我国蔬菜育种水平与育种技术变化20121023广电.pptx

我国蔬菜育种水平与育种技术变化我国蔬菜育种水平与育种技术变化沈沈 火火 林林中中 国国 农农 业业 大大 学学 蔬蔬 菜菜 系系 是提高蔬菜作物生产水平的关是提高蔬菜作物生产水平的关键因素。键因素。是农业高科技的重要载体。是农业高科技的重要载体。各国都十分重视蔬菜的品种改各国都十分重视蔬菜的品种改良及良种产业化。良及良种产业化。良种：良种：蔬菜规模和效益蔬菜规模和效益 出口中的地位出口中的地位 专业栽培区的形成专业栽培区的形成 蔬菜的生产和繁殖方式蔬菜的生产和繁殖方式:复种指数高、绝大多数是种子繁殖、复种指数高、绝大多数是种子繁殖、F1化，化，价格相对较高。市场容量大约价格相对较高。市场容量大约200-300亿以上。亿以上。加入加入WTO后蔬菜种子产业的全球竞争后蔬菜种子产业的全球竞争第一部分第一部分 我国的蔬菜育种水平我国的蔬菜育种水平 一、国内外蔬菜育种研发体系一、国内外蔬菜育种研发体系 二、国内外差距及问题（品种、技术、管理）二、国内外差距及问题（品种、技术、管理）三、如何提高竞争力三、如何提高竞争力第二部分第二部分 蔬菜育种技术的变化蔬菜育种技术的变化 一、分子育种技术一、分子育种技术 二、细胞工程育种技术二、细胞工程育种技术 第一部分第一部分 我国的蔬菜育种水平我国的蔬菜育种水平一、国内外蔬菜育种研发体系一、国内外蔬菜育种研发体系 基础研究、应用基础研究、应用研究；基础研究、应用基础研究、应用研究；公益性与商业性研究公益性与商业性研究4月月18日公布：日公布：“国务院关于加快推进现代农作物种业发展的意见国务院关于加快推进现代农作物种业发展的意见”-到到2020年，形成科研分工合理、产学研相结合、资源集中、运行高效年，形成科研分工合理、产学研相结合、资源集中、运行高效的育种新机制。的育种新机制。复杂的影响因素：政府的管理与资助体制、目前研发人员知识结构、企复杂的影响因素：政府的管理与资助体制、目前研发人员知识结构、企业能力与意识等。业能力与意识等。育种研究和产业化体系构建育种研究和产业化体系构建1、欧美体系、欧美体系基础理论基础理论:农业部研究中心及下属系统农业部研究中心及下属系统,综合性大学中与植物有关综合性大学中与植物有关的系所；的系所；应用基础理论及育种材料、方法应用基础理论及育种材料、方法:省级大学农学院及各省级农业省级大学农学院及各省级农业科研单位、实验站；科研单位、实验站；商业新品种选育及市场化商业新品种选育及市场化:种子公司（私企）系统为主种子公司（私企）系统为主.但这种分工也不是绝对的（如美国科研经费来源、大学设推广但这种分工也不是绝对的（如美国科研经费来源、大学设推广教授等）教授等）2、计划经济体系、计划经济体系基础理论、应用基础理论及育种材料、方法、商业新品种选育基础理论、应用基础理论及育种材料、方法、商业新品种选育:国家级研究单位、省级研究单位、各个大学；国家级研究单位、省级研究单位、各个大学；品种市场化（繁殖与推广）品种市场化（繁殖与推广）:各级种子公司为主各级种子公司为主.3、中国的体系变化？中国的体系变化？二、国内外差距（品种、技术、管理）二、国内外差距（品种、技术、管理）1 1、体制上的差异（包括管理上）。、体制上的差异（包括管理上）。（研究与商业性分工，但我国正在接轨？）（研究与商业性分工，但我国正在接轨？）2 2、整个产业研发经费投入问题。、整个产业研发经费投入问题。3 3、品种水平差异与多样性关系。、品种水平差异与多样性关系。4 4、企业与经营规模、方式和水平的差异。、企业与经营规模、方式和水平的差异。宏观问题蔬菜育种科研的管理和投入缺乏必要的全局性统一协调和蔬菜育种科研的管理和投入缺乏必要的全局性统一协调和规划，缺乏稳定性；研究队伍偏大，研究内容重复和资源浪费现规划，缺乏稳定性；研究队伍偏大，研究内容重复和资源浪费现象越来越严重。象越来越严重。对蔬菜育种的基础性研究（公益性）重视不够，大多数育对蔬菜育种的基础性研究（公益性）重视不够，大多数育种是低水平重复，缺乏原创性。种是低水平重复，缺乏原创性。急功近利、浮躁现象严重，缺乏必要的长期系统性研究、有急功近利、浮躁现象严重，缺乏必要的长期系统性研究、有重大价值的原创性研究。重大价值的原创性研究。知识产权保护极差，盗用他人材料现象非常普遍，已严重知识产权保护极差，盗用他人材料现象非常普遍，已严重制约育种创新。制约育种创新。部分种子企业缺乏必要的职业道德和民族自信心。部分种子企业缺乏必要的职业道德和民族自信心。宏观问题中国蔬菜品种竞争优势？中国蔬菜品种竞争优势？