细胞破碎.pptx

<p>1细细 胞胞 破破 碎碎 北京四环生物制药有限公司北京四环生物制药有限公司 王小建王小建前前 言言n细胞破碎是了解细胞组成和结构细胞破碎是了解细胞组成和结构,获得细胞内含获得细胞内含物的必要手段。物的必要手段。n胞内的生物活性物质的稳定性差胞内的生物活性物质的稳定性差,条件不适极易条件不适极易失活。特别是微生物细胞十分微小失活。特别是微生物细胞十分微小,细胞壁结构细胞壁结构比较紧密比较紧密,一般方法不易将细胞打破一般方法不易将细胞打破,有些技术有些技术虽然可以虽然可以,但条件严苛但条件严苛,胞内生物活性物质在此胞内生物活性物质在此条件下很易失活条件下很易失活,限制了一些技术应用。限制了一些技术应用。n在一定程度上细胞破碎仍是生物技术产业化关在一定程度上细胞破碎仍是生物技术产业化关键技术。键技术。3生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程本章内容4细胞分离方式细胞破碎技术包涵体的分离与纯化主要内容细胞壁结构和组成1 1、细胞分离方式、细胞分离方式不同类型的细胞分泌目标产物的类型：不同类型的细胞分泌目标产物的类型：l动物细胞多分泌到细胞外培养液动物细胞多分泌到细胞外培养液l植物细胞多为胞内产物植物细胞多为胞内产物l微生物（细菌微生物（细菌/酵母酵母/真菌）胞内、胞外真菌）胞内、胞外 对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。5 一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞之外的液一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞之外的液相中，如相中，如促红细胞生成素促红细胞生成素等。这些蛋白质在细胞培养等。这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用用过滤或离心过滤或离心进行进行固液固液分离，然后将获得的澄清滤分离，然后将获得的澄清滤液再进一步液再进一步纯化纯化即可。其后续分离和纯化都相对简单。即可。其后续分离和纯化都相对简单。但由于一些重组但由于一些重组DNADNA（rDNArDNA）产品结构复杂，）产品结构复杂，必须在必须在细胞内组装来获得生物活性细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变生物活性往往有所改变，此类，此类rDNArDNA产品是产品是细胞内产品细胞内产品（非分泌型），需要应用（非分泌型），需要应用细胞细胞破碎破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后再进行提纯，为后续分离纯化后续分离纯化做好准备工作。做好准备工作。61 1、细胞分离方式、细胞分离方式7 几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物药物名称药物名称宿主宿主用途用途 白介素白介素-2-2 （rIL-2rIL-2）大肠杆菌大肠杆菌治疗肿瘤和提治疗肿瘤和提高免疫力高免疫力人粒细胞刺激人粒细胞刺激因子（因子（G-CSFG-CSF）大肠杆菌大肠杆菌促进骨髓移植促进骨髓移植后中性粒细胞后中性粒细胞计数增加计数增加 人生长激素人生长激素 （HGHHGH）大肠杆菌大肠杆菌治疗侏儒病治疗侏儒病82 2、细胞壁结构和组成、细胞壁结构和组成细胞破碎（细胞破碎（cell rupturecell rupture）技术是指利用外力）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。型生化物质（产品）的基础。为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。解各种微生物细胞壁的组成和结构。2 2、细胞壁结构和组成、细胞壁结构和组成n微生物细胞外膜使细胞具有刚性的外形微生物细胞外膜使细胞具有刚性的外形,由胞质由胞质膜和细胞壁组成膜和细胞壁组成,其结构影响着细胞破碎。其结构影响着细胞破碎。n胞质膜保持着细胞内外的物质浓度梯度胞质膜保持着细胞内外的物质浓度梯度,主要由主要由蛋白质和脂类组成。没有细胞壁时蛋白质和脂类组成。没有细胞壁时,膜对渗透休膜对渗透休克敏感克敏感,对其它破碎方法影响较小。对其它破碎方法影响较小。n细胞壁是破碎的主要障碍细胞壁是破碎的主要障碍,其组成和结构对细胞其组成和结构对细胞破碎有重要影响。