酶工程-细胞工程产酶.pptx

第三章第三章 动、植物细胞培养产酶、动、植物细胞培养产酶、有用次生代谢产物有用次生代谢产物第一节 植物细胞培养产酶第二节 动物细胞培养产酶初级代谢和次级代谢n 次级代谢是相对于初级代谢而言的，所谓初级代谢是一类普遍存在于生物中的代谢类型，是与生物生存有关的，涉及能量产生和能量消耗的代谢类型。n 初级代谢产物如单糖、核苷酸、脂肪酸等单体，以及由它们组成的各种大分子聚合物如蛋白质、核酸、多糖、脂类等，都是有机体生存必不可少的物质。n 在这些物质的合成中的任何环节发生障碍，有可能引起生长停止，甚至导致机体发生突变或死亡。n 次级代谢是某些微生物为了避免代谢过程中，某种代谢产物的积累造成的不利作用，而产生的一类有利于生存的代谢类型，通常是在生长后期合成。n 通过次级代谢合成的产物称为次级代谢产物。n 这些代谢产物并不是微生物生长所必需的，即使在这些代谢的某个环节上发生障碍，也不会导致机体生长停止或死亡，仅仅是影响了机体合成次级代谢产物的能力。通常它们以多组分的形式存在。n n 有学者认为这是某些生物在一定条件下通过突变获得的一种适应生存方式，或是一种解毒方式，对产生菌的生存仍可能有一定的价值。n 次级代谢产物的种类很多，如氨基糖衍生物、苯醌、香豆素、环氧化合物、麦角生物碱、戊二酰胺、吲哚衍生物、内酰、萘、核苷、肽、喹啉、吡咯、吩嗪、多烯、聚乙炔、萜烯、四环类抗生素等。n 有的次级代谢产物含有特殊的化学键，例如，-内酰胺环、有修饰过的氨基酸组成的环肽、聚乙烯和多烯的不饱和键、大环内脂类大环等。n 初级代谢与次级代谢除了以上不同外，还有许多区别:n 与微生物生长的相互关系上有明显不同，n 初级代谢过程自始至终都存在于一切生活细胞之中，并与机体的生长过程呈平行关系；n 而次级代谢则仅在机体生长的某一个时期产生，或在微生物的对数生长期后期或在稳定期，与微生物的生长不呈平行关系。n 初级代谢产物在不同的微生物中基本相同，n 而次级代谢产物的种类在不同微生物中是非常不同的。n 初级代谢对环境变化的敏感性比较小，即遗传稳定性强，n 而次级代谢对环境条件的变化很敏感，其产物的合成往往会因环境条件的变化而停止。n 催化初级代谢产物合成的酶专一性强，n 而催化次级代谢产物合成的某些酶专一性不强。n 初级代谢和次级代谢类型既有区别，又是紧密联系着的。第一节 植物细胞培养产酶一、植物细胞的特性二、植物细胞培养的特点三、植物细胞培养的工艺条件及其控制四、植物细胞培养产酶的工艺过程n 动植物细胞培养是通过特定技术获得优良的动、植物细胞，然后在人工控制条件的反应器中进行细胞培养，以获得所需产物的过程。n 植物细胞培养的主要目的是生产色素、药物、香精、酶等次级代谢物。n 动物细胞培养的主要目的是获得疫苗、激素、多肽药物、单克隆抗体、酶、皮肤等人体组织、器官等功能性蛋白质。细胞培养的定义细胞培养的定义及生产目的及生产目的第一节第一节 植物细胞培养产酶和有用次生代谢产物植物细胞培养产酶和有用次生代谢产物n 人类从天然植物中提取各种有重要应用价值的产物受到了限制:一是天然植物的产量低，不能满足需要；二是许多野生植物正趋于濒危；三是引种驯化困难；四是受自然环境和耕地的影响，栽培中产量和质量难以控制。此外，用化学合成的方法，因为工艺复杂、成本高、污染大，也受到了限制。为此，发展植物细胞培养技术，生产各种来源于植物为此，发展植物细胞培养技术，生产各种来源于植物的有重要应用价值的产物。的有重要应用价值的产物。n 1902年德国植物生理学家哈勃兰德（Haberlandt）首次提出分离植物单细胞并将其培养成植株的设想，并首次提出细胞培养的概念。n 这一论述的依据就是植物细胞全能性学说(cell totipotency)。