whatisChinavegetablevarietiesscompetitiveadvantage?部分传统种类或特色类型有优势。部分传统种类或特色类型有优势。如：秋冬大白菜、黄瓜。如：秋冬大白菜、黄瓜。设设施施高高性性能能专专用用品品种种、加加工工品品种种的的竞竞争争力力弱弱(主主要要表表现现在在商商品品品品质质和和产量产量)。近近年年来来国国内内设设施施高高性性能能品品种种有有所所发发展展，但但最最关关键键的的是是如如何何持持久久稳稳定定地地提高竞争力。提高竞争力。种子处理加工技术、种子质量有待提高。（与产业发展水平有关）种子处理加工技术、种子质量有待提高。（与产业发展水平有关）蔬菜种类和类型的多样性、地区的特异性，部分品种无可比性。蔬菜种类和类型的多样性、地区的特异性，部分品种无可比性。Partoftraditionalspeciesorspecialspecieshaveadvantages,suchasChinesecabbageandcucumber.Thecompetitivenessofhigh-performancespecialvarietiesforfacilitiesandprocessingvarietiesisweak,mainlyinqualityandyield.Inrecentyears,high-performancevarietiesforfacilitieshasdeveloped,butthekeyishowtoimprovecompetitivenessstably.Seed processing technology and seed quality need to be improved,which is related to the level ofindustrydevelopment.Varietyofspeciesandtypes,specificityofregionsleadtothatsomespeciesarenotcomparable.设施高性能专用品种在品质和产量上的差异源于设施高性能专用品种在品质和产量上的差异源于:Thedifferencesinqualityandyieldofhigh-performancespecialvarietiesforfacilitiesareasfollowed:连连续生长续生长和和结果能力结果能力 低温弱光逆境耐受性和光合效率低温弱光逆境耐受性和光合效率 单性结实能力单性结实能力 株形与高座果率下株形与高座果率下果实生长的有序调节能力果实生长的有序调节能力 抗病、抗逆性抗病、抗逆性 continuousgrowthandfruitset toleranceoflowtemperatureandlowlight,photosyntheticefficiencytheabilityofparthenocarpyplanttypeandtheabilitytoregulatefruitgrowthwithhighfruitsetdiseaseresistanceandstresstolerance中国蔬菜育种技术水平中国蔬菜育种技术水平TechnologyLevelofChinaVegetableBreeding中国蔬菜育种科研总体上居世界中上水平，中国蔬菜育种科研总体上居世界中上水平，部分领域先进水平，总体上缺少有较大突破部分领域先进水平，总体上缺少有较大突破的原创性成果的原创性成果(育种材料、品种等育种材料、品种等)。Asawhole,Chinavegetablebreedingisbetterthantheaverageintheworld.Insomefieldswehaveachievedtheadvancedlevel.Whilewearelackoforiginalachievementswithmajorbreakthroughssuchasbreedingmaterials,varieties,etc.三、如何提高竞争力？三、如何提高竞争力？1 1、蔬菜育种研究和产业化体系构建、蔬菜育种研究和产业化体系构建2 2、创新与知识产权保护、创新与知识产权保护（政策与法规）（政策与法规）3 3、育种者的素质和观念、育种者的素质和观念（人的因素）（人的因素）4 4、企业的社会责任与创新能力、企业的社会责任与创新能力（包括增强民族自信心）（包括增强民族自信心）5 5、育种设施建设与育种过程、育种设施建设与育种过程（田间条件与育种策略）（田间条件与育种策略）6 6、提高育种技术与育种效率、提高育种技术与育种效率（育种技术）（育种技术）7 7、加强原创性研究、加强原创性研究（育种内容）（育种内容）第二部分第二部分 蔬菜育种技术的变化蔬菜育种技术的变化 传统的常规育种及难点：绝大多产量和品质性状是数量性状；育种周期长，易受环境影响；好的亲本不一定能配出优良的杂交品种；需聚合的性状越来越多？.