细胞壁的组成和结构与遗传破碎有重要影响。细胞壁的组成和结构与遗传和环境因素有关和环境因素有关,但在微生物的种属中也存在总但在微生物的种属中也存在总结构上的相似性。结构上的相似性。2 2、细胞壁结构和组成、细胞壁结构和组成 1964 1964年年SaltonSalton首次利用机械破碎法破碎细首次利用机械破碎法破碎细菌细胞，对细菌细胞壁组成、结构和功能进行研菌细胞，对细菌细胞壁组成、结构和功能进行研究。尤其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞究。尤其对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁结构有了较为全面认识。壁结构有了较为全面认识。除了菌质和一些除了菌质和一些L-L-型和嗜盐菌以外，几乎型和嗜盐菌以外，几乎所有的细菌的壁的较坚硬部分都是由短肽交联的所有的细菌的壁的较坚硬部分都是由短肽交联的糖原链，即粘肽构成，围绕着细胞形成连续的网糖原链，即粘肽构成，围绕着细胞形成连续的网状结构，使细胞具有一定的形状和强度。状结构，使细胞具有一定的形状和强度。112.1 2.1 细胞壁结构对破碎的影响细胞壁结构对破碎的影响Z微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。胞膜。Z通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。胞壁。Z不不同同细细胞胞壁壁的的结结构构和和组组成成不不完完全全相相同同，故故细细胞胞壁壁的的机机械械强强度度不不同同，细细胞胞破破碎碎的的难难易易程程度度也也就就不不同。同。几种微生物细胞壁的结构及组成12132.22.2细菌细胞壁结构及组成细菌细胞壁结构及组成Z几几乎乎所所有有细细菌菌的的细细胞胞壁壁都都是是由由肽肽聚聚糖糖组组成成，它它是是难难溶溶性性的聚糖链；的聚糖链；Z相相邻邻聚聚糖糖链链上上的的短短肽肽又又交交叉叉相相联联，构构成成了了细细胞胞壁壁的的三三维维网状结构，包围在细胞周围；网状结构，包围在细胞周围；Z使使细细胞胞具具有有一一定定的的形形状状和和强强度。度。14u破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。在的肽键的数量和其交联的程度。u革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。大不同。u革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌典典型型的的生生物物是是大大肠肠杆杆菌菌，通通过过这这种种细细胞胞生生产产了了很很多多细细胞胞重重组组的的产产物物，例例如如我我公公司司生生产的重组人白介素产的重组人白介素-2-2、重组人粒细胞刺激因子等。、重组人粒细胞刺激因子等。2.22.2细菌细胞壁结构及组成细菌细胞壁结构及组成 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁构造革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁构造15 虽然几乎所有的细菌都含有基本的粘肽网结构，虽然几乎所有的细菌都含有基本的粘肽网结构，但革兰氏阳性和阴性细菌的壁结构有明显不同。但革兰氏阳性和阴性细菌的壁结构有明显不同。格兰氏阳性菌的壁相当厚，约格兰氏阳性菌的壁相当厚，约15-50 nm15-50 nm，含有，含有40-90%40-90%的由基础多糖和磷壁酸质组成的粘肽，一的由基础多糖和磷壁酸质组成的粘肽，一些种属的细胞表面有规律地排列着蛋白质亚基。些种属的细胞表面有规律地排列着蛋白质亚基。革兰氏阴性菌细胞壁由薄的粘肽层革兰氏阴性菌细胞壁由薄的粘肽层(1.5-2.0nm)(1.5-2.0nm)和在电子显微照片上看如同胞质膜一样的外膜组和在电子显微照片上看如同胞质膜一样的外膜组成，粘肽层上还共价结合有脂蛋白，一些种属在成，粘肽层上还共价结合有脂蛋白，一些种属在外膜上另外还有一层规律排列的蛋白质亚基。外膜上另外还有一层规律排列的蛋白质亚基。162.22.2细菌细胞壁结构及组成细菌细胞壁结构及组成172.32.3酵母细胞壁结构及组成酵母细胞壁结构及组成 酵母细胞壁结构更难加以说明。总的结构要比格兰酵母细胞壁结构更难加以说明。总的结构要比格兰氏阳性菌的厚些。面包酵母细胞壁大约为氏阳性菌的厚些。