n 所谓细胞的全能性(totipotency)是指个体某个器官或组织已经分化的细胞在适宜的条件下再生成完整个体的遗传潜力。n 1965年，由Vasil和Hildebrandt用单个分离的细胞培养成一个完整植株，细胞全能性得到实现。n 在这一理论的指导下，经过一个世纪的发展，植物细胞培养已经建立起专门技术，形成新的学科。n一、植物细胞的特性n （1）植物细胞比微生物细胞大得多，体积比微生物细胞大103-106倍；植物细胞的体积也比动物细胞大。n （2）植物细胞的生长速率和代谢速率比微生物低，生长倍增时间较微生物长；生产周期也比微生物长。n （3）植物细胞和微生物细胞的营养要求较为简单。n （4）植物细胞与动物细胞、微生物细胞的主要不同点之一，是大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照强度和光照时间。n （5）植物细胞与动物细胞一样，对剪切力敏感。n （6）植物细胞和微生物、动物细胞用于生产的主要目的产物各不相同。植物细胞主要用于生产色素、药物、香精和酶等次级代谢物；微生物主要用于生产醇类、有机酸、氨基酸、核苷酸、抗生素和酶等；动物细胞主要用于生产疫苗、激素、单克隆抗体、多肽因子和酶等功能蛋白质。二、植物细胞培养的特点n 植物细胞培养技术首先从植物外植体中选育出植物细胞，再经过筛选、诱变、原生质体融合或DNA重组等技术而获得优良的植物细胞。然后，在人工控制条件的植物细胞反应器中进行植物细胞培养，从而获得各种所需的产物。n 外植体(explant)：在组织培养中，由植物体上取下来进行离体培养的那部分组织或器官。n 植物细胞培养生产各种天然产物，与从植物中提取分离这些物质相比，具有如下显著特点：n1.提高产率n 使用优良的植物细胞进行培养生产天然产物，可以明显提高天然产物的产率。n2.缩短周期n 植物细胞生长的倍增时间一般为12-16h，一般生产周期为15-30天，这比起微生物来是相当长的时间，但是与完整植物的生长周期比较，却是大大地缩短了生产周期。n3.易于管理，减轻劳动强度n 植物细胞培养在人工控制条件的生物反应器中进行生产，不受地理环境和气候条件等的影响，易于操作管理，大大减轻劳动强度，改善了劳动条件。n4.提高产品质量n 植物细胞培养的主要产物的产率较高，杂质较少，在严格控制条件的生物反应器中生产，可以减少环境中有害物质的污染和微生物、昆虫等的侵蚀，产物易于分离纯化，从而提高产品质量。n5.其他n 对剪切力敏感、生产周期长（缺点）n生长和代谢需要一定的光照。三、植物细胞培养的工艺条件及其控制（一）植物细胞培养的工艺流程外植体细胞的获取细胞培养分离纯化 产物1.外植体的选择与处理 外植体是指从植株中取出，经过预处理后，用于植物组织和细胞培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）片段或小块。外植体要选择无病虫害、生长力旺盛、生长有规则的植株。将外植体切成0.5-1cm左右的片段或小块，用70%-75%的乙醇溶液或者5%次氯酸钠、10%漂白粉、0.1%升汞溶液等进行消毒处理，再用无菌水充分漂洗，以除去残留的消毒剂。2.植物细胞的获取从外植体获取植物细胞的方法主要有直接分离法愈伤组织诱导法原生质体再生法（1）直接分离法机械法（捣碎外植体，过滤、离心分离）酶解法（酶处理外植体分离有活性细胞）植物细胞可以直接从外植体中分离得到。n（2）愈伤组织诱导法n 愈伤组织是一种能迅速增殖的无特定结构和功能的薄壁细胞团。n 通过愈伤组织诱导法获得植物细胞的基本过程如下：n 将选择好含有一定量的生长素和分裂素的液体培养基加入0.70.8的琼脂，制成半固体的愈伤组织诱导培养基。