发酵机制.pptx

按照产物与微生物生长繁殖的关系分成：按照产物与微生物生长繁殖的关系分成：初级代谢产物的代谢机制 次级代谢产物的代谢机制按照发酵过程（微生物获取能量的形式）按照发酵过程（微生物获取能量的形式）分成：分成：好氧代谢机制（通风发酵）嫌气代谢机制（厌气发酵）葡萄糖代谢的三个阶段葡萄糖代谢的三个阶段第一、葡萄糖进入细胞内第一、葡萄糖进入细胞内第二、葡萄糖代谢为三碳糖第二、葡萄糖代谢为三碳糖四条途径：四条途径：EMP、PPP（HMP）、）、ED、PK第三、有氧条件下三糖彻底氧化（第三、有氧条件下三糖彻底氧化（丙丙酮酸氧化脱酸氧化脱羧和和三三羧酸循酸循环）无氧条件下继续降解并形成不同代谢产物无氧条件下继续降解并形成不同代谢产物葡萄糖葡萄糖经酵解途径生成丙酵解途径生成丙酮酸：酸：l此此阶段在段在细胞胞胞液胞液(cytoplasm)(cytoplasm)中中进行，一分行，一分子葡萄糖子葡萄糖(glucose)(glucose)分解后分解后净生成生成2 2分子丙分子丙酮酸酸(pyruvate)(pyruvate)，2 2分子分子ATPATP，和，和2 2分子（分子（NADH NADH+H+H+）。）。糖酵解途径广泛存在于各种细胞糖酵解途径广泛存在于各种细胞中，它的任何一个反应均不需要氧。中，它的任何一个反应均不需要氧。1.1.活化活化(activation)(activation)己糖磷酸己糖磷酸酯的生成：的生成：l活活化化阶段段是是指指葡葡萄萄糖糖经磷磷酸酸化化和和异异构构反反应生生成成1,6-1,6-双双磷磷酸酸果果糖糖(FBP(FBP，FDP)FDP)的的反反应过程。程。该过程共由三步化学反程共由三步化学反应组成。成。己糖激酶己糖激酶/葡萄糖激酶葡萄糖激酶磷酸己糖异构酶磷酸己糖异构酶磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶ATPADPATPADP*(1)(2)(3)葡萄糖葡萄糖磷酸化磷酸化生成生成6-6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖 G-6-PG-6-P异构异构为6-6-磷酸果糖磷酸果糖 F-6-PF-6-P再磷酸化再磷酸化为 1,6-1,6-双磷酸果糖双磷酸果糖2.2.裂解（裂解（lysis)lysis)磷酸丙糖的生成磷酸丙糖的生成：l一分子一分子F-1,6-BPF-1,6-BP裂解裂解为两分子两分子可以互可以互变的磷的磷酸丙糖（酸丙糖（triose phosphate)triose phosphate)，包括两步反，包括两步反应：磷酸丙糖异构酶磷酸丙糖异构酶醛缩酶醛缩酶(4)(5)F-1,6-BP F-1,6-BP 裂解裂解为3-3-磷酸甘油磷酸甘油醛和磷酸二和磷酸二羟丙丙酮 磷磷酸酸二二羟丙丙酮异异构构为3-3-磷磷酸酸甘甘油油醛3.3.放能放能(releasing energy(releasing energy丙丙酮酸酸的生成：的生成：l3-3-磷酸甘油磷酸甘油醛经脱脱氢、磷酸化、脱、磷酸化、脱水及放能等反水及放能等反应生成丙生成丙酮酸，包括酸，包括六步反六步反应。(6)(7)(8)ATPADP磷酸甘油酸变位酶磷酸甘油酸变位酶3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛脱氢酶脱氢酶磷酸甘油酸磷酸甘油酸激酶激酶NAD+PiNADH+H+3-3-磷酸甘油磷酸甘油醛脱脱氢并磷酸化并磷酸化生成生成1,3-1,3-二磷酸甘油酸二磷酸甘油酸 1,3-1,3-二磷酸甘油酸二磷酸甘油酸脱磷酸脱磷酸,将其交将其交给ADPADP生成生成ATPATP 3-3-磷酸甘油酸磷酸甘油酸异构异构为2-2-磷酸甘油酸磷酸甘油酸 烯醇化酶烯醇化酶丙酮酸激酶丙酮酸激酶*ATPADP自发自发H2O 2-2-磷磷酸酸甘甘油油酸酸脱脱水水生生成成磷磷酸酸烯醇醇式式丙丙酮酸（酸（PEPPEP）磷磷酸酸烯烯醇醇式式丙丙酮酮酸酸将将高高能能磷磷酸酸基基交交给给ADP生成生成ATP 烯醇式丙酮酸自发烯醇式丙酮酸自发转变转变为丙酮酸为丙酮酸SummariesSummariesl糖酵解代谢途径可将一分子葡萄糖分解为两分子丙酮酸，净生成两分子ATP。