面包酵母细胞壁大约为70nm70nm，且随培，且随培养时间的增加细胞壁加厚。养时间的增加细胞壁加厚。酵母细胞壁含有大量葡聚糖，甘露聚糖和蛋白质，酵母细胞壁含有大量葡聚糖，甘露聚糖和蛋白质，但不清楚以怎样的方式结合形成基本结构。在葡聚糖链但不清楚以怎样的方式结合形成基本结构。在葡聚糖链上有上有(1,3)(1,3)和和(1,6)(1,6)键联结的分支链结构。酵母细胞键联结的分支链结构。酵母细胞壁的甘露聚糖主要是由壁的甘露聚糖主要是由(1,2)(1,2)糖苷键和少量的糖苷键和少量的(1,3)(1,3)糖苷键联结的甘露糖组成，另外，也有通过糖苷键联结的甘露糖组成，另外，也有通过(1,6)(1,6)糖苷糖苷键联结的甘露寡糖侧链，在甘露糖残基上有时也有磷酸键联结的甘露寡糖侧链，在甘露糖残基上有时也有磷酸二酯键。在酵母细胞壁上发现的蛋白质主要是与甘露糖二酯键。在酵母细胞壁上发现的蛋白质主要是与甘露糖复合，多数是酶，而不是结构组分。复合，多数是酶，而不是结构组分。182.32.3酵母细胞壁结构及组成酵母细胞壁结构及组成 酵母细胞壁结构示意图酵母细胞壁结构示意图 外层甘露聚糖(M)通过磷酸二酯键与蛋白(P)结合，内部蛋白含有交联的糖原(G)微生物细胞壁的形状和强度与壁内结构聚合物微生物细胞壁的形状和强度与壁内结构聚合物的结构和它们彼此之间交联及与其它组分的交的结构和它们彼此之间交联及与其它组分的交联程度有关。为达到破碎细胞目的，必须打破联程度有关。为达到破碎细胞目的，必须打破这种共价结合的网状结构。这种结构不仅与其这种共价结合的网状结构。这种结构不仅与其遗传特性有关，也与其生长环境和生长阶段有遗传特性有关，也与其生长环境和生长阶段有关，因此表现为极其丰富的多样性。关，因此表现为极其丰富的多样性。利用机械破碎细胞时，细胞的形状和大小，细利用机械破碎细胞时，细胞的形状和大小，细胞壁结构聚合物的交联程度均是决定破碎难易胞壁结构聚合物的交联程度均是决定破碎难易的重要因素。要预知各种微生物细胞对机械破的重要因素。要预知各种微生物细胞对机械破碎的耐受能力也有困难。碎的耐受能力也有困难。193 3、细胞破碎技术细胞破碎技术n目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。n破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。203 3、细胞破碎技术细胞破碎技术213 3、细胞破碎技术细胞破碎技术22机械破碎机械破碎捣碎法研磨法匀浆法超声法 物理破碎物理破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎化学破碎有机溶剂：表面活性剂：酸碱酶促破碎酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎3.13.1细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理3 3、细胞破碎技术细胞破碎技术23细胞破碎机理图243.2.13.2.1高压匀浆法高压匀浆法细胞悬浮液自高压室细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系流出。细胞在这一系列高速运动过程中经列高速运动过程中经历了高速剪切、碰撞历了高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细及压力骤降，造成细胞破碎。胞破碎。3.23.2机械破碎法机械破碎法3 3、细胞破碎技术细胞破碎技术25高压匀浆器的种类高压匀浆器的种类高压匀浆器的种类较多高压匀浆器的种类较多：pWABWAB公司的公司的AVP Gaulin AVP Gaulin 31MR31MR型型pBran and luebbe Bran and luebbe 公公司司SHL40SHL40型型p丹麦丹麦APVAPV公司公司R5-12.38R5-12.38型型 处理量处理量130L/h高压匀浆机高压匀浆机26高压匀浆法使用时注意事项高压匀浆法使用时注意事项n高压匀浆器的操作温度高压匀浆器的操作温度上升约上升约2-3/10MPa2-3/10MPan为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却处冷却处理理。n多次破碎多次破碎操作中操作中需要需要设置设置冷却装置冷却装置可有效防止温度上可有效防止温度上升，升，保护产物活性保护产物活性。