n 灭菌、冷却后，将外植体植入诱导培养基中，于25左右培养一段时间，即从外植体的切口部位长出小细胞团，此细胞团称之为愈伤组织。n 一般培养13周后，将愈伤组织分散接种于新的半固体培养基中进行继代培养，以获得更多的愈伤组织。n 诱导获得的愈伤组织可以用镊子或小刀分割得到植物小细胞团，n 也可以在无菌条件下，将愈伤组织转移到液体培养基中，加入经过杀菌处理的玻璃珠，进行振荡培养，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞，n 然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大细胞团和残渣，得到一定体积的小细胞团或单细胞悬浮液。n（3）原生质体再生法n 原生质体（protoplast）是除去细胞壁后得到的微球体。n 植物原生质体可从培养的植物单细胞、愈伤组织和植物的组织、器官中获得。n 植物原生质体的分离方法一般有机械分离法和酶解法两种，目前一般都采用酶解法分离原生质体。n 植物细胞的细胞壁的基本成分是纤维素、半纤维素和果胶物质。n 为使细胞壁降解释放原生质体，必须使用能催化纤维素、半纤维素和果胶物质水解的酶制剂,最常用的有纤维素酶和果胶酶混合物。n 在原生质体制备过程中，为了防止原生质体被破坏，一般要采用高渗溶液，以利于完整原生质体的释放。n 配制高渗溶液的溶质称为渗透压稳定剂。n 常用的渗透压稳定剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐类等。n 原生质体分离后，经过计数和适当稀释，在一定条件下进行原生质体培养，使细胞壁再生，而形成单细胞悬浮液。n 细胞壁再生后得到的植物单细胞，经过单细胞培养，长成细胞团，再经过继代培养，形成由原生质体形成的细胞系。n3.细胞悬浮培养n 将上述获得的植物细胞在无菌条件下，转入新的液体培养基，在人工控制条件的生物反应器中，进行细胞悬浮培养，获得所需的产物。n4.分离纯化n 细胞培养完成后，分离收集细胞或者培养液，再采用各种生化技术，从细胞或者培养液中将各种物质分离，得到所需的产物。（二）植物细胞培养的培养基1.植物细胞培养基的特点 植物细胞培养的培养基与微生物培养基有较大的差别，其主要不同点在于：（1）植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐（2）植物细胞需要多种维生素和植物生长激素（3）植物细胞要求的氮源一般为无机氮源 即可以同化硝酸盐和铵盐。（4）植物细胞一般以蔗糖为碳源 蔗糖的浓度一般为2%-5%。2.几种常见的植物细胞培养基（1）MS培养基 为培养烟草细胞而设计。其营养成分的种类和比例较为适宜。无机盐浓度较高，硝酸盐、钾和铵盐的含量比其它培养基高。应用最广泛。主要用于园艺植物、木本植物、花卉、蔬菜等的组织培养。n（2）B5培养基n 为大豆细胞培养而设计的培养基。n 其主要特点是铵的含量较低。n 在豆科植物上应用最多。（3）White培养基n 为番茄根尖培养而设计的培养基。n 该培养基成分比较简单，无机盐和糖的浓度较低。n 适用于生根培养。n（4）KM-8P培养基n 为原生质体培养而设计的培养基。n 其特点是有机成分的种类较全面，包括多种单糖、维生素和有机酸。n 在原生质体培养中广泛应用。n3.植物细胞培养基的配制n（一）母液的配制n 对于经常使用的培养基，为了减少每次配制培养基时称取试剂的麻烦，同时为了减少微量试剂在称量时造成的误差，可先将各种药品配制成10倍或100倍浓度的母液，放入冰箱内保存，用时再按比例稀释。n 母液分大量元素、微量元素、铁盐、有机物、生长调节物质（植物激素）。