第二部分第二部分 蔬菜育种技术的变化蔬菜育种技术的变化 分子育种？基因工程 分子标记辅助育种。第二部分第二部分 蔬菜育种技术的变化蔬菜育种技术的变化 基因工程转基因问题？第二部分第二部分 蔬菜育种技术的变化蔬菜育种技术的变化 分子标记辅助育种 正在发挥越来越重要的作用！21遗传标记遗传标记(genetic marker)：可以：可以稳定遗传的、易于识别稳定遗传的、易于识别的特的特殊遗传多态性形式。殊遗传多态性形式。经典遗传学经典遗传学指等位基因的变异指等位基因的变异(差异差异)。现代遗传学现代遗传学指基因组中任何座位上的相对差异指基因组中任何座位上的相对差异或者是或者是DNA序列的差异。序列的差异。一、一、遗传标记的基本类型遗传标记的基本类型遗传标记的概念：遗传标记的概念：221.形态标记形态标记(morphological marker)：能够用肉眼明确观测的一类外观能够用肉眼明确观测的一类外观 特征性状。广义上包括特征性状。广义上包括色素、生理特性、生殖（育性）特性、抗性等。色素、生理特性、生殖（育性）特性、抗性等。优点优点：简单直观、经济方便、容易观察记载等。：简单直观、经济方便、容易观察记载等。缺点缺点：数量少；有些受环境影响：数量少；有些受环境影响大；有些对植株表型影响大，与大；有些对植株表型影响大，与不良性状连锁；在遗传育种中作不良性状连锁；在遗传育种中作用有限等。用有限等。232.细胞学标记细胞学标记(cytological marker)：细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。优点优点：能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位；：能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位；等。等。缺点缺点：数量少；培育细胞学标记材料费时费力；材料：数量少；培育细胞学标记材料费时费力；材料保存难；真正用于遗传育种的少；等。保存难；真正用于遗传育种的少；等。24同工酶同工酶(isozyme)：一个以上基因座位编码的酶的不同形式。一个以上基因座位编码的酶的不同形式。等位酶等位酶(allozyme)：由一个基因座位的不同等位基因编码的：由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式酶的不同分子形式,其功能相同但氨基酸序列不同。其功能相同但氨基酸序列不同。3.生化标记生化标记(biochemical marker)也称为蛋白质标记，是以基因表达的蛋白质产物为主的也称为蛋白质标记，是以基因表达的蛋白质产物为主的一类遗传标记系统，主要包括种子贮藏蛋白、同工酶等。一类遗传标记系统，主要包括种子贮藏蛋白、同工酶等。25缺点缺点：数量少；不同酶标记需要不同的显色方法和技术；：数量少；不同酶标记需要不同的显色方法和技术；某些酶活性具有发育和组织特异性；同工酶标记局限于某些酶活性具有发育和组织特异性；同工酶标记局限于反映基因组编码区的表达信息等。反映基因组编码区的表达信息等。优点优点：表现近中性，对植物经济性状一般没有大的不良：表现近中性，对植物经济性状一般没有大的不良影响；直接反映基因产物的差异，受环境影响较小等。影响；直接反映基因产物的差异，受环境影响较小等。264.DNA标记标记 能反映生物个体或种群能反映生物个体或种群间基因组中某些差异特征的间基因组中某些差异特征的DNA片段，直接反映基因组片段，直接反映基因组DNA间的差异。间的差异。27分子标记分子标记狭义上狭义上:仅指仅指DNA标记，是基因组中任何座位标记，是基因组中任何座位 上的相对差异或者是上的相对差异或者是DNA序列的差异。序列的差异。现在被广泛采纳。现在被广泛采纳。广义上：指可遗传并可检测的广义上：指可遗传并可检测的DNA序列或蛋白序列或蛋白 质，包括生化标记和质，包括生化标记和DNA标记。标记。28DNA标记多态性标记多态性分子基础示意图分子基础示意图二、二、DNA标记的类型及优缺点标记的类型及优缺点29 该标记技术是利用限制性内切酶酶解及凝胶电泳分离不该标记技术是利用限制性内切酶酶解及凝胶电泳分离不同生物体的同生物体的DNA分子，然后用经标记的特异分子，然后用经标记的特异DNA探针与之进探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的的多态性。