*在在工业规模的细胞破碎中工业规模的细胞破碎中，为了提高破碎的效率常采，为了提高破碎的效率常采用用多次循环的操作多次循环的操作方法。方法。匀浆机配套冷却装置匀浆机配套冷却装置2728l升高压力有利于破碎，升高压力有利于破碎，减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。至过小。在工业生产中，通常采用的压力为在工业生产中，通常采用的压力为555570Mpa70Mpa。l破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，生长在简单大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。容易破碎。影响高压匀浆器细胞破碎因素影响高压匀浆器细胞破碎因素293.2.23.2.2超声波破碎超声波破碎l超声波破碎法（超声波破碎法（Ultrasonication)Ultrasonication)利用超声波利用超声波振荡器发射的振荡器发射的15-25kHz15-25kHz的超声波探头处理细胞的超声波探头处理细胞悬浮液。悬浮液。l超声波振荡器以可分为超声波振荡器以可分为槽式槽式和探头直接插入介和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。l超声波的细胞破碎效率与超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超细胞种类、浓度和超声波的声频、声能声波的声频、声能有关。有关。3.23.2机械破碎法机械破碎法30超声波破碎的机理(一般认为在超声波作用下液体发生空化作用一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation),cavitation),(液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。而使细胞破碎。(操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。外部冷却的容器中进行。超声破碎仪超声破碎仪CPX-600CPX-600型型3132超声波破碎的适用范围超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，一般杆菌比球菌易破碎，G-G-细菌比细菌比G+G+细菌易破细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。碎，对酵母菌的效果较差。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。活性物质失活。超声波破碎的有效能量利用率极低超声波破碎的有效能量利用率极低由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但但在实验室小规模细胞破碎中常用在实验室小规模细胞破碎中常用在实验室小规模细胞破碎中常用在实验室小规模细胞破碎中常用。33技术技术原理原理效果效果 成本成本举例举例匀浆法匀浆法(孔型孔型)须使细胞通过的小须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪孔，使细胞受到剪切力而破碎切力而破碎剧烈剧烈 适中适中 细胞悬浮液大规细胞悬浮液大规模处理模处理超声波超声波法法用超声波的空穴作用超声波的空穴作用使细胞破碎用使细胞破碎适中适中 昂贵昂贵 细胞悬浮液小规细胞悬浮液小规模处理模处理3.2.33.2.3匀浆和超声波破碎方法比较匀浆和超声波破碎方法比较3.23.2机械破碎法机械破碎法34酶解酶解渗透压渗透压冲击冲击冻结和融化冻结和融化干燥法干燥法化学法溶胞化学法溶胞n其中酶法和化学法溶胞应用最广。其中酶法和化学法溶胞应用最广。3.3 3.3 非机械破碎方法非机械破碎方法35 3.3.1 3.3.1酶解（酶溶法酶解（酶溶法 Enymatic lysis)Enymatic lysis)n酶解是利用溶解细胞壁的酶解是利用溶解细胞壁的酶处理酶处理菌体细胞，使菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压渗透压冲击冲击等方法破坏细胞膜，进一步等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物增大胞内产物的通透性的通透性。