n 配制各种母液时，药品称量要十分精确。n 配制母液一般用蒸馏水或无离子水，使水中不含或少含某些矿质离子。n（1）大量元素母液：以原用量的10倍配制（1050倍），依次溶解，混合定容1000ml。n（2）微量元素母液：一般配制100倍，定容1000ml，称量时最好用万分之一的电子天平。（3）铁盐母液：配制成100倍浓度，硫酸亚铁和乙二胺四乙酸钠（Na2-EDTA）一般比原用药量扩大100倍，分别溶解后，混合后再螯合30分钟，最后定容1000ml。（4）有机营养母液：是各种维生素和某些氨基酸的混合液。比原用量扩大100倍，定容1000ml。n（5）生长调节物质（植物激素）母液：配制要求更为严格。各种植物激素分别配制成母液，一般浓度为0.51mg/ml。由于大多数植物激素难溶于水，需要先溶于有机溶剂或者酸、碱溶液中，再加水定容到一定的浓度。n 它们的配制方法如下：n生长素类：IAA（吲哚乙酸）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、NAA（萘乙酸）、IBA（吲哚丁酸）为有机酸，制备时用碱液溶解。如一般称25mg IAA，加0.1mol/L NaOH 23ml，溶解后，加水定容25ml，即为IAA 1mg/ml，也可用无水乙醇溶解后定容。n细胞分裂素类：KT（激动素）、BA（苄基腺嘌呤）等，一般用0.1mol/L HCl溶解后加水定容。配制母液注意：配制母液注意：n 配制倍数不宜过高，这样一方面可避免一时用不完造成的浪费，另一方面也可避免倍数过高，吸取量相对少而影响准确性。母液配制好后应放在24冰箱内保存。母液贮备时间不宜过长，尽量作到有计划配制，预期用完为宜。过长时宜出现沉淀和微生物污染。特别是有机物，应存放在冷冻室内较好。n（三）温度的控制n 一般控制在室温范围。n 不能低于20摄氏度，也不高于35摄氏度。n（四）pH值的控制n 微酸性范围。n pH5.0-6.0。n（五）溶解氧的调节控制n 通过通风和搅拌来供给。n（六）光照的控制n 根据植物细胞的特性以及目标次级代谢物的种类不同，进行光照的调节控制。前体是指处于目的代谢物代谢途径上游的物质。（七）前体的添加 为了提高植物细胞培养生产次级代谢物的产量，在培养过程中添加目的代谢物的前体是一种有效的措施。n（八）刺激物的应用n 刺激剂（elecitor）可以促使植物细胞中的物质代谢朝着某些次级代谢物生成的方向进行，从而强化次级代谢物的生物合成，提高某些次级代谢物的产率。四、植物细胞培养产酶的工艺过程 以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例，说明其工艺过程。nSOD的发现和发展现况n 超氧化物歧化酶(SOD)是一种广泛存在于动植物、微生物中的金属酶,它催化超氧阴离子自由基O2-发生歧化反应,从而清除O2-。n 2O2-+2H+SOD H2O2+O2n 自从Mann 和Keilin 于1938 年首次从牛红血球中分离出一种蓝色铜蛋白(最初定名为血铜蛋白Hemocuprein),并由McCord 和Fridovich(1969)根据其酶活特性定名为超氧化物歧化酶以来,人们对它的研究不断深入。SOD具有抗氧化、抗辐射、抗衰老的作用，在消炎，预防衰老，治疗癌症肿瘤的方面都有重要的作用。它能够催化清除超氧基团，有效的防御活性氧对生物体的毒害作用。n 目前国内对SOD 的研究主要集中在应用及与应用直接相关的基础理论的研究上。n SOD 已进入化妆品、食品、医药等领域,SOD 的应用与开发将有不可估量的前景。n 超氧化物歧化酶是广泛存在于动物、植物及微生物细胞的金属酶，至少可分为三种类型:Cu,Zn-SOD、Fe-SOD。