多态性。1.基于基于DNA-DNA杂交的杂交的DNA标记标记（2）VNTR标记技术标记技术（1）限制性片段长度多态性）限制性片段长度多态性(RFLP)标记技术标记技术（3）荧光原位杂交技术（）荧光原位杂交技术（FISH）30 该技术由该技术由Grodzicker等于等于1974年创立。这种多年创立。这种多态性是由于限制性内切酶酶切位点或位点间态性是由于限制性内切酶酶切位点或位点间DNA区区段发生突变引起的。段发生突变引起的。（1）限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性(RFLP)标记技术标记技术RFLP=Restriction Fragment Length Polymorphism31a.标记的数量几乎是无限的；标记的数量几乎是无限的；b.稳定可靠；稳定可靠；c.共显性共显性，可区分纯合子和杂合子；，可区分纯合子和杂合子；d.无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；e.DNA需要量大，检测技术繁杂，信息量少低，难需要量大，检测技术繁杂，信息量少低，难以用于大规模的育种实践中。以用于大规模的育种实践中。优缺点优缺点32亲本亲本1亲本亲本2F1F2共显性共显性显性显性33a.标记的数量几乎是无限的；标记的数量几乎是无限的；b.稳定可靠；稳定可靠；c.共显性共显性，可区分纯合子和杂合子；，可区分纯合子和杂合子；d.无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；e.DNA需要量大，检测技术繁杂，信息量少低，难需要量大，检测技术繁杂，信息量少低，难以用于大规模的育种实践中。以用于大规模的育种实践中。优缺点优缺点34（2）VNTR标记技术标记技术(已被后来发展的已被后来发展的SSR取代）取代）VNTR=Variable Number of Tandem Repeats35 染色体原位杂交技术染色体原位杂交技术是是DNA探针与染色体上的探针与染色体上的DNA杂交，并杂交，并在染色体上直接进行检测的分子在染色体上直接进行检测的分子标记技术。标记技术。目前发展最快的是荧光素标目前发展最快的是荧光素标记的原位记的原位DNA杂交技术，即荧光杂交技术，即荧光原位杂交技术原位杂交技术(Fluorescence In Situ Hybridization,简称简称FISH技技术术)，是利用与荧光素分子偶联的，是利用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与抗原标记的探针分单克隆抗体与抗原标记的探针分子特异性的结合来检测子特异性的结合来检测DNA序列序列在染色体上的位置。在染色体上的位置。C.荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术36 染色体原位杂交技术比较简便，染色体原位杂交技术比较简便，结果直观。但其灵敏度和分辩率很大结果直观。但其灵敏度和分辩率很大程度上依赖于制片技术和观察设备，程度上依赖于制片技术和观察设备，一般实验室无法满足需要。一般实验室无法满足需要。优缺点优缺点37 PCR技术是一种利用酶促反应对特定技术是一种利用酶促反应对特定DNA片段进行体外扩增的技术，该技术只需非常少片段进行体外扩增的技术，该技术只需非常少量（通常在纳克级范围内）的量（通常在纳克级范围内）的DNA样品，在短样品，在短时间内以样品时间内以样品DNA为模板合成上亿个拷贝。经为模板合成上亿个拷贝。经过电泳分离、染色或放射自显影，即可显示出过电泳分离、染色或放射自显影，即可显示出所扩增的特定所扩增的特定DNA区段。区段。（1）随机引物的）随机引物的PCR标记标记（2）特异引物的）特异引物的PCR标记标记 2.基于基于PCR技术的技术的DNA标记标记38特点特点：所用的引物核苷酸序列是随机的，扩增的：所用的引物核苷酸序列是随机的，扩增的DNA区段是区段是事先未知的，具有随机性和任意性。事先未知的，具有随机性和任意性。