HPLC法同时测定盐酸阿霉素与氯尼达明的含量.pdf

研究报告 HPLC 法同时测定盐酸阿霉素与氯尼达明的含量孙雨菡1，许子艺1，廖峻2，张翮1，樊莉1，鲁莹1（1.海军军医大学药学系药剂学教研室,上海 200433；2.上海大学医学院,上海 200444）摘要目的建立同时测定盐酸阿霉素（DOXHCl）与氯尼达明（LND）含量的测定方法。方法采用 HPLC 法，色谱柱为 Agilent 5 HC-C18（2）（4.6 mm250 mm，5 m），流动相为甲醇-0.1%TFA 水溶液，梯度洗脱，甲醇比例随时间变化为：03 min，65%甲醇；37 min，65%90%甲醇；713 min，90%甲醇；1315 min，90%65%甲醇；1520 min、65%甲醇。采集时间 20 min，平衡时间 3 min，紫外检测波长 205 nm 及 253 nm，流速 1.0 ml/min，柱温 35，进样量：10 l。结果该方法专属性好，盐酸阿霉素在 140 g/ml 的浓度范围内线性良好，氯尼达明在 6240 g/ml 的浓度范围内线性良好。该方法之下，两种化合物的精密度、稳定性、回收率均符合要求。结论建立了同时检测盐酸阿霉素与氯尼达明含量的液相分析方法，该方法专属性强，准确可靠。关键词 氯尼达明；盐酸阿霉素；高效液相色谱法；联合用药；梯度洗脱文章编号 2097-2024（2024）03-0127-04DOI 10.12206/j.issn.2097-2024.202306043ContentmeasurementofdoxorubicinhydrochlorideandlonidaminebyHPLCSUN Yuhan1,XU Ziyi1,LIAO Jun2,ZHANG He1,FAN Li1,LU Ying1（1.Department of Pharmaceutical,School of Pharmacy,Naval Medical University,Shanghai 200433,China;2.School of Medicine,Shanghai University,Shanghai 200444,China）AbstractObjectiveTo establish a method for the simultaneous determination of DOXHCl and LND.MethodsHPLCwas performed on Agilent 5 HC-C18（2）（4.6 mm 250 mm,5 m）column.The mobile phase was methanol-0.1%TFA aqueoussolution,and the gradient elution procedure were:0 to 3 min,65%methanol;3 to 7 min,65%90%methanol;7 to 13 min,90%methanol;13 to 15 min,90%65%methanol;15 to 20 min,65%methanol.The collection time was 20 min,the balance time was3 min,the UV detection wavelengths were 205 nm and 253 nm.The flow rate was 1.0 ml/min and the column temperature was35.The amount of inlet was 10 l.ResultsThe method was highly specific,and both DOXHCl and LND exhibited goodlinearity in the concentration range of 1-40 g/ml and 6-240 g/ml,respectively.The two compounds precision,stability,andrecovery satisfied the requirements of the method.ConclusionThis study established a HPLC method that was suitable for thesimultaneous detection of DOXHCl and LND.This methods high level of specificity,accuracy,and reliability.Keywords lonidamine；doxorubicin hydrochloride；HPLC；drug combination；gradient elution盐酸阿霉素是一种基于蒽环类的广谱抗肿瘤药物，能够通过多种机制达到抗肿瘤活性。他能与 S 期 DNA 相互作用，抑制核酸合成。此外，作为 DNA 拓扑异构酶抑制剂，盐酸阿霉素可引起DNA 链的断裂1-5；但由于盐酸阿霉素严重的心脏毒性和肿瘤细胞耐药性阻碍了其在临床实践中的广泛应用。小分子化疗增敏剂能够改善肿瘤的多药耐药，提高化疗药物的疗效。氯尼达明在调节热疗、放射疗法、光动力疗法的活性方面具有潜力6-7。氯尼达明作为己糖激酶（HK-）抑制剂，能够抑制肿瘤细胞有氧糖酵解、减少肿瘤细胞的能量供应8-9。此外，氯尼达明可以通过破坏跨膜电位而有效地触发线粒体凋亡途径。但它作为单一药物，其抗肿瘤活性有限10，因此经常与其他抗肿瘤药物联合用作化学增敏剂。