该酶系一种酸性蛋白质，较稳定，能耐热。pH7.69时稳定，pH6以下和12以上不稳定，pH2以下极度不稳定。具有较强的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的能力。n 超氧化物歧化酶（SOD）为自由基清除剂。它广泛存在于生物体的各种组织中，能清除自由基O2-（超氧阴离子自由基），而O2-具有细胞毒性，可使脂质过氧化，损伤细胞膜，引起炎症、肿瘤和自身免疫性疾病，并可能促使机体衰老。n SOD可由牛、猪等的红细胞中提取，亦可由菠菜、小白菜、刺梨、酵母、细菌中提取。目前国内外已有SOD的制剂出现，如德国生产的Orgotein为由动物红细胞、肝等分离而得的水溶性CuZnSOD，分子量约为32000。n SOD在食品工业中，作为保健食品的功效因子或食品营养强化剂，该保健品具有良好的抗衰老、抗炎、抗辐射、抗疲劳等保健强身的效果。还可用于延缓衰老、老年斑的消除、癌症的预防等。n 目前已有添加SOD的蛋黄酱、牛奶、可溶性咖啡、啤酒、白酒、果汁饮料、矿泉水、奶糖、酸牛乳、冷饮类等类型的保健食品面市，制成多种剂型的SOD或复合型食品。n 已有SOD胶囊剂、片剂、口服液、脂质体、颗粒剂等形式的SOD保健食品。n SOD可作为罐头食品、果汁、啤酒等的抗氧剂，防止过氧化物酶引起的食品变质及腐败现象。n 此外，还可作为水果、蔬菜的保鲜剂。n 研究证实，SOD添加于化妆品中可起到四方面的作用：n一是有明显的防晒效果；n二是SOD作为抗氧化酶能有效防止皮肤衰老、祛斑、抗皱；n三是有明显的抗炎效果，对防治皮肤病有一定效果；n四是SOD具有一定的防治瘢痕形成的作用。大宝系列产品SOD的现状n 自1969年McCord和Fridovich首次从牛红细胞中分离出超氧化物歧化酶（SOD）以来，SOD的研究就成了生物学的前沿课题之一。人们相继从牛、猪、羊、马等动物红细胞、肌肉、肝脏组织以及植物中分离和纯化出SOD。n 近年来，对SOD在和防治疾病方面的研究取得了很大进展，如用于治疗自身免疫性疾病、炎症、骨髓损伤等。n 目前，对SOD的研究已从抗氧化及抗衰老机制拓展到化妆品、食品和医药等方面的应用，并已开始应用于新一代生物传感器的研究。n 国外已有多种药用SOD应用于临床，主要集中在抗炎、抗辐射、抗肿瘤、抗衰老及由超氧阴离子自由基引发疾病自身免疫性疾病等。n 目前，国内SOD的应用主要集中在食品和化妆品等方面，在吸收机制、质量稳定性、有效性等方面的基础研究取得一些新进展。n 国内现有SOD产品主要是从牲畜血液中提取，发酵法生产还未产业化。n 研究发现植物来源的SOD无抗体干扰，而且从植物中提取来源广，费用低。n 大蒜中SOD含量甚高，超过100毫克/克，是目前发现的植物中含量最高的。1.大蒜愈伤组织的诱导切块，植入MS培养基 消毒 打破休眠 选取大蒜蒜瓣 诱导愈伤组织n2.大蒜细胞悬浮培养n 将上述半固体MS培养基上培养的愈伤组织转入液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，使愈伤组织分散成小细胞团或单细胞。再转入另一液体MS培养基培养。3.超氧化物歧化酶的分离纯化 细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎，用pH7.8的磷酸缓冲液提取、有机溶剂沉淀等，分离得到超氧化物歧化酶。第二节 动物细胞培养产酶一、动物细胞的特性二、动物细胞培养的特点三、动物细胞培养的方式四、动物细胞培养的工艺条件及其控制五、动物细胞培养产酶的工艺过程20世纪60年代迅速发展起来1967年：动物细胞贴壁培养技术1975年：杂交瘤技术（单克隆抗体技术）已经在疫苗、激素、多肽药物、单克隆抗体、酶、皮肤等人体组织、器官等功能性蛋白质的生产中广泛应用。