动物细胞培养的温度控制在37 ，鱼类的温度要低一些。温度过高或过低时，均不利于细胞生长甚至会导致细胞死亡。动物细胞最适宜pH一般控制在 7.27.4，在此范围细胞生长活跃，增殖速度快，如果过低或过高性，细胞会因为细胞膜受损而死亡。细胞离体培养技术的关键是细胞培养液的设计，理想的细胞培养液可以同时解决细胞离体培养所需要的pH、渗透压、营养物质、调节物质的全部需要。细胞培养液中需含有细胞增殖、生长所需要的各种营养物质。如提供能量的物质（N源、C源）、代谢调节控制的物质（无机盐、维生素、激素）。另外，在细胞培养过程中需要提供一定量的气体（O2和CO2）。CO2具有调节pH和缓冲的作用，一般提供 5% CO2。2 细胞培养技术的应用研究2.1 在病毒学中的应用培养细胞为病毒的增殖提供了场所，细胞是分离病毒的基质，体外培养细胞无抗体及非特异颉颃物质的影响，而且对病毒的敏感性较体内细胞高，可采用离心感染法或提取病毒核酸进行感染，并以细胞打孔器协助感染扩大病毒感染的宿主范围，使病毒感染指标容易观察，光学显微镜下就可见到包涵体、细胞融合等现象，同时也便于用分子病毒学技术进行检测。乙肝病毒（BV）的感染可引发急、慢性病毒性肝炎，还与肝硬化、肝细胞癌的发生和发展有密切关系。肝源细胞模型对研究BV生物学特性、BV的致病机制、BV基因组的复制、表达和调控、体外抗病毒药物的筛选发挥了重要作用，大大促进了对 BV的研究4。通过细胞培养技术，可了解猪轮状病毒的培养特性，建立其分离方法以及FQ-PCR检测方法，为研发诊断试剂盒和疫苗奠定基础。使用细胞培养研究鱼类病毒可以减少隐性感染机率和个体差异引起的误差，使试验结果更加准确迅速，可建立细胞株（系）分离和鉴定鱼类病毒，进行生物学、病理学和流行病学研究，具有非常重要的意义5-6。2.2 在肿瘤学中的应用肿瘤是机体在致癌因子的作用下，组织中的细胞失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。目前对于各种癌症还没有有效的药物来治疗，肿瘤研究的首要任务是明确致癌机制。细胞培养技术使研究人员能够清楚地认识正常细胞、癌前病变细胞、生命有限的肿瘤细胞以及完全转化或永生化的肿瘤细胞的生物学特征，这些逐级进化的细胞是体外研究多阶段致癌机制的基础。体外血管模型主要研究血管的生理和病理以及药物的作用，根据培养方式不同可以分为二维和三维血管7-8。徐燕等利用人卵巢癌（ODMCs）微血管内皮细胞的培养用抗CD31 的免疫磁珠与内皮细胞特异性结合的原理，分离获得了高纯度可传代并具有体外二维管腔样结构形成特性的 ODMCs，建立起简便快速的卵巢癌微血管内皮细胞体外培养体系，为后续研究卵巢癌抗血管生成提供了良好的试验材料9。马晓雯等建立一种有效培养人肺腺癌A549 Sphere细胞的方法，并在A549 Sphere 细胞中初步证明了人肺腺癌中可能存在肿瘤干细胞，这些Sphere细胞可富集干细胞样细胞，抗化疗药物的能力也增强。不仅为分离A549细胞中的肿瘤干细胞提供一种可能的有效途径，也为理解临床肺腺癌治疗的耐药性提供了新思路10。2.3 在药理学中的应用细胞培养在药理学中的应用比较广泛。通过培养细胞的生长曲线可计数细胞增长的绝对指数，从而可以直观地了解细胞生长与死亡的动态变化，一般用于检测各种药物对细胞生长的影响。利用培养细胞的放射自显技术，研究细胞的物质代谢、动态变化和细胞周期等，对于药物作用机制的研究有重要作用。细胞培养可用于抗动脉粥样硬化、血糖等药物的研究等应用。目前，体外培养活的心肌细胞已经广泛应用于药理学方面的研究。此方法通过对心肌细胞的培养，可以观察各种药物对其直接作用和对活细胞影响的动态过程，深入研究药物对心肌细胞的离子转运的影响，建立各种心肌细胞损伤模型，利于探讨药物的作用机制。