lC6H12O6+2ADP+2Pi+2NAD+2CH3COCOOH+2ATP+2NADH+2H+l糖酵解代谢途径有三个关键酶，即己糖激酶（葡萄糖激酶）、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶。三个激酶是糖酵解途径的主要调节点。三个激酶是糖酵解途径的主要调节点。糖代谢的调节主要是能荷的控制，即受细糖代谢的调节主要是能荷的控制，即受细胞内能量水平的控制。胞内能量水平的控制。当体系中当体系中ATP含量高时，磷酸果糖激酶和含量高时，磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性受到抑制，酵解减少。丙酮酸激酶的活性受到抑制，酵解减少。当需能反应加强，当需能反应加强，ATP分解，减少，其抑分解，减少，其抑制作用解除，同时制作用解除，同时ADP、AMP激活己糖激激活己糖激酶和磷酸果糖激酶，而这两个酶催化的产酶和磷酸果糖激酶，而这两个酶催化的产物同时又是丙酮酸激酶的激活剂，结果时物同时又是丙酮酸激酶的激活剂，结果时糖酵解加快。糖酵解加快。l糖糖的的无无氧氧酵酵解解（glycolysis)glycolysis)是是指指葡葡萄萄糖糖经经EMPEMP途途径径生生成成丙丙酮酮酸酸后后，在在无无氧氧条条件件下下继继续续降降解解并并释放放出出能能量的量的过程程。NADHNADH2 2在在此此过过程程中中将将氢氢交交给给不不同同的的有有机机物物，形形成成各各种种不不同同的的代代谢谢产产物物（在在不不同同的的微微生生物物机机体体和和不不同同条条件件下下，H H2 2的受体不同，因而丙酮酸的去路也不同的受体不同，因而丙酮酸的去路也不同）。第一节第一节 糖嫌气性发酵产物积累机制糖嫌气性发酵产物积累机制 葡萄糖葡萄糖 EMP 乙醇乙醇乙醛乙醛 丙酮酸丙酮酸 乳酸乳酸 乙酰乙酰CoA 乙酰乙酸乙酰乙酸CoA 乙酰乙酸乙酰乙酸 乙酰乙酰CoA 丙酮丙酮 丁酸丁酸 异丙醇异丙醇 丁醇丁醇二、酒精发酵机制酵母的酒精发酵（EMP途径，酵母菌的型发酵）C6H12O6+2ADP+2H3PO42C2H5OH+2CO2+2ATP细菌的酒精发酵(假单胞菌，ED途径）C6H12O6+ADP+H3PO42C2H5OH+2CO2+ATP两者途径不同，产能水平也不同 在在好好氧氧条条件件下下，酵酵母母的的发发酵酵能能力力降降低低，即即由由于于呼呼吸吸作作用用的的进进行行使使酒酒精精产产量量大大为为降降低低。其其机机理理是是因因为为酵酵解解过过程程的的控控制制受受末末端端产产物物ATPATP的的反反馈馈控控制制，即即有有氧氧时时，由由于于酵酵解解产产生生的的NADHNADH和和丙丙酮酮酸酸进进入入线线粒粒体体而而产产生生大大量量ATPATP ，ATPATP控控制制酵酵解解途途径径关关键键酶酶磷磷酸酸果果糖糖激激酶酶的的活活性性，最最后后抑抑制制葡葡萄萄糖糖进进入入细细胞胞内内，导导致致葡葡萄萄糖糖利利用用降降低低。同同时时在在好好氧氧条条件件下下，丙丙酮酮酸酸激激酶酶活活性性也也由由于于磷磷酸酸果果糖糖激激酶酶活活性性降降低低而而降降低低，从从而而降降低低糖糖的的酵酵解解速速度度。