动物细胞培养技术已经成为生物工程研究开发的重要领域。发展史发展史 动物细胞培养主要用于生产下列功能蛋白质：（1）疫苗（2）激素（3）多肽生长因子（4）酶（5）单克隆抗体（6）非抗体免疫调节剂n 抗原上可以引起机体产生抗体的那部分分子结构，叫做抗原决定簇。n 一个抗原上可以有好几个不同的抗原决定簇，因而使机体产生好几种不同的抗体，最终产生出抗体的是浆细胞。n 只针对一个抗原决定簇起作用的浆细胞群就是一个纯系，纯系的英文为Clone，音译就是克隆。n 由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。n 单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。n 另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。一、动物细胞的特性 动物细胞与微生物细胞和植物细胞比较具有下列特性：（1）动物细胞与微生物细胞和植物细胞的最大区别，在于没有细胞壁，细胞适应环境的能力差，显得十分脆弱。（2）动物细胞的体积比微生物细胞大几千倍，稍少于植物细胞的体积。n（3）大部分动物细胞在肌体内相互粘连以集群形式存在，在细胞培养中大部分细胞具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性以及功能全能性。n（4）动物细胞的营养要求较复杂，必须供给各种氨基酸、维生素、激素和生长因子等。动物细胞培养中一般需要加进5%-10%的血清。二、动物细胞培养的特点（1）动物细胞培养主要用于各种功能蛋白质的生产，如疫苗、激素、酶、单克隆抗体、多肽生长因子等。（2）动物细胞的生长较慢，细胞倍增时间15-100h。（3）为了防止微生物污染，在培养过程中，需要添加抗生素。加进的抗生素要能够防治细菌的污染，又不影响动物细胞的生长。现在一般采用青霉素（50-100U/ml）和链霉素（50-100U/ml）联合作用。此外，为了防治支原体的污染，可以采用卡那霉素、金霉素、泰乐菌素等进行处理。（4）动物细胞体积大，无细胞壁的保护，对剪切力敏感，所以在培养过程中，必须严格控制温度、pH值、渗透压、通风搅拌等条件，以免破坏细胞。（5）大多数动物细胞具有锚地依赖性，适宜采用贴壁培养；部分细胞，例如来自血液、淋巴组织的细胞、肿瘤细胞和杂交瘤细胞等，可以采用悬浮培养。n（6）动物细胞培养基成分较复杂，一般要添加血清或其代用品，产物的分离纯化过程较复杂，成本较高，适用于高价值药物的生产。n（7）原代细胞继代培养50代后，即会退化死亡，需要重新分离细胞。n三、动物细胞培养的方式n动物细胞培养方式可以分为两大类：n 一类是来自血液、淋巴组织的细胞，肿瘤细胞和杂交瘤细胞等，可以采用悬浮培养的方式；n 另一类是存在于淋巴组织以外的组织、器官中的细胞，它们具有锚地依赖性，必须依附在带有适当正电荷的固体或半固体物质的表面上生长，要采用贴壁培养。n1.悬浮培养n 对于非锚地依赖性细胞，如杂交瘤细胞、肿瘤细胞以及来自血液、淋巴组织的细胞等，可以自由地悬浮在培养液中生长、繁殖和新陈代谢。细胞悬浮培养瓶细胞悬浮培养瓶n悬浮培养的优点：n 悬浮培养的细胞均匀地分散于培养液中，具有细胞生长环境均一、培养基中溶解氧和营养成分的利用率高、采样分析较准确且重现性好等特点。n悬浮培养的缺点：n 由于动物细胞没有细胞壁，对剪切力敏感，不能耐受强烈的搅拌和通风，对营养的要求复杂故不易满足。