（1）随机引物的）随机引物的PCR标记标记主要类型主要类型:u 随机扩增多态性随机扩增多态性 DNA（Randomly Amplified Polymorphic DNAs，RAPD）u 简单序列重复区间扩增多态性（简单序列重复区间扩增多态性（Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR）u 随机引物聚合酶链反应指纹法（随机引物聚合酶链反应指纹法（Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction，AP-PCR）u DNA扩增指纹（扩增指纹（DNA Amplification Fingerprinting，DAF）u 随机扩增微卫星多态性（随机扩增微卫星多态性（Random Amplified Microsatellite Polymorphism，RAMPO）等等等等39RAPD基本原理 RAPD RAPD标记技术是用一个（有时用两个）随标记技术是用一个（有时用两个）随机引物（一般机引物（一般8-108-10个碱基）非定点地扩增基因个碱基）非定点地扩增基因组组DNADNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。遗传材，然后用凝胶电泳分开扩增片段。遗传材料的基因组料的基因组DNADNA如果在特定引物结合区域发生如果在特定引物结合区域发生DNADNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCRPCR产物增加、缺少或发生分子量变化。产物增加、缺少或发生分子量变化。40RAPD主要特点a.不需不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；探针，设计引物也无须知道序列信息；f.显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；c.技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；e.引物价格便宜，成本较低；引物价格便宜，成本较低；g.实验重复性较差，结果可靠性较低。实验重复性较差，结果可靠性较低。b.DNA样品需要量少，对样品需要量少，对DNA质量要求不高；质量要求不高；d.没有种属的特异性，一套引物可用于不同生物的基因组分析；没有种属的特异性，一套引物可用于不同生物的基因组分析；41u 简单重复序列简单重复序列(Simple Sequence Repeat,SSR)u 序列特异性扩增区序列特异性扩增区(Sequence Characterized Amplified Regions,SCAR)u 序列标签位点序列标签位点(Sequence-tagged Site,STS)u 抗病基因类似序列抗病基因类似序列(Resistance Gene Analog,RGA)u 单引物扩增反应单引物扩增反应(Single Primer Amplification Reaction,SPAR)等等等等 特异引物特异引物PCR标记所用的引物是针对已知序列的标记所用的引物是针对已知序列的DNA区段区段而设计的，具有特定核苷酸序列。而设计的，具有特定核苷酸序列。（2）特异引物的）特异引物的PCR标记标记 42SSR标记的基本原理 SSR的基本重复单元是由几的基本重复单元是由几个核苷酸组成的，重复次数一般个核苷酸组成的，重复次数一般为为1050。同一类微卫星。同一类微卫星DNA可可分布在基因组的不同位置上。由分布在基因组的不同位置上。由于基本单元重复次数的不同，而于基本单元重复次数的不同，而形成形成SSR座位的多态性。但每个座位的多态性。但每个SSR座位两侧的座位两侧的DNA序列一般是序列一般是相对保守的单拷贝序列，因此可相对保守的单拷贝序列，因此可根据两侧序列设计一对特异引物根据两侧序列设计一对特异引物来扩增来扩增SSR序列序列 43d.由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。因此其开发有一定困难，费用也较高。a.具有较多的等位性变异；数量丰富，广泛分布于整个具有较多的等位性变异；数量丰富，广泛分布于整个基因组；基因组；b.共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；c.操作简便，实验重复性好，结果可靠；操作简便，实验重复性好，结果可靠；SSR标记的优缺点标记的优缺点44 以限制性酶切和以限制性酶切和PCR技术为基础、将两种技术有机技术为基础、将两种技术有机结合的结合的DNA标记标记,主要有两种主要有两种:（1）扩增片段长度多态性）扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)（2）酶切扩增多态性序列）酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence,CAPS)3.