即巴斯德效应即巴斯德效应巴斯德效应巴斯德效应（Pasteur Effect）请掌握此概念请掌握此概念酒精发酵中副产物的形成酒精发酵中副产物的形成 杂杂醇醇油油(高高级级醇醇）的的生生成成 杂杂醇醇油油是是碳碳原原子子数数大大于于2的的脂脂肪肪族族醇醇类类的的统统称称。主主要要由由正正丙丙醇醇、异异丁丁醇醇、异异戊戊醇醇和和活活性性戊戊醇醇（2-甲甲基基-1-丁丁醇醇）组组成成。这这些些高高级级醇醇是是构构成成酒酒类类风风味味的的重重要要组组成成物物质质之之一一，量量虽虽少少，但但影影响响很很大大，当当其其过过量量时时会会影影响响产产品品质质量量，需需予予以以控控制制。其其生生成成机机制制如如下：下：A氨基酸的氧化脱氨作用氨基酸的氧化脱氨作用 B由葡萄糖直接生成由葡萄糖直接生成 酵酵母母通通过过糖糖代代谢谢生生成成的的中中间间产产物物-酮酮酸酸，再再经经脱脱羧、加氢形成少一个碳原子的高级醇。羧、加氢形成少一个碳原子的高级醇。杂醇油的形成还受酵母菌种、培养基组成和发杂醇油的形成还受酵母菌种、培养基组成和发酵条件的影响。酵条件的影响。三、乳酸三、乳酸(Lacticacid)发酵机制发酵机制化学名称化学名称:-羟基丙酸。羟基丙酸。1同型乳酸发酵同型乳酸发酵主要微生物：乳酸链球菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌，主要微生物：乳酸链球菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌，工业上多用后者为菌种。工业上多用后者为菌种。这种发酵对糖的理论转化率为这种发酵对糖的理论转化率为100%。2异型乳酸发酵异型乳酸发酵 主要微生物主要微生物:肠膜明串珠菌、短乳杆菌和真菌的根霉。肠膜明串珠菌、短乳杆菌和真菌的根霉。分分、两种类型，两种类型，型对糖的理论转化率为型对糖的理论转化率为50%。型型型型型为双歧途径，即由两歧双歧杆菌分解葡萄生型为双歧途径，即由两歧双歧杆菌分解葡萄生成乳酸的途径。双歧杆菌为严格厌氧菌，对营养要成乳酸的途径。双歧杆菌为严格厌氧菌，对营养要求较高。求较高。第二节第二节 柠檬酸发酵机制柠檬酸发酵机制一、一、概况概况柠柠檬檬酸酸是是一一种种重重要要的的有有机机酸酸，化化学学名名称称为为3-羟羟基基3-羧羧基基戊二酸，其结构式为：戊二酸，其结构式为：柠檬酸发酵的总反应式：2C6H12O6+3CO2 2C6H8O7+4H2O理论转化率106.7%,实际转化率8090%,产酸12 14%,发酵时间60 80 hr.1.发酵菌种:黑曲霉(Asp.niger)和解脂假丝酵母(Candida lipolytica)2.发酵原料:糖蜜、薯干粉（木薯粉）、葡萄糖母液、玉米（小麦）淀粉（TD-01）、玉米粉（Co827）必须解决的两个问题：柠檬酸的代谢途径及其引起的反馈调节是怎样进行的？什么机制可以造成柠檬酸积累？二、柠檬酸生物柠檬酸生物合成途径合成途径黑曲霉柠檬酸发酵机制黑曲霉柠檬酸发酵机制1.由于严格限制供给锰离子等金属离子由于严格限制供给锰离子等金属离子,或筛选高浓度锰离子、或筛选高浓度锰离子、锌离子等菌株，降低菌体中糖代谢合成蛋白质、脂肪酸和核酸锌离子等菌株，降低菌体中糖代谢合成蛋白质、脂肪酸和核酸的能力，细胞中氨离子水平增高以及不产的能力，细胞中氨离子水平增高以及不产ATP的侧系呼吸链解的侧系呼吸链解除对磷酸果糖激酶的反馈抑制，除对磷酸果糖激酶的反馈抑制，EMP代谢流量增大；代谢流量增大；2.