动物细胞悬浮培养与微生物培养在动物细胞悬浮培养与微生物培养在反应器的设计及操作、培养基的组成与反应器的设计及操作、培养基的组成与比例、培养工艺条件及其控制等方面都比例、培养工艺条件及其控制等方面都有较大的差别。有较大的差别。n2.贴壁培养n 大多数细胞，如成纤维细胞、上皮细胞等，由于具有锚地依赖性，在培养过程中要贴附在固体表面上生长。n 在反应器中培养时，贴附于容器壁上，原来球形的细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，很快进入旺盛n生长期。滚瓶培养系统滚瓶培养系统优点：优点：结构简单、投资较少、技术结构简单、投资较少、技术成熟、重现性好。成熟、重现性好。缺点：缺点：劳动强度大、细胞生长的表劳动强度大、细胞生长的表面积小、体积产率较低。面积小、体积产率较低。为此，Van Weze在1967年开发了微载体系统微载体系统。滚滚瓶瓶培培养养箱箱n 微载体系统是由葡聚糖凝胶等聚合物制成直径为50-250m、与培养液的密度差不多的微球，动物细胞依附在微球体的表面，通过连续搅拌悬浮于培养液中，呈单层细胞生长繁殖的培养系统。显微镜下的高密度微载体显微镜下的高密度微载体微载体培养微载体培养 微载体系统的显著特点：n（1）微载体的比表面积(S/V,表面积与体积之比)大，单位体积培养液的细胞产率高。n（2）由于微载体悬浮在培养液中，使其具有悬浮培养的优点，即细胞生长环境均一、营养成分利用率高、重现性好等。微载体培养系统现在已经广泛应用于贴壁细胞的大规模培养。四、动物细胞培养的工艺条件及其控制 动物细胞培养首先要准备好优良的种质细胞。用于动物细胞培养的种质细胞主要有体细胞和杂交瘤细胞两大类。n 体细胞的获得方法：从动物体内取出部分组织，在一定条件下用胰蛋白酶消化处理，然后分离得到；n 杂交瘤细胞的获得方法：首先分离肿瘤细胞和免疫淋巴细胞，再在一定条件下将肿瘤细胞和免疫淋巴细胞进行细胞融合，然后筛选得到。将种质细胞用胰蛋白酶消化处理，分散成悬浮细胞将种质细胞用胰蛋白酶消化处理，分散成悬浮细胞动物细胞培养的工艺过程：将悬浮细胞接入适宜的培养液中，在人工控制条件将悬浮细胞接入适宜的培养液中，在人工控制条件的反应器中进行细胞的反应器中进行细胞悬浮培养悬浮培养或或贴壁培养贴壁培养培养完成后，收集培养液，分离纯化得到所需产物培养完成后，收集培养液，分离纯化得到所需产物n（一）动物细胞培养基的组成成分n 动物细胞培养基的组分较为复杂，包括氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖、激素、生长因子等。细胞无血清培养基细胞无血清培养基 普通液体培养基普通液体培养基 n1.氨基酸n 在动物细胞培养中，必须加进各种必需氨基酸（缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸、赖氨酸），以及半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺等。n 其中谷氨酰胺被多数动物细胞作为碳源和能源利用，有些动物细胞则利用谷氨酸。n2.维生素n 动物细胞培养所需的各种维生素，在含血清的培养基中一般由血清提供；在血清含量低的培养基中或者在无血清的培养基中，必需补充B族维生素，有时还补充维生素C。n3.无机盐n 动物细胞培养基中必需添加含有大量元素的无机盐，主要用于调节培养基的渗透压。而微量元素一般由血清提供，在无血清的培养基或血清含量低的培养基中，则需要添加。n4.葡萄糖n 大多数动物细胞培养基中含有葡萄糖，作为碳源和能源使用。n 但是葡萄糖含量较高的培养基在细胞培养过程中容易产生乳酸。