基于限制性酶切和基于限制性酶切和PCR的的DNA标记标记45 通过对基因组通过对基因组DNA酶切片段酶切片段的选择性扩增来检测的选择性扩增来检测DNA酶切片酶切片段长度的多态性。段长度的多态性。（1）扩增片段长度多态性）扩增片段长度多态性46优缺点优缺点a.由于由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；多的；b.典型的典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在分析，每次反应产物的谱带在50-100条之条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；极高；c.表现显性遗传；表现显性遗传；d.分辩率高，结果可靠；分辩率高，结果可靠；e.实验条件要求较高。实验条件要求较高。47 又称又称PCR-RFLP，是，是PCR和和RFLP技术相结合的一种方技术相结合的一种方法。利用已知位点的法。利用已知位点的DNA序序列资源设计一套特异的列资源设计一套特异的PCR引引物，然后用这些引物扩增该位物，然后用这些引物扩增该位点上的某一点上的某一DNA片段，接着片段，接着用一种专一性的限制性内切酶用一种专一性的限制性内切酶切割所得扩增产物，通过凝胶切割所得扩增产物，通过凝胶电泳显示差异。电泳显示差异。PI114490Fla7600OH9242PI114490Fla7600OH9242PI114490OH9242 Fla7600Rx3/BsrB ICT100/Rsa II2B/Rsa I（2）酶切扩增多态性序列（）酶切扩增多态性序列（CAPs）48优缺点优缺点a.引物与限制酶的组合非常多，增加了揭示多态性的引物与限制酶的组合非常多，增加了揭示多态性的机会；机会；b.在真核生物中，在真核生物中，CAPS标记呈共显性；标记呈共显性；c.所需所需DNA量极少；量极少；d.结果稳定可靠；结果稳定可靠；e.操作简单、快捷、自动化程度高；操作简单、快捷、自动化程度高；f.需要已知序列信息。需要已知序列信息。49 通过采用微列阵通过采用微列阵(microarray)或者分析比较序或者分析比较序列而检测到的一种多态性。列而检测到的一种多态性。（1）表达序列标签）表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)（2）单个核苷酸多态性标记）单个核苷酸多态性标记(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)4.基于基于DNA芯片或芯片或DNA序列的标记序列的标记50 所有生物性状都是由结构或功能蛋白决定的，而已知的所有生物性状都是由结构或功能蛋白决定的，而已知的所有蛋白质都是由所有蛋白质都是由RNA聚合酶指导合成的带有多聚聚合酶指导合成的带有多聚A尾巴的尾巴的mRNA编码的，这样就可以将编码的，这样就可以将mRNA通过反转录酶合成通过反转录酶合成cDNA，或根据，或根据mRNA的信息人工合成的信息人工合成cDNA或或cDNA片段，对其进片段，对其进行测序，即得到行测序，即得到EST。主要特点主要特点 与基因直接相关，因此也被称为功能分子标记的一种。与基因直接相关，因此也被称为功能分子标记的一种。这种标记的技术要求和成本都比较高。这种标记的技术要求和成本都比较高。（1）EST标记标记51 由基因组由基因组DNA序列中单个核苷酸序列中单个核苷酸(A,T,G,C)的替换而的替换而引起的多态性。引起的多态性。Sequences aligned by ClustalX 1.80C/TC/T优缺点优缺点a.在大多数基因组中以较高的频率存在，整个基因组范在大多数基因组中以较高的频率存在，整个基因组范围内分布；围内分布；b.绝大部分为两个等位基因；绝大部分为两个等位基因；c.共显性，可区分纯合基因型和杂合基因型；共显性，可区分纯合基因型和杂合基因型；d.可直接对杂交后代进行单体型（可直接对杂交后代进行单体型（haplotype）筛选；）筛选；e.可以自动化检测。可以自动化检测。f.非常稳定可靠；非常稳定可靠；g.