溶菌酶溶菌酶(lysozyme)适用于适用于革兰氏阴革兰氏阴性菌性菌细胞的分解，应用于革兰氏阴性菌时，需细胞的分解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。使之更有效地作用于细胞壁。n真核细胞真核细胞的细胞壁不同于的细胞壁不同于原核细胞原核细胞，需采用不，需采用不同的酶。同的酶。3.3 3.3 非机械破碎方法非机械破碎方法36真核细胞与原核细胞比较真核细胞与原核细胞比较37 常用的溶酶常用的溶酶溶菌酶、溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、蛋白酶、甘露糖酶、甘露糖酶、糖苷酶、糖苷酶、肽键内切酶、肽键内切酶、壳多糖酶等壳多糖酶等38酶解法的优缺点 优点：优点：n发生酶解的发生酶解的条件温和条件温和；n能能选择性选择性地释放产物；地释放产物；n胞内核酸等胞内核酸等泄出量少泄出量少，细胞外形较完整，细胞外形较完整，便于后步分便于后步分离离等；等；n但酶水解但酶水解价格高价格高，故，故小规模应用小规模应用较广；较广；缺点：缺点：溶酶价格高溶酶价格高溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶)产物抑制的存在。产物抑制的存在。393.3.1.13.3.1.1外加酶法外加酶法n酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。须根据细胞的结构和化学组成来选择。l溶菌酶（溶菌酶（lysozyme)lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的子的-1,4-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂效果，必须与螯合剂EDTAEDTA一起使用。一起使用。l放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，为主要成分，所以也能采用溶菌酶，l酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。l植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。半纤维素酶裂解。3.3.1 3.3.1酶解（酶溶法酶解（酶溶法 Enymatic lysis)Enymatic lysis)403.3.1.13.3.1.1外加酶法外加酶法有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。入时需确定相应的次序。对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。裂，释出胞内产物。413.3.1.23.3.1.2酶解酶解-自溶作用自溶作用 l 自溶作用是酶解的另一种方法，自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。l在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。下去。l自溶作用：改变其生长环境（温度、缓自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。生其它的自溶酶，以达到自溶目的。l缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。423.3.23.3.2渗透压冲击法渗透压冲击法 n渗透压冲击是渗透压冲击是较温和较温和的一种破碎方法，将细胞的一种破碎方法，将细胞放在放在高渗透压的溶液高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分细胞内水分便向外渗出便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液将细胞转入水或缓冲液中，中，由于渗透压的突然变化，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞胞外的水迅速渗入胞内内，引起细胞快速膨胀而破裂。，引起细胞快速膨胀而破裂。3.3 3.3 非机械破碎方法非机械破碎方法43 3.3.33.3.3冻结冻结-融化法融化法n 将细胞放在低温下冷冻（约将细胞放在低温下冷冻（约-15-15），然后在），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。