此外，还具有简便、准确、快捷、节约动物和药品等特点，可大幅提高研究效率。阳海鹰等利用试验建立的新生小鼠心肌细胞体外培养方法，结果表明，单细胞收获率和心肌细胞纯度高，心肌细胞搏动时间长；并应用此细胞模型观察了镰刀菌毒素丁烯酸内酯（BUT）对心肌的毒性作用，证明具有结果稳定，重复性好等优点11。这不仅为毒理学，还为药理学研究提供了一个较好的实验模型。2.4 在动物生产中的应用细胞培养作为细胞生物学乃至生物学研究的重要技术，在生物领域中占有重要地位。动物组织（细胞）培养开始于20世纪初，发展至今已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法，目前这项技术也广泛应用于动物生产的研究。球虫是一类寄生于鸡等动物肠道上皮细胞引起的一种原虫，广泛分布于世界各地，是目前危害养鸡业的重要疾病之一。而细胞培养为球虫研究提供洁净无污染的环境，为研究抗球虫药物的作用机制、活性以及球虫的发育、行为、结构、免疫、遗传、细胞化学和生物化学等方面提供更有效的研究工具12。在鱼类方面，利用细胞克隆技术可以培育出新品种，还可以通过细胞培养技术对于鱼类病毒的分离、鉴定和增殖，病毒抑制和复制途径的阻断等方面具有重要作用。Nicolajsen 等证明，虹彩病毒在BF-2、EPC、CHSE-214、RTG-2、FHM等5种细胞系均有较好的繁殖，这为研究宿主和病原之间的机理提供了帮助13。郑凯等研究通过获得较高纯度的牦牛子宫肉阜上皮细胞并进行培养，可为牦牛胎儿与母体之间的相互调控及物质运输提供简捷的研究平台14。2.5 在其他方面的应用细胞培养技术可用于有毒物质的毒性机理的研究。可利用体外培养动物细胞来研究氟化物的毒性机制15。木脂素类、黄酮等活性物质是植物的次生代谢产物，其具有抗肿瘤、抗氧化等多种功能，现在可以利用细胞培养技术从植物细胞获取。利用连翘叶子的悬浮细胞可进行培养提取木脂素；可利用银杏液体悬浮细胞培养生产黄酮、药材金铁锁细胞培养生产皂苷等16-21。除此之外，细胞培养在生产疫苗方面也做出了贡献。法国巴斯德研究所和美国西奈山医学中心就在哺乳动物细胞中成功表达了乙肝表面抗原。我国也成功研制了由中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞系表达的基因工程乙肝疫苗。3 小结细胞培养技术经过不断的研究和完善，已经成为实验室常用的研究方法，广泛应用于农业、医药学等领域。目前，动物细胞培养可以降低试验成本、避免浪费等优点也逐渐应用于在动物生产中。但细胞培养只是在模拟机体内的生理环境，使细胞维持生长、繁殖的技术，相对于机体这个系统来讲，存在很大的差异，会导致细胞或组织的形态或功能发生不同程度的改变，因此试验的结果不能等同于在体内研究的结果。参考文献1李勇.细胞培养在水产养殖中的应用J.才, 2011 (18)：92-93.2刘流.联合细胞培养在组织工程中的研究进展fJl.昆明医学院学报，2010 (3):1-3.3张卓然.培养细胞学与细胞培养技术M.上海:上海科学技术出版社，2004.4段彪，中元英.乙肝病毒肝源细胞培养模型的研究进展J.中国病原生物学杂志，2011. 6 (8) : 618-6205魏锁成，巩转娣，宋昌军.猪轮状病毒的细胞培养特性 FQ-PCR检测力一法的建立J.中国兽医学报，2011. 31 (3) : 373-377.6李文峰，麦康森，黄捷，等.鱼类细胞培养及其在病毒学研究中的应用J.动物医学进展，2010, 31 (5): 107-110.7 Ladakis S M. 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