有研究报道指出，氯尼达明与盐酸阿霉素的共递送，在体外能够显著增强细胞毒性并降低抗肿瘤药物的给药剂量11-14，二者在协同治疗肝癌、卵巢癌、乳腺癌等领域已取得显著进展。通过大量的文献调研，我们发现氯尼达明与盐酸阿霉素的最佳协同比例为 16，但并未有人专门构建氯尼达明与盐酸阿霉素混合溶液的含量分析方法13。因此，本研究采用 HPLC 法建立针对氯尼达明与盐酸阿霉素联合用药的含量分析测定方法，为二者联合用药的含量检测提供参考。作者简介孙雨菡，硕士研究生，Email：通信作者樊莉，讲师，研究方向：水凝胶靶向递送，Email：；鲁 莹，教授，博士生导师，研究方向：纳微米制剂，Email： 药学实践与服务2024 年 3 月 25 日第 42 卷第 3 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.3，March 25，2024127 1仪器与试药 1.1 仪器Agilent-1 260 Infinity 高效液相色谱仪、紫外可见分光光度计 安捷伦科技（中国）有限公司；SECURA125-1CN 型十万分之一电子天平、Ariummini 超纯水机（德国赛多利斯）。1.2 药品与试剂盐酸阿霉素对照品（99%）、甲醇（色谱纯）、三氟乙酸（TFA，色谱纯）均购自sigma-Aldrich Company；氯尼达明对照品（99%，上海毕得医药科技有限公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。2方法与结果 2.1 波长的选择精密称取氯尼达明和盐酸阿霉素对照品适量，分别用甲醇水溶液（50%）溶解制成 20 g/ml 的对照品溶液，在 190400 nm 波长内进行扫描，盐酸阿霉素的最大吸收波长为 228、253 nm，氯尼达明的最大吸收波长为205 nm。故分别选择253、205 nm作为检测波长，见图 1。2.01.51.00.50200250波长(l/nm)吸收度(Abs)300盐酸阿霉素氯尼达明图 1盐酸阿霉素与氯尼达明的紫外波长扫描吸收光谱图 2.2 色谱条件色谱柱：Agilent 5 HC-C18（2）（4.6 mm250 mm，5 m）；流动相：甲醇（A）-0.1%TFA 水溶液（B）；检测波长：205、253 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：35；进样量：10 l；梯度洗脱程序如表 1 所示。2.3 溶液的制备 2.3.1 对照品储备液的制备精密称取 12 mg 氯尼达明加入 50%甲醇水溶液，涡旋震荡并超声溶解后定容至 10 ml 量瓶中，即得1.2 mg/ml 氯尼达明溶液；精密称取 10 mg 盐酸阿霉素加入 50%甲醇水溶液，涡旋震荡溶解后定容至 50 ml 量瓶中，即得 0.2 mg/ml 盐酸阿霉素溶液。2.3.2 混合对照品溶液的制备将“2.3.1”项中的溶液等体积混合后，量取一定体积的 50%甲醇水溶液稀释 2.5 倍，定容于 10 ml容量瓶中，即得氯尼达明与盐酸阿霉素质量浓度分别为 240 g/ml 和 40 g/ml 的混合溶液。2.4 系统适用性考察按照“2.3.1”项及“2.3.2”项条件，配制以下样品。按照“2.2”项下方法进样检测，考察方法的专属性。如图 2 所示，实验结果表明，该方法专属性良好，氯尼达明与盐酸阿霉素的色谱峰完全分离。2.5 线性关系考察精密量取不同体积“2.3.2”项下制备的混合对照品溶液，置于 5 ml 量瓶中，加溶剂稀释并定容，最终得到质量浓度为 240、180、120、60、30、12、6 g/ml 的氯尼达明溶液，此条件下，盐酸阿霉素的质量浓度分别为 40、30、20、10、5、2、1 g/ml。按上述“2.2”项下色谱条件进样，以对照品的峰面积（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，得氯尼达明回归方程：Y=51.439X+111.46，r=0.999 9，证明在本方法下，氯尼达明在 6240 g/ml 浓度范围内线性良好。得盐酸阿霉素回归方程：Y=25.142X+2.186 3，r=0.999 9，证明在本方法下，盐酸阿霉素在140 g/ml浓度范围内线性良好。2.6 精密度试验取氯尼达明质量浓度为 30、60、240 g/ml 的混合对照品溶液，按照“2.2”项下的色谱条件进行日内精密度及日间精密度考察。日内精密度测定方法为样品测定 5 次，计算日内相对偏差；日间精密度测定方法为样品连续测定 5 d，计算日间相对偏差。如表 2、表 3 所示，3 种不同浓度的氯尼达明和盐酸阿霉素的日内、日间精密度的 RSD 值均小于 2.0%，符合精密度要求。2.7 稳定性试验根 据 上 述 方 法 配 制 质 量 浓 度 分 别 为 60、10 g/ml 的氯尼达明、盐酸阿霉素混合溶液，分别在第 0、2、4、8、12、24 h 时进样，按照“2.2”项下色谱条件，进行含量测定，结果如表 4、表 5 所示，表明氯尼达明与盐酸阿霉素的混合溶液在 8 h 内稳定。表1梯度洗脱程序 时间（t/min）流动相A（%）流动相B（%）065353653579010139010156535206535 药学实践与服务2024 年 3 月 25 日第 42 卷第 3 期 128Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.3，March 25，2024 表4氯尼达明在不同时间下的稳定性考察 时间（t/h）RSD（%）00.2020.0740.0580.13120.12240.02 2.8 回收率试验精密称取 6 份 12 mg 氯尼达明和 10 mg 盐酸阿霉素，加入 50%甲醇水溶液，分别定容于 10 ml和 50 ml 容量瓶中，即得 1.2 mg/ml 氯尼达明溶液和 0.2 mg/ml 盐酸阿霉素溶液。