n 研究表明，在动物细胞培养中，细胞所需的能量和碳元素来自谷氨酰胺。n5.激素n 动物细胞培养过程中需要胰岛素、生长激素、氢化可的松等激素。n 动物细胞培养所需的激素一般在血清中已经存在，但在低血清或者无血清培养基中必需添加适当的激素。n6.生长因子n 血清中含有各种生长因子，可以满足细胞的需要。n 在无血清或者低血清培养基中，需要添加适量的表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子等。n 人体的血液由有形成分和无形成分组成。白血球、红血球、血小板是有形成分，血清是血液中的无形成分。n 用显微镜可以观察到血液中的白血球、红血球、血小板等有形成分，血清为去除纤维蛋白原后的无形成分，颜色微黄，透亮。n 血清的基本成分是水，水中溶有蛋白质、脂肪、糖、无机盐、维生素等营养成分，也溶有人体代谢产物。n 血清中有抗体，这是被称作免疫球蛋白的蛋白质。小牛血清小牛血清 胎牛血清胎牛血清n（二）动物细胞培养基的配制n 动物细胞培养液的组分复杂，有些组分的含量很低。所以应首先配制各类母液，如100X浓度氨基酸母液、1000X浓度维生素母液、100X浓度葡萄糖母液等。n 在使用前，分别吸取一定体积的母液，混匀得到混合母液，膜过滤除菌后，冷冻备用；n 使用时，取一定体积的混合母液，用无菌的平衡盐溶液稀释至所需浓度。（三）温度的控制 一般控制在36.5摄氏度，允许温度波动范围在0.25摄氏度之内。温度的高低也会影响培养基的pH值，因为在温度降低时，可以增加CO2的溶解度，而使pH值降低。n（四）pH值的控制n 一般控制在pH7.0-7.6的微碱性范围内，因为动物细胞在pH7.4的条件下生长最好。n 在动物细胞培养过程中，随着新陈代谢的进行，培养液的pH值要发生变化，所以要对培养基的pH值进行监测和调节。n 培养基中调节pH值，通常采用CO2和NaHCO3溶液。n 增加CO2的浓度，可使培养液的pH值降低；n 添加NaHCO3溶液，可使pH值升高。n（五）渗透压的控制n 动物细胞培养液中渗透压应当与细胞内的渗透压处于等渗状态。n 一般控制在700-850kPa范围内。n 在配制培养液或者改变培养基成分时，要特别注意。n（六）溶解氧的控制n 溶解氧的供给对动物细胞培养至关重要。n 供氧不足时，细胞生长受到抑制；n 氧气过量时，也会对细胞产生毒害。n 不同的动物细胞对溶解氧的要求各不相同，同一细胞在不同的生长阶段对氧的要求有所差别，细胞密度不同，所要求的溶解氧也不一样。要根据情况随时对溶解氧调节控制。n 一般通过调节进入反应器的混合气体的量及其比例的方法进行溶解氧的调节控制。n 混合气体由空气、氧气、氮气和二氧化碳4种气体组成，n 其中二氧化碳兼有调节供氧和调节pH值的双重作用。五、动物细胞培养产酶的工艺过程 通过动物细胞培养获得的酶主要有胶原酶、纤溶酶原活化剂、尿激酶等。现以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原活化剂为例，说明动物细胞培养产酶的工艺过程及其控制。组织纤溶酶原活化剂是一种丝氨酸蛋白酶，它可以催化纤溶酶原水解，生成纤溶酶。纤溶酶催化血栓中的血纤维蛋白水解，对血栓性疾病有显著疗效。现在国内外应用的都是组织纤溶酶原活化剂。纤溶酶原活化剂根据其结构和特性的不同，可以分为：纤溶酶原活化剂组织纤溶酶原活化剂（tPA）尿激酶纤溶酶原活化剂(uPA)n丝氨酸蛋白酶：如果蛋白酶催化肽键水解的活性中心有丝氨酸残基参与,则称该酶为丝氨酸蛋白酶。1.人黑色素瘤细胞培养基2.人黑色素瘤细胞培养3.组织纤溶酶原活化剂的分离纯化课余复习课余复习酶的生产微生物发酵产酶（第二章）动、植物细胞培养产酶（第三章）