由于室温中融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂使细胞膜的疏水键结构破裂，从而从而增加细胞的亲水性能增加细胞的亲水性能，另一方面，另一方面胞内水结胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。对于。对于细胞壁较脆弱的菌体细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。，可采用此法。3.3 3.3 非机械破碎方法非机械破碎方法443.3.43.3.4干燥法干燥法n经干燥后的细胞，其经干燥后的细胞，其细胞膜的渗透性细胞膜的渗透性发发生变化，同时部分菌体会产生生变化，同时部分菌体会产生自溶自溶，然，然后用后用丙酮、丁醇或缓冲液丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。胞内物质就会被抽提出来。3.3 3.3 非机械破碎方法非机械破碎方法45 3.3.5 3.3.5化学法化学法 n采用化学法处理可以采用化学法处理可以溶解溶解细胞或细胞或抽提抽提胞内组分。常用胞内组分。常用酸、酸、碱、表面活性剂和有机溶剂碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂等化学试剂n酸酸处理可以使处理可以使蛋白质水解成氨基酸蛋白质水解成氨基酸，通常采用，通常采用6mol/L 6mol/L HClHCl。碱碱和和表面活性剂能表面活性剂能溶解细胞壁上溶解细胞壁上脂类物质脂类物质等从细胞等从细胞内渗漏出来。天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等；内渗漏出来。天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等；n合成的合成的表面活性剂表面活性剂可分可分离子型离子型和和非离子型非离子型，离子型如十，离子型如十二烷基硫酸钠（二烷基硫酸钠（SDSSDS，阴离子型）；十六烷基三甲基溴化，阴离子型）；十六烷基三甲基溴化铵（阳离子型）。非离子型如铵（阳离子型）。非离子型如Triton X-100Triton X-100和吐温和吐温（TweenTween）等）等 ；n有机溶剂有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 ；3.3 3.3 非机械破碎方法非机械破碎方法46n化学法和酶法一样也存在对产物的释出选择性好，细胞外化学法和酶法一样也存在对产物的释出选择性好，细胞外形较形较完整完整，碎片少碎片少，核酸等胞内杂质释放少，便于后步分，核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离等优点，故离等优点，故使用较多使用较多。但。但该法容易引起活性物质失活破该法容易引起活性物质失活破坏坏，因此，根据生化物质的稳定性来选择合适的化学试剂，因此，根据生化物质的稳定性来选择合适的化学试剂和操作条件是非常重要的。另外和操作条件是非常重要的。另外，化学试剂的加入，常会，化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度。如，并影响最终产物纯度。如表表面活性剂存在面活性剂存在常会影响盐析中蛋白质的沉淀和疏水层析，常会影响盐析中蛋白质的沉淀和疏水层析，因此必须注意除去。因此必须注意除去。3.3.5 3.3.5化学法化学法 473.43.4破碎率及其测定方法破碎率及其测定方法 破碎细胞的目的主要有二，一是获得细胞的破碎细胞的目的主要有二，一是获得细胞的内含物，二是获得细胞膜物质。不论是那一种内含物，二是获得细胞膜物质。不论是那一种目的，获得最大的破碎率是所有破碎技术追求目的，获得最大的破碎率是所有破碎技术追求的目标。的目标。为了检测破碎过程和破碎结果，需要快速、为了检测破碎过程和破碎结果，需要快速、简捷的细胞破碎程度的分析技术。细胞破碎率简捷的细胞破碎程度的分析技术。细胞破碎率可直接利用完整细胞计数法或质量检测法，也可直接利用完整细胞计数法或质量检测法，也可利用细胞释放出来的特定组分间接测定。可利用细胞释放出来的特定组分间接测定。直接测定法是标准化法，间接测定法可能直接测定法是标准化法，间接测定法可能更有用，更有价值。