组成型的丙酮酸羧化酶不受代谢调节组成型的丙酮酸羧化酶不受代谢调节,保证了草酰乙酸的提供保证了草酰乙酸的提供,丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶A和二氧化碳固定的平衡保证和二氧化碳固定的平衡保证了前体的供应了前体的供应;柠檬酸合成酶不受调节增强了柠檬酸的合成能柠檬酸合成酶不受调节增强了柠檬酸的合成能力力;3.顺乌头酸水合酶建立的柠檬酸顺乌头酸水合酶建立的柠檬酸:顺乌头酸顺乌头酸:异柠檬酸异柠檬酸=90:3:7的的催化平衡趋向柠檬酸的合成催化平衡趋向柠檬酸的合成,柠檬酸浓度的增加抑制柠檬酸脱柠檬酸浓度的增加抑制柠檬酸脱氢酶的活力氢酶的活力,促进了柠檬酸的积累促进了柠檬酸的积累,pH降低至降低至2.0使顺乌头酸水使顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活合酶和异柠檬酸脱氢酶失活,更有利于柠檬酸的积累和排除更有利于柠檬酸的积累和排除.一、概述一、概述1 1氨基酸的生产概况氨基酸的生产概况生产氨基酸的大国为日本和德国。日本的味之素、协和发酵及德国的迪高沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。日本在全球很多国家建立了合资的氨基酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。中国目前的情况：谷氨酸、赖氨酸、其他氨基酸。河南莲花味精、山东菱花味精、江苏菊花味精、广东奥桑味精、沈阳红梅味精川化味之素第三节第三节 氨基酸氨基酸(Amino acid)发酵生产发酵生产河南省莲花味精股份有限公司广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 2氨基酸的生产方法氨基酸的生产方法（1）抽抽提提法法（蛋蛋白白质质水水解解法法）:将将动动物物蛋蛋白白质质原原料料用用酸酸水水解解，经经离离子子交交换换法法处处理理，将将所所需需氨氨基基酸酸分分离离提提取。取。（2）化化学学合合成成法法：采采用用化化工工原原料料合合成成生生产产氨氨基基酸酸的的方方法。法。（3）发酵法：）发酵法：利用微生物发酵生产利用微生物发酵生产L-氨基酸氨基酸的方法。的方法。（4）酶酶法法：利利用用从从菌菌体体中中提提取取的的酶酶将将有有机机物物转转变变成成所所需要的需要的L-氨基酸的方法。氨基酸的方法。（5）添添加加前前体体法法：利利用用微微生生物物发发酵酵氨氨基基酸酸的的前前体体物物质质生产氨基酸的方法。生产氨基酸的方法。3氨基酸的用途氨基酸的用途 饲料用氨基酸饲料用氨基酸 食品用氨基酸食品用氨基酸生物降解材料生物降解材料 化妆品领域化妆品领域 医用氨基酸医用氨基酸二、谷氨酸发酵机制二、谷氨酸发酵机制谷氨酸化学名称为谷氨酸化学名称为-氨基戊二酸，结构式为：氨基戊二酸，结构式为：（一）、谷谷氨氨酸酸生生物物合合成成途途径径及调节机制及调节机制（二）、细胞膜的通透性与谷氨酸的积累（二）、细胞膜的通透性与谷氨酸的积累谷谷氨氨酸酸从从菌菌体体内内向向外外排排出出的的控控制制因因子子主主要要有有生生物物素素、油油酸、表面活性剂酸、表面活性剂等。等。生生物物素素作作为为一一种种生生长长因因子子，是是脂脂肪肪酸酸生生物物合合成成中中乙乙酰酰CoA羧羧化化酶酶的的辅辅酶酶，参参与与了了脂脂肪肪酸酸的的合合成成。当当生生物物素素不不足足时时，则则不不利利于于不不饱饱和和脂脂肪肪酸酸的的合合成成，从从而而造造成成细细胞胞膜膜成成分分磷磷脂脂的的不不足足，使使细细胞胞膜膜结结构构组组成成不不完完全全，因因而而增增加加了了细细胞胞膜膜的的通通透透性性，有有利利于于谷谷氨氨酸酸渗渗出出膜膜外外。因因此此利利用用生生物物素素缺缺陷陷型型，限限量量供给生物素（亚适量）时，细胞膜对谷氨酸有良好的通透性。供给生物素（亚适量）时，细胞膜对谷氨酸有良好的通透性。