芦竹转基因.pptx

芦竹转基因芦竹转基因整体框架v从野外采取芦竹外植体，从野外采取芦竹外植体，v植物组织培养体系的建立植物组织培养体系的建立v转基因体系的建立转基因体系的建立v用用PCR,Southern blot等技术进行等技术进行鉴定得到转基因植株。鉴定得到转基因植株。PCR技术体外酶促合成特异DNA片段，使目的DNA得以迅速扩增v1.PCR反应液配置：从冰上将以下各成分加入PCR反应管中 diH2O（无菌水）-37ul 10Taq Buffer标记-5ul Mg离子-3ul dNTPs(10mMeach)碱基-1ul Primer1（20um）-1ul Primer2（20um）-1ul 待测菌液，对照菌液-1ul Taq DNA polymerase酶-1ulv2.手指轻弹反应管，使其混匀，简短离心，迅速放入PCR.v3.PCR反应循环设置v T=94 2minv 30个循环T=94，40S；T=52，1min；T=72，2.5minv T=72 7minSouthern blot 印迹杂交是研究DNA图谱的基本技术，DNA图谱分析及PCR产物分析制胶：琼脂糖1g溶于100mlTAE中，再加入100ulEB（EB母液25mg/ml，放置于冰箱中），沸三次,倒胶。跑电泳：电压120V。电流自己调节，电流不断升高，知道设备部叫为止；若还 不行则降低电压。外植体获得外植体获得v大自然获得外植体。v75%的酒精消毒30S，重复三次。v0.1%升汞消毒4min，一次。v蒸馏水清洗30S，重复三次。v切取其腋芽，将腋芽外的壳小心剥去，再在腋芽的底端切一刀，是组织与培养基充分接触，用镊子将腋芽植入固体培养基中。（注意：无菌操作过程中镊子和手术刀要经常灼烧，必要时可将镊子和刀柄进行高压灭菌，以防污染。）固体培养基vMS干粉：干粉：41.5g/L；琼脂粉：；琼脂粉：5g/L。v6-BA：6-苄氨基腺嘌呤。苄氨基腺嘌呤。主要作用：促进细胞分裂，生物体内物质的积累和侧芽发生，防止老化。(配置时要加入少量稀酸或97%酒精，再加入蒸馏水，可适当加热。)vI-BA：吲哚乙酸。：吲哚乙酸。内源生长素，促进细胞的生长。v(配置时要加入少量稀碱，再加入蒸馏水。)农杆菌培养挑取携带植物表达载体质粒的农杆菌单菌落。接种在50mg/LKana 的 LB 液体培养基中，28，160rpm 振荡培养过夜。活化过夜的农杆菌按 1:50 的比例接种在相同的LB液体培养基中。继续培养至对数生长期至OD=0.30.4，测量时使用波长为600nm，准备感染用。卡那霉素 Kana筛选出抗性株 1.称量Kana粉末 2.用蒸馏水溶解，然后定容。3.在操净台上用滤膜过滤，并将其分装入EP管中并放于20下冷藏。4.母液浓度为50mg/L。LB液体培养基液体培养基以配1LLB液体培养基为准：v蛋白胨（TRYPTONE）-10gv酵母提取液（YEASTExTrACT）-5gvNaCl-10g v注意：粉末在烧杯中溶解完全之后，转移到1L的容量瓶中定容。待灭菌结束后，温度降至55左右（不烫手）时，加入Kana(50mg/L)1000Ul(在超净台内进行)。v加15g琼脂粉，即得到LB固体培养基。农杆菌侵染芦竹v1.3000rpm离心菌液 20min，弃上清液，收集沉淀菌体。v2.用MS液体培养基（含50mg/L乙酰丁香酮）悬浮农杆菌液，准备感染用。v3.将事先培养好的芦竹嫩芽浸入2中准备的农杆菌菌液中。v4.感染20min30min，取出芦竹嫩芽用无菌滤纸吸去附着的菌液。v5.将其接种在含有50mg/L乙酰丁香酮（AS）的固体MS培养基上，进行共培养。MS液体培养基v以配1LMS液体培养基为准：母液1-5ml 母液1-10ml 母液1-5ml 母液2-1ml 母液3-5ml 母液4-1ml 2g/l的6-BA-0.5ml 2g/l的IBA-0.1ml 蔗糖-30gv注意：待溶液在烧杯中混匀之后，调节pH值至5.86.0，再转移到1000ml的容量瓶中定容。乙酰丁香酮 AS加速农杆菌侵染植株v1.称取固体粉末。v2.先用甲醇或二甲基亚砜溶解，再加蒸馏水加热溶解。v3.定容。v4.在操净台上用滤膜过滤，并将其分装入EP管中并放于20下冷藏。v5.母液浓度为:筛选出抗性植株若干天后，将芦竹从培养基中取出放入无菌水中清洗数次，直至无菌水澄清。再将芦竹加到500mg/L羧苄青霉素（Carb）的液体MS培养基，洗5-10min。取出芦竹嫩芽用无菌滤纸吸去附着的液体。将芦竹接到500mg/L羧苄青霉素(Carb)和10mg/L潮霉素（Hygr）固体MS培养基上。数天后，将芦竹从500mg/L羧苄青霉素和10mg/L潮霉素固体MS培养中取出。将其转接到只含有激素的固体MS培养基中去。通过观察，选择出抗性芽。羧苄青霉素：杀菌，杀死植株体外的农杆菌。潮霉素：选择性，杀死体内没有农杆菌侵入的植株。称取固体粉末。可用蒸馏水配置。定容。在超净台内用滤膜过滤，并将其分装入EP管中，用封口膜封口，放于20下冷藏，备用。根诱导及植株再生根诱导及植株再生待培养筛选的抗性芽长至 11.5cm 时。切下并转入含有500mg/L羧苄青霉素和10mg/L潮霉素的生根培养基上诱导生根。获得具有潮霉素素抗性的转基因植株。鉴定鉴定 PCR,Southern blot 分分析 从转基因植株体内提取DAN,通过PCR,Southern blot 等技术，鉴定植株体内是否含有目的基因。生物鉴定生物鉴定 将芦竹放入含有磷的水中，通过鉴定水中磷含量的变化来测定芦竹的聚磷效果。