可根据具体情况采用不同更有用，更有价值。可根据具体情况采用不同的测定方法。的测定方法。483.43.4破碎率及其测定方法破碎率及其测定方法1.细胞破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比细胞破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：数，即：Y(%)=(N0-N)/N0100N0原始细胞数量原始细胞数量 N经一段时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量经一段时间操作后保留下来的未损害完整细胞数量测定方法测定方法直接测定法直接测定法目的产物测定法目的产物测定法导电率测定法导电率测定法xR/RmR:破碎后释放的化合物的量Rm:理论最大释放量49直接测定法直接测定法p在在血血球球计计数数板板用用显显微微镜镜可可直直接接计计数数完完整整细细胞胞的的量量，所所以以可可用用于于破破碎碎前前的的细细胞胞计计量量。然然而而破破碎碎过过程程中中所所释释放放的的物物质质如如DNADNA和和其其它它聚聚合合物物干干扰扰计计数数时时，可可采采用用染染色色法法把把破破碎碎的的细细胞胞区区别别开开来来，以以便便于于计计数数。例例如如，破破碎碎的的革革兰兰氏氏阴阴性性菌菌常常可可用用结结晶晶紫紫快快速速染染色色，在在显显微微镜镜下下观观察察在在视视线线范范围围内内是是否否有有完完整整的菌体存在。的菌体存在。p对对于于量量大大的的样样品品，显显微微镜镜计计数数法法耗耗时时，枯枯燥燥；电电子子粒粒子子计计数数器器虽虽可可测测定定酵酵母母细细胞胞破破碎碎率率，但但大大的的细细胞胞破破碎碎物物可可能能有有干干扰；用于细菌破碎率的测定时扰；用于细菌破碎率的测定时,灵敏度较低。灵敏度较低。3.43.4破碎率及其测定方法破碎率及其测定方法50间接测定法间接测定法依据破碎过程中破碎的细胞释放的胞内物质量测算，如测依据破碎过程中破碎的细胞释放的胞内物质量测算，如测定可溶性蛋白量或酶活性等，但需与破碎率达到定可溶性蛋白量或酶活性等，但需与破碎率达到100%100%的标的标准进行比较。在使用酶活性测定法时需注意，由于粗酶提准进行比较。在使用酶活性测定法时需注意，由于粗酶提取物的酶动力学与完整细胞或纯化的酶可能有差别而产生取物的酶动力学与完整细胞或纯化的酶可能有差别而产生误差。误差。当使用较浓的细胞悬浮液时，为获得准确结果，必须进行当使用较浓的细胞悬浮液时，为获得准确结果，必须进行校正。这是由于破碎细胞释放胞内物质与水混合时会使体校正。这是由于破碎细胞释放胞内物质与水混合时会使体积增加。另外，稀释法并不适合在破碎过程中易失活的物积增加。另外，稀释法并不适合在破碎过程中易失活的物质测定。因此需使用新的方法质测定。因此需使用新的方法。3.43.4破碎率及其测定方法破碎率及其测定方法51(1)(1)稀释法稀释法 如果细胞破碎过程中失活不成为问题，可通过测定破碎如果细胞破碎过程中失活不成为问题，可通过测定破碎样品样品(C Cu)u)和稀释样品和稀释样品(C Cd)d)的上清液中的可溶性蛋白来测定破的上清液中的可溶性蛋白来测定破碎率。使用公式可获得破碎样品的水相体积百分数碎率。使用公式可获得破碎样品的水相体积百分数(F Fd),d),F Fd=(d=(V Vd/d/V Vs)s)C Cd/(d/(C Cu-u-C Cd)d)V Vd d为加到体积为为加到体积为V Vs s的破碎样品中的稀释剂体积。使用的破碎样品中的稀释剂体积。使用Folin-LowryFolin-Lowry法或双缩脲法测定蛋白质，通过下式可得破碎悬法或双缩脲法测定蛋白质，通过下式可得破碎悬浮物中单位质量的细胞所含的蛋白质浮物中单位质量的细胞所含的蛋白质(R Rp)p)，R Rp=p=F Fd(d(C Cu/u/X X)X X是以干物重为基础的细胞浓度。为计算细胞破碎率，必是以干物重为基础的细胞浓度。为计算细胞破碎率，必须测定相当于破碎率为须测定相当于破碎率为100%100%的的R Rp p值。值。52(1)(1)稀释法稀释法 一般来说，水相体积百分数一般来说，水相体积百分数F Fd d与样品的稀释量与样品的稀释量无关。这也说明蛋白质的溶解度不受样品的稀无关。这也说明蛋白质的溶解度不受样品的稀释的影响。但实际上，在多数条件下，稀释会释的影响。但实际上，在多数条件下，稀释会影响蛋白质的溶解度，因此在采用稀释法之前，影响蛋白质的溶解度，因此在采用稀释法之前，要检查稀释对蛋白质溶解度的影响。