需要已知序列，开发成本较高；需要已知序列，开发成本较高；（2）SNP标记标记52三、分子标记应用三、分子标记应用53主要类型的DNA分子标记的技术特点比较 RFLPRAPDSSRAFLPSNP基因组分布低拷贝编码序列低拷贝编码序列整个基因组整个基因组整个基因组整个基因组整个基因组整个基因组整个基因组整个基因组遗传特点共显性共显性多数显性多数显性共显性共显性显性显性/共显性共显性共显性共显性多态性中等中等较高较高高高较高较高高高检测基因座位数1-31-10多数为多数为120-2001探针/引物类型gDNA或或cDNA特异性低拷贝探针特异性低拷贝探针9-10bp随机引物随机引物14-16bp特异引物特异引物16-20bp特异引物特异引物16-30bp特异引物特异引物DNA质量要求高高低低中等中等高高中等中等DNA用量2-10g10-25ng2-5ng2-5g2-5ng技术难度高高低低低低中等中等中等中等-高高同位素通常用通常用不用不用可不用可不用不用不用不用不用可靠性高高低低/中等中等高高高高高高耗时多多少少少少中中少少成本高高较低较低中等中等较高较高较高较高54蔬菜：白菜类蔬菜蔬菜：白菜类蔬菜、番、番茄、茄子茄、茄子、葱、黄瓜、葱、黄瓜、芥菜、甜瓜等芥菜、甜瓜等果树：刺梨、龙眼、荔果树：刺梨、龙眼、荔枝、猕猴桃、核桃、杏、枝、猕猴桃、核桃、杏、梨等梨等花卉：花卉：美人美人梅、牡梅、牡丹、蔷薇属植物、玉兰、丹、蔷薇属植物、玉兰、香石竹等香石竹等（一）种质资源的遗传多样性评价（一）种质资源的遗传多样性评价55核心种质核心种质(core collection)：核心库是以最少数量的资源材料包含一个物种及其野核心库是以最少数量的资源材料包含一个物种及其野生、近缘种的最大限度的遗传多样性。通过对随机分布于生、近缘种的最大限度的遗传多样性。通过对随机分布于整个基因组的标记的多态性进行比较分析，能够全面评估整个基因组的标记的多态性进行比较分析，能够全面评估研究对象的多态性，并揭示其遗传本质。研究对象的多态性，并揭示其遗传本质。56（二）指纹图谱构建和品种鉴定（二）指纹图谱构建和品种鉴定 园艺植物品种数量繁多，品种名称和地方俗园艺植物品种数量繁多，品种名称和地方俗名混用，加之从国外引入品种的音译名不规范，名混用，加之从国外引入品种的音译名不规范，造成大量同物异名及同名异物现象，给品种资源造成大量同物异名及同名异物现象，给品种资源的收集、分类、保存和利用造成一定困难，品种的收集、分类、保存和利用造成一定困难，品种DNA指纹图谱的建立可作为新品种登记注册和知指纹图谱的建立可作为新品种登记注册和知识产权保护的重要依据。识产权保护的重要依据。57 所谓所谓DNA指纹图谱，是指纹图谱，是指一个个体特有的指一个个体特有的DNA结构结构或序列所产生的图谱。或序列所产生的图谱。DNA指纹具有下述特点：指纹具有下述特点：高度的特异性高度的特异性 稳定的遗传性稳定的遗传性 体细胞稳定性体细胞稳定性58（三）分子遗传图谱的构建（三）分子遗传图谱的构建 遗传连锁图遗传连锁图是指以染色体重是指以染色体重组交换率为相对长度单位，以遗组交换率为相对长度单位，以遗传标记为主体，通过遗传重组分传标记为主体，通过遗传重组分析得到的基因在染色体上的线性析得到的基因在染色体上的线性排列图。排列图。苹果、桃、杏、葡萄、番茄、苹果、桃、杏、葡萄、番茄、甘蓝、白菜、甜（辣）椒和甘蓝、白菜、甜（辣）椒和黄瓜等。黄瓜等。59（四）基因定位（四）基因定位 基因定位基因定位就是筛选与目的基因紧密连锁或共分离的就是筛选与目的基因紧密连锁或共分离的遗传标记遗传标记,它是分子标记辅助选择育种和基因克隆的前提。它是分子标记辅助选择育种和基因克隆的前提。u 抗病基因抗病基因u 与代谢相关的基因与代谢相关的基因u 与抗逆相关的基因与抗逆相关的基因u 雄性不育基因雄性不育基因u 自交不亲和基因自交不亲和基因u 与发育相关的基因与发育相关的基因60u 抗病基因抗病基因:Pto（番茄斑点病抗性基因）（番茄斑点病抗性基因）u 与代谢相关的基因与代谢相关的基因u 与抗逆相关的基因与抗逆相关的基因u 雄性不育基因雄性不育基因u 自交不亲和基因自交不亲和基因u 与发育相关的基因与发育相关的基因 图位克隆图位克隆(map-based cloning)是根据功能基因在基是根据功能基因在基因组中有相对稳定的基因座位，在利用分子标记技术对因组中有相对稳定的基因座位，在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上，用与目的基因紧密连目的基因进行精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选大片段锁的分子标记筛选大片段DNA文库，从而构建目的基文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，在利用此物理图谱通过染色体步查因区域的物理图谱，在利用此物理图谱通过染色体步查(chromosomal walking)逐步逼近目的基因或通过染色体逐步逼近目的基因或通过染色体登陆登陆(chromosomal landing)的方法最终找到包含该目的的方法最终找到包含该目的基因的克隆。