生物素丰富时，添加生物素丰富时，添加表面活性剂、高级脂肪酸表面活性剂、高级脂肪酸可抑制不饱可抑制不饱和脂肪酸的合成，造成细胞膜透性的增加。另外添加和脂肪酸的合成，造成细胞膜透性的增加。另外添加青霉素青霉素也可使细胞膜在失去细胞壁保护后发生损伤而造成通透。也可使细胞膜在失去细胞壁保护后发生损伤而造成通透。小结：小结：从菌的生理特征上，谷氨酸产生菌应具备的条件：从菌的生理特征上，谷氨酸产生菌应具备的条件：生物素缺陷型，细胞膜对谷氨酸的通透性好生物素缺陷型，细胞膜对谷氨酸的通透性好CO2固定酶活性强，丙酮酸脱羧酶活性不能太强固定酶活性强，丙酮酸脱羧酶活性不能太强-酮戊二酸脱氢酶的活性微弱或缺损酮戊二酸脱氢酶的活性微弱或缺损谷谷氨氨酸酸脱脱氢氢酶酶活活力力高高（此此活活性性不不被被低低浓浓度度产产物物谷谷氨氨酸酸所所抑制）抑制）NADPH+H+进入呼吸链能力弱进入呼吸链能力弱异柠檬酸裂解酶活性不能太强，异柠檬酸脱氢酶活性强异柠檬酸裂解酶活性不能太强，异柠檬酸脱氢酶活性强谷氨酸发酵研究新进展继续选育各种生化突变菌株：转化率提高，或可在富含生物素的培养基中保持较高产酸水平。提高原料利用率，拓宽原料来源或简化操作工艺。生物工程新技术的应用：体外DNA重组的基因工程和原生质体融合技术和固定化细胞技术使产量提高近1倍。改进发酵工艺：开拓原料，改进流加工艺，通过电子计算机控制发酵条件。天冬氨酸族氨基酸生物合成途径 1：天冬氨酸激酶；2：高丝氨酸脱氢酶3：二氢吡啶-2，6-二羧酸合成酶；4：高丝氨酸激酶；5：-琥珀酰-高丝氨酸转琥珀酰酶；6：半胱氨酸脱硫化氢酶；7：苏氨酸脱氢酶；8：天冬氨酸半醛脱氢酶；9：二氢吡啶-2，6-二羧酸还原酶 赖氨酸发酵机制 赖氨酸发酵菌种的选育 如再选育丙氨酸缺陷型，抗天冬氨酸结构类似物突变株，谷氨酸敏感等突变株，增加前体物的生物合成，选育亮氨酸缺陷型，抗亮氨酸结构类似物突变株，解除代谢互锁（DDP合成酶的合成受亮氨酸的阻遏，DDP还原酶受半光氨酸和丙氨酸的抑制），赖氨酸的产量还会增加。苏氨酸发酵菌种的选育 氨基酸发酵代谢控制所采取措施1、控制发酵的环境条件2、控制细胞渗透性3、控制旁路代谢 4、降低反馈作用物的浓度 5、消除终产物的反馈抑制与阻遏作用 6、促进ATP的积累，以利于氨基酸的生物合 成（氨基酸的生物合成需要能量，ATP的积累可促进氨基酸的生物合成）谷氨酸产生菌因环境条件改变引起的发酵转换 谷氨酸发酵（专性需氧菌）必须严格控制菌体生长的环境条件，否则就几乎不积累谷氨酸 第四节第四节 菌种改造的策略及措施菌种改造的策略及措施高产菌种的代谢特点：高产菌种的代谢特点：1 1表示胞内代谢网络中通向目的产物的途径畅通表示胞内代谢网络中通向目的产物的途径畅通 2 2该途径与环境的该途径与环境的“接口接口”宽畅宽畅策略：进、通、节、堵、出策略：进、通、节、堵、出进：进：促进细胞对碳源等营养物质的吸收。促进细胞对碳源等营养物质的吸收。通：通：解除对途径中某些酶的反馈调节，解除对途径中某些酶的反馈调节，或者诱导或激活这些酶，从而使来自各或者诱导或激活这些酶，从而使来自各个分支的碳架物质能畅通地流向目的产个分支的碳架物质能畅通地流向目的产物。物。节：节：阻塞与目的产物的形成无关或关系不阻塞与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流大的代谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产物。向目的产物。堵：堵：消除或削弱目的产物进一步代谢的途消除或削弱目的产物进一步代谢的途径。径。出：出：促进目的产物向胞外空间分泌。促进目的产物向胞外空间分泌。