DB 6108_T 56—2023《马铃薯脱毒试管苗生产技术规程》.pdf

ICS 65.020CCS B05DB6108榆林市地方标准DB6108/T 562023马铃薯脱毒试管苗生产技术规程2023-06-02 发布2023-07-02 实施榆林市市场监督管理局发 布DB6108/T 5620231DB6108/T 562023I前言本文件按照 GB/T1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由榆林市农业农村局提出并归口。本文件起草单位：榆林市农业科学研究院、定边县科发马铃薯良种繁育有限责任公司。本文件主要起草人：张艳艳，张春燕，童霄丽，方玉川，杜清荣，张媛媛，白艳艳，拓小波，张强，陈丽娟，李东东，薛伟，薛皎，闫陆飞，高慧，王毛毛，韩芬，付永飞，朱继宇，贺海军，王彦梅，胡晓燕，白延生，乔文渊，李小娟，张蓉蓉，刘小林。本文件由榆林市农业科学研究院负责解释。本文件为首次发布。联系信息如下：单位：榆林市农业科学研究院电话：[phone]邮箱地址：地址：陕西省榆林市榆阳区上郡南路14号邮编：719000DB6108/T 5620231马铃薯脱毒试管苗生产技术规程1范围本文件规定了马铃薯脱毒试管苗生产的车间建设、脱毒流程、试管苗繁育、档案建立。本文件适用于榆林市马铃薯脱毒试管苗生产。2规范性引用文件下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 3095环境空气质量标准GB/T 29375-2012马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程GB 50073-2001洁净厂房设计规范NY/T 401-2000脱毒马铃薯种薯(苗)病毒检测技术规程3术语和定义GB/T 293752012规定的术语和定义适用于本文件。4生产车间建设4.1立地条件选址可按照GB 50073-2001中4.1的规定执行，宜建在供电稳定、四周空气流通较好，自然光源充足，没有空气污染和水源污染的地域。4.2车间布局4.2.1车间布局可按照 GB 50073-2001 中 4.2 的规定执行。4.2.2须配备配制室、灭菌室、清洗室、更衣室、预制室、接种室、培养室等。配制室、灭菌室、清洗室与更衣室、预制室、接种室、培养室等应绝对隔离。4.3卫生要求4.3.1空气质量不低于 GB 3095 中对总悬浮颗粒物（TSP）二级要求。4.3.2生产车间要保持干净、清洁，接种室和培养室应定期消毒，消毒要求如下：a)大消毒。1 次/月，每 m空间用 40%甲醛溶液 5mL+高锰酸钾 5g 混合熏蒸。密闭 3d 后，再通风1d；b)日常消毒。1 次/d，接种室接种前一天晚上用 50mg/L ClO2 熏蒸。5脱毒流程5.1培养基制备DB6108/T 56202325.1.1培养基配制：在 MS 基本培养基（见附录 A）中按照不同比例添加 NAA、6-BA、GA3 及 D-泛酸钙等植物生长调节剂，并分装于培养瓶中。5.1.2培养基消毒：培养瓶加盖后置于高压蒸汽灭菌锅 121条件下灭菌 20min。5.2剥离材料的选择和处理5.2.1选择：在生长季节选择具有品种典型性状的健康单株，收获后选取健康块茎。5.2.2处理：块茎通过自然休眠或者激素处理后，在室温内进行先暗光后散射光的催芽处理。5.3茎尖剥离5.3.1无菌工作条件创造5.3.1.1组培室用 4.3.2 的方法消毒后，再用紫外线灯照射 40min。5.3.1.2无菌操作台要提前 2h 打开风机和紫外灯杀菌。5.3.1.3工作人员用硫磺皂洗手，75%酒精擦拭消毒。5.3.1.4操作器具在高压蒸汽灭菌锅内 121条件下灭菌 20min，置于无菌操作台上备用。