猪胰脏制备.pptx

动物胰蛋白酶的制备及活力的测定动物胰蛋白酶的制备及活力的测定一、生物大分子制备概述一、生物大分子制备概述生物大分子主要是指蛋白质、多糖和核酸，这三类物质是生物大分子主要是指蛋白质、多糖和核酸，这三类物质是生命活动的物质基础。在自然科学，尤其是生命科学高度发展的生命活动的物质基础。在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、多糖和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是今天，蛋白质、多糖和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，没有能够达到足够纯度的生须首先解决生物大分子的制备问题，没有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。然物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作，而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作，有时制备一种高纯度的蛋白质、酶或核酸，要付出长期和艰苦的有时制备一种高纯度的蛋白质、酶或核酸，要付出长期和艰苦的努力。努力。生物材料的组成极其复杂，生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种常常包含有数百种乃至几千种化合物。乃至几千种化合物。生物大分子在生物材料中的含量极微。生物大分子在生物材料中的含量极微。只有万分之一、几十万分之只有万分之一、几十万分之一，甚至几百万分之一。分离纯化的步骤繁多，流程又长，有的目一，甚至几百万分之一。分离纯化的步骤繁多，流程又长，有的目的产物要经过十几步、几十步的操作才能达到所需纯度的要求。例的产物要经过十几步、几十步的操作才能达到所需纯度的要求。例如由脑垂体组织取得某些激素的释放因子，要用几吨甚至几十吨的如由脑垂体组织取得某些激素的释放因子，要用几吨甚至几十吨的生物生物材料，才能提取出几毫克的样品。材料，才能提取出几毫克的样品。生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活。因此分离过生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活。因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。过酸、过碱、高温、剧烈的搅拌、强辐射及本身的自溶等都会使生物酸、过碱、高温、剧烈的搅拌、强辐射及本身的自溶等都会使生物大分子变性而失活，所以分离纯化时一定要选用最适宜的环境和条大分子变性而失活，所以分离纯化时一定要选用最适宜的环境和条件。件。生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。断。与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：备有以下主要特点：1.1.确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、生产还确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、生产还是要发现新的物质。是要发现新的物质。2.2.建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键，建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键，因为它是整个分离纯化过程的因为它是整个分离纯化过程的“眼睛眼睛”。3.3.通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。化学性质。4.4.生物材料的破碎和预处理。生物材料的破碎和预处理。5.5.分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程 6.6.生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLCHPLC和毛细管电泳都是一个峰。和毛细管电泳都是一个峰。7.7.产物的浓缩，干燥和保存。产物的浓缩，干燥和保存。生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：二、生物大分子制备的前处理二、生物大分子制备的前处理（一）（一）生物材料的选择生物材料的选择制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。从从工工业业生生产产角角度度选选择择材材料料，应应选选择择含含量量高高、来来源源丰丰富富、制制备备工工艺艺简简单单、成成本低的原料。本低的原料。从科研工作的角度选材，则只须考虑材料的选择符合实验预定的目标要求从科研工作的角度选材，则只须考虑材料的选择符合实验预定的目标要求即可。除此之外，选材还应注意植物的季节性、地理位置和生长环境等。即可。除此之外，选材还应注意植物的季节性、地理位置和生长环境等。选动物材料时要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等。选动物材料时要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等。动物在饥饿时，脂类和糖类含量相对减少，有利于生物大分子的提取分离。动物在饥饿时，脂类和糖类含量相对减少，有利于生物大分子的提取分离。选微生物材料时要注意菌种的代数和培养基成分等之间的差异，例如在微选微生物材料时要注意菌种的代数和培养基成分等之间的差异，例如在微生物的对数期，酶和核酸的含量较高，可获得较高的产量。生物的对数期，酶和核酸的含量较高，可获得较高的产量。材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快加工处理，动物组织要材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快加工处理，动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。植物要先去取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。植物要先去壳、除脂。微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。生物材料如壳、除脂。微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。（二）（二）细胞的破碎细胞的破碎1机械法：机械法：1)研磨研磨将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆，即可将动物细胞破碎，这种方法比较温砂研磨或匀浆，即可将动物细胞破碎，这种方法比较温和，适宜实验室使用。工业生产中可用电磨研磨。细菌和，适宜实验室使用。工业生产中可用电磨研磨。细菌和植物组织细胞的破碎也可用此法。和植物组织细胞的破碎也可用此法。2)组织捣碎机组织捣碎机这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升温过高，通常是转温过高，通常是转10秒秒20秒，停秒，停10秒秒20秒，可反复秒，可反复多次。多次。2物理法：物理法：1)反复冻融法反复冻融法将待破碎的细胞冷至将待破碎的细胞冷至15到到20，然后放于室，然后放于室温温(或或40)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。破碎。2)超声波处理法超声波处理法此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些，处理的效碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些，处理的效果与样品浓度和使用频率有关。使用时注意降温，防果与样品浓度和使用频率有关。使用时注意降温，防止过热。止过热。3)压榨法压榨法这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000105Pa2000105Pa的高压下使几十毫升的细胞悬的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。这是一种较理想的破碎细胞的方法，但仪器用较高。这是一种较理想的破碎细胞的方法，但仪器用较高。4)冷热交替法冷热交替法从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。3化学与生物化学方法：化学与生物化学方法：1)自溶法自溶法将新鲜的生物材料存放于一定的将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来，酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来，此法称为自溶法。使用时要特别小心操作，因为水解此法称为自溶法。使用时要特别小心操作，因为水解酶不仅可以使细胞壁和膜破坏，同时也可能会把某些酶不仅可以使细胞壁和膜破坏，同时也可能会把某些要提取的有效成分分解了。要提取的有效成分分解了。2）溶胀法溶胀法细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。3)酶解法：酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37，pH8，处理，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解，释放出细胞内含物，分钟，可以专一性地将细胞壁分解，释放出细胞内含物，此法适用于多种微生物。例如从某些细菌细胞提取质粒此法适用于多种微生物。例如从某些细菌细胞提取质粒DNA时，可采时，可采用溶菌酶（来自蛋清）破细胞壁，而在破酵母细胞时，常采用蜗牛酶用溶菌酶（来自蛋清）破细胞壁，而在破酵母细胞时，常采用蜗牛酶（来自蜗牛），将酵母细胞悬于（来自蜗牛），将酵母细胞悬于0.1mmol/L柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液液(pH=5.4)中，加中，加1蜗牛酶，在蜗牛酶，在30处理处理30分钟，即可使大部分细胞分钟，即可使大部分细胞壁破裂，如同时加入壁破裂，如同时加入0.2疏基乙醇效果会更好。此法可以与研磨法联疏基乙醇效果会更好。此法可以与研磨法联合使用。合使用。4)有机溶剂处理法：有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。磨法联合使用。（三）（三）生物大分子的提取生物大分子的提取 “提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。1水溶液提取：水溶液提取：蛋蛋白白质质和和酶酶的的提提取取一一般般以以水水溶溶液液为为主主。稀稀盐盐溶溶液液和和缓缓冲冲液液对对蛋蛋白白质质的的稳稳定定性性好好，溶溶解解度度大大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是：用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是：1)盐