将上述溶液等体积混合后，量取一定体积的50%甲醇水溶液稀释 2.5 倍，定容于 10 ml 容量瓶后，即得 6 份氯尼达明与盐酸阿霉素质量浓度分别为 240 g/ml 和 40 g/ml 的混合溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定，带入回归方程计算氯尼达明和盐酸阿霉素的含量、回收率和 RSD 值。结果如表 6所示。说明此方法回收率符合要求。表6回收率实验结果(n=6)成分原有量（m/mg）测得量（m/mg）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）氯尼达明12.011.898.399.22.912.111.998.311.911.899.212.412.898.411.811.8100.012.112.8105.8盐酸阿霉素10.19.897.0100.81.910.19.897.010.09.898.09.910.0101.010.110.099.010.110.2101.0 3讨论氯尼达明极性小，有机相比例的改变对其出峰 C123456789 10 11 12时间(t/min)D12123456789 10 11 12时间(t/min)A123456789 10 11 12时间(t/min)B123456789 10 11 12时间(t/min)图 2氯尼达明和盐酸阿霉素的 HPLC 图A.甲醇水溶液;B.盐酸阿霉素对照品;C.氯尼达明对照品;D.氯尼达明+盐酸阿霉素甲醇水溶液；1.盐酸阿霉素;2.氯尼达明 表2盐酸阿霉素精密度试验(n=5)浓度（B/gml1）日内RSD（%）日间RSD（%）51.401.48100.380.92400.110.06 表3氯尼达明精密度试验(n=5)浓度（B/gml1）日内RSD（%）日间RSD（%）300.030.19600.130.062400.110.07 表5盐酸阿霉素在不同时间下的稳定性考察 时间（t/h）RSD（%）00.3220.3840.1480.49120.62240.58 药学实践与服务2024 年 3 月 25 日第 42 卷第 3 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.3，March 25，2024129 时间影响较大。对于流动相的选择，本实验曾尝试以乙腈（0.1%TFA）-水（0.1%TFA）、乙腈：水（0.1%三乙胺，磷酸调 pH=3.0）、乙腈：水（0.1%甲酸）作为流动相15-17，但氯尼达明出峰时间过长且峰对称性差。以甲醇-水（0.1%TFA）作为流动相时，分离效果及峰形较好18，故分别考察了甲醇与水分别为 9010、8020、7030、6535 等比例下两种化合物的保留时间。结果表明，有机相甲醇比例低于 70%时，氯尼达明出峰时间过长。在溶剂的选择上，本实验尝试以甲醇、甲醇水溶液作为溶剂，当溶剂为甲醇水溶液时，盐酸阿霉素及氯尼达明两组不存在前沿及拖尾现象，且基线较平稳，分离度较好。故在此基础上，为缩短氯尼达明的出峰时间，我们尝试在 415 min内改变有机相比例，利用梯度洗脱以保证两种化合物出峰完整且保留时间适中。本实验结果表明，选用该梯度洗脱方法同时测定氯尼达明和盐酸阿霉素，在一定浓度范围内线性良好，专属性高，且精密度、回收率、稳定性均符合方法学要求，可以作为同时测定氯尼达明和盐酸阿霉素含量的测定方法。【参考文献】LU J Q,LI R,MU B S,et al.Multiple targeted doxorubicin-lonidamine liposomes modified with p-hydroxybenzoic acid andtriphenylphosphonium to synergistically treat gliomaJ.Eur JMed Chem,2022,230：114093.1 SCHIRONE L,DAMBROSIO L,FORTE M,et al.Mitochon-dria and doxorubicin-induced cardiomyopathy:a complex inter-playJ.Cells,2022,11（13）：2000.2 KITAKATA H,ENDO J,IKURA H,et al.Therapeutic targetsfor DOX-induced cardiomyopathy:role of apoptosis vs.ferrop-tosisJ.Int J Mol Sci,2022,23（3）：1414.3 WANG J,TANG W,YANG M,et al.Inflammatory tumormicroenvironment responsive neutrophil exosomes-based drugdelivery system for targeted glioma therapyJ.Biomaterials,2021,273：120784.4 TIAN W,XIE X J,CAO P L.Magnoflorine improves sensitivityto 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