5.3.2病毒钝化5.3.2.1物理钝化：将马铃薯薯块在 36条件下处理 4 周6 周或用紫外线照射脱毒材料 10 min。5.3.2.2化学钝化：在培养基中加入病毒唑，使病毒钝化失活。5.3.3茎尖消毒经催芽处理，待芽萌发至 2cm3cm 时，选取健壮芽，用解剖刀切下，芽段用自来水冲洗 40min 以上，再用 75%的酒精浸蘸 30s，放入无菌杯内用 6%的次氯酸钠溶液浸泡 10 min，最后用无菌水冲洗 3次。5.3.4茎尖剥离及接种将茎尖放在无菌滤纸上吸干水分，在10倍解剖镜下用解剖针剥取带1个2个叶原基的茎尖（0.1mm0.3mm），迅速按无菌操作程序接入培养基中。5.4茎尖培养温度2025，光照强度2000Lx3000Lx，光照时间16h/d，培养90d140d。当看到明显生长的小茎，叶原基形成可见的小叶，转入无生长调节剂的培养基中。小苗继续生长并形成根系，发育成3个4个叶片的小植株，即可继续扩繁。5.5病毒检测以单株为系进行扩繁，苗数达150株200株时，随机抽取3个4个样本，每个样本10株15株，进行病毒检测，采用NY/T 401中的酶联免疫吸附试验法(ELISA)和RT-PCR法检测确认不带有PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA、PVM和PSTVd。5.6脱毒苗试种病毒检测合格的试管苗在网棚中用无土栽培的方式进行试种，与大田种植的同品种马铃薯植株和块茎的各个指标进行比对：a)苗期观察植株叶片形状、颜色，茎秆颜色以及花色、花型等指标。DB6108/T 5620233b)收获后观察薯型、芽眼、薯皮、薯肉颜色等指标。注：指标一致，即可视为该脱毒苗保持了品种的生物学性状，可作为核心种苗进行扩大繁殖。6试管苗的繁育6.1培养基制备将MS培养基配制成液，装入器皿（MS培养基配方附录A），置于121高压蒸汽灭菌锅灭菌20min。6.2组培苗处理将组培苗置于超净工作台上，器皿表面用75%的酒精擦试消毒，取出组培苗，按单茎切段，每个段带一片小叶摆放在培养基面上。6.3组培苗快繁6.3.1基础苗繁育6.3.1.1按组培苗繁育的方法配制培养基和处理组培苗。6.3.1.2切段底部（根部）不作为基础苗，直接转入移栽用苗培养，其它各段作为基础苗进行繁殖。6.3.1.3培养温度 1520，光照强度 2000Lx3000Lx，光照时间 10 h/d 14h/d。6.3.1.4培养周期 30 d40d。6.3.2定植苗繁育6.3.2.1按组培苗繁育的方法配制培养基和处理组培苗。6.3.2.2培养温度 1525，光照强度 3000Lx4000Lx，光照时间 14 h/d 16h/d。6.3.2.3培养周期 15 d20d，苗高 5cm 以上即可定植。7档案建立建立茎尖脱毒和试管苗工厂化生产档案，档案保存不少于2y。DB6108/T 5620234附录A(资料性附录)MS 培养基配方MS类型成分用量（mg/L)A大量元素硝酸铵(NH4NO3)硝酸钾(KNO3)磷酸二氢钾(KH2PO4)硫酸镁(MgSO47H2O)氯化钙(CaCl22H2O)3300038000340074008800B铁盐硫酸亚铁(FeSO47H2O)乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)55707450C微量元素碘化钾(KI)钼酸钠(Na2MoO42H2O)硫酸铜(CuSO45H2O)氯化钴(CoCl26H2O)硫酸锰(MnSO44H2O)硫酸锌(ZnSO47H2O)硼酸(H3BO3)1665055446017201240D有机物盐酸硫胺素(VB1)盐酸吡哆素(VB6)甘氨酸烟酸肌醇2010040010020000E糖类蔗糖琼脂300007_