基因的克隆。（五）图位克隆（五）图位克隆61园艺作物中已经克隆的部分基因园艺作物中已经克隆的部分基因621.作物作物MAS育种需具备的条件育种需具备的条件分子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要求分子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要求两者间的遗传距离小于两者间的遗传距离小于5cM，最好，最好1cM或更小。或更小。具有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手段，具有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手段，目前，主要应用自动化程度高，相对易于分析，且成目前，主要应用自动化程度高，相对易于分析，且成本较小的本较小的PCR技术。技术。筛选技术在不同实验室间重复性好，且具有经济、筛选技术在不同实验室间重复性好，且具有经济、易操作的特点。易操作的特点。应有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计算应有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计算机数据处理软件。机数据处理软件。（六）标记辅助选择（六）标记辅助选择632.MAS育种方法育种方法正向选择正向选择前景选择前景选择反向选择反向选择背景选择背景选择A B F1 F2亲本亲本A亲本亲本BXF1自交自交F2电泳条带电泳条带643.提高分子标记的筛选效率提高分子标记的筛选效率(1)多重多重PCR方法方法(2)用相斥相分子标记进行育种选择用相斥相分子标记进行育种选择(3)克服连锁累赘克服连锁累赘(4)降低降低MAS育种的成本育种的成本65（1）可以清除同一座位不同等位基因间或不同座位间互作的）可以清除同一座位不同等位基因间或不同座位间互作的干扰，消除环境的影响；干扰，消除环境的影响；（3）可有效地对表型鉴定十分困难的性状进行鉴定；）可有效地对表型鉴定十分困难的性状进行鉴定；（6）加速回交育种进程，克服不良性状连锁，有利于导入远）加速回交育种进程，克服不良性状连锁，有利于导入远缘优良基因。缘优良基因。（5）可同时对多个性状进行选择，开展聚合育种，快速完成）可同时对多个性状进行选择，开展聚合育种，快速完成对多个性状的同时改良；对多个性状的同时改良；（4）共显性标记可区分纯合体和杂合体，不需下代再鉴定；）共显性标记可区分纯合体和杂合体，不需下代再鉴定；（2）在幼苗阶段就可以对在成熟期表达的性状进行鉴定，如）在幼苗阶段就可以对在成熟期表达的性状进行鉴定，如果实性状、雄性不育等；果实性状、雄性不育等；4.分子标记辅助选择的优点分子标记辅助选择的优点 66（七）品种纯度鉴定（七）品种纯度鉴定 利用分子标记技术进行园艺植物品种纯利用分子标记技术进行园艺植物品种纯度鉴定，不受环境、取材部位、时间等条度鉴定，不受环境、取材部位、时间等条件的限制件的限制,其检测位点遍及整个基因组其检测位点遍及整个基因组,多多态性高、准确、快速、信息量大，可以区态性高、准确、快速、信息量大，可以区分出形态标记难以鉴别的细微差别。分出形态标记难以鉴别的细微差别。67（八）遗传稳定性检测（八）遗传稳定性检测681.质量性状基因的定位质量性状基因的定位质量性状定义：在分离群体中表现为不连续性变异、能质量性状定义：在分离群体中表现为不连续性变异、能够明确分组的性状。够明确分组的性状。数量性状定义：在分离群体中表现为连续性变异不能数量性状定义：在分离群体中表现为连续性变异不能够明确分组的性状。够明确分组的性状。数量性状基因座数量性状基因座(quantitative trait loci,QTL)作图：确定作图：确定数量性状位点基因与分子标记间的连锁关系。数量性状位点基因与分子标记间的连锁关系。分子标记辅助选择和聚合育种！分子标记辅助选择和聚合育种！甜瓜雌性系甜瓜雌性系MAS获得雌性株的思路：获得雌性株的思路：二对基因遗传观点：二对基因遗传观点：A、a：A两性花植株上产生雌花的基因，两性花植株上产生雌花的基因，a是不产生雌花是不产生雌花的等位基因。的等位基因。AA和和Aa的个体上有雌花形成，而的个体上有雌花形成，而aa上只产生上只产生两性花。两性花。（对（对G上位）上位）G、g：G两性花植株上产生雄花的基因，两性花植株上产生雄花的基因，g是不产生雄花的是不产生雄花的等为基因。等为基因。GG和和Gg基因型植