要检查稀释对蛋白质溶解度的影响。53(2)(2)质量平衡法质量平衡法 破碎样品的水相体积分数破碎样品的水相体积分数(F F)与样品破碎前的水相体积与样品破碎前的水相体积分分(F Fo)o)及完整细胞内的含水量及完整细胞内的含水量(质量分数质量分数M)M)的关系为：的关系为：F F=F Fo+(1-o+(1-F Fo)Mo)M R R(Q Qc/c/Q Qaq)aq)R R为细胞破为细胞破Q Qc c为细胞密度，而为细胞密度，而Q Qaqaq为水悬浮介质的密为水悬浮介质的密度。在上式中假设细胞内水释放会使水相体积分数增加。度。在上式中假设细胞内水释放会使水相体积分数增加。利用凯氏定氮法测定破碎样品水相利用凯氏定氮法测定破碎样品水相(C Cn)n)和未破碎细胞和未破碎细胞(C Cno)no)的氮含量表示蛋白含量，它们与的氮含量表示蛋白含量，它们与F F和和R R的关系为：的关系为：R R=FCFCn/n/C CnoX noX 54(2)(2)质量平衡法质量平衡法将两式合拚，删去将两式合拚，删去F F项，得项，得 R R=F Fo o C Cn/n/C Cno X-(1-no X-(1-F Fo)o)C Cn M(n M(Q Qc/c/Q Qaq)aq)当细胞浓度当细胞浓度(X)(X)高时，用直接测定法测定细胞高时，用直接测定法测定细胞浓有困难，也可从样品的物理性质和固体质量分数计算浓有困难，也可从样品的物理性质和固体质量分数计算得到。得到。X=X=Q Qc c Q Qaq W(1-M)/W(aq W(1-M)/W(Q Qaq-aq-Q Qc)+c)+Q Qc(1-M)c(1-M)使用质量平衡法计算细胞破碎率时使用了几个假设，使用质量平衡法计算细胞破碎率时使用了几个假设，因此该方法的准确度有时比稀释法差。但是，当稀释影因此该方法的准确度有时比稀释法差。但是，当稀释影响蛋白的溶解度，不能使用稀释法时，可以使用质量平响蛋白的溶解度，不能使用稀释法时，可以使用质量平衡法测定细胞破碎率。衡法测定细胞破碎率。55(3)(3)电导率测定法电导率测定法 电导测定法是依据细胞物质释放到水中会改电导测定法是依据细胞物质释放到水中会改变溶液电导的原理发展的一种快速测定方法。细变溶液电导的原理发展的一种快速测定方法。细胞悬浮液电导的增加与细胞破碎率成正比。胞悬浮液电导的增加与细胞破碎率成正比。这种方法需要有其它方法作对比。因为电导这种方法需要有其它方法作对比。因为电导与生物类型，保存条件，细胞浓度，温度，悬浮与生物类型，保存条件，细胞浓度，温度，悬浮介质中的电解质类型和含量等有关。因此，在利介质中的电解质类型和含量等有关。因此，在利用电导测定法测定细胞破碎率时，为了保证测定用电导测定法测定细胞破碎率时，为了保证测定的准确，除破碎率以外的准确，除破碎率以外,必须在保持的其它所有必须在保持的其它所有条件恒定的情况下进行。条件恒定的情况下进行。563.53.5机械和非机械破碎方法的比较机械和非机械破碎方法的比较573.53.5机械和非机械破碎方法的比较机械和非机械破碎方法的比较583.53.5机械和非机械破碎方法的比较机械和非机械破碎方法的比较n机械粉碎法：处理量大，破碎速度较快。细胞受到由高压产机械粉碎法：处理量大，破碎速度较快。细胞受到由高压产生的高剪切力，大多数情况下要采取冷却措施，以便除去由生的高剪切力，大多数情况下要采取冷却措施，以便除去由于消耗机械能而产生的过多热量，防止生化物质破坏于消耗机械能而产生的过多热量，防止生化物质破坏n酶解需要选择适宜的酶和酶系统，并要决定特定的反应条件，酶解需要选择适宜的酶和酶系统，并要决定特定的反应条件，还常附加其它的处理，如辐照、加高浓度盐及还常附加其它的处理，如辐照、加高浓度盐及EDTAEDTA，或者利，或者利用生物因素等促使微生物对酶解作用敏感，以获得一定的效用生物因素等促使微生物对酶解作用敏感，以获得一定的效果。果。n选择合适的破碎方法需要考虑的因素：细胞的数量，目的产选择合适的破碎方法需要考虑的因素：细胞的数量，目的产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性；破碎程物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性；破碎程度及破碎速度等。度及破碎速度等。59n细胞破碎是为目标产细胞破碎是为目标产物的释放创造条件，物的释放创造条件，为了最大程度的获得为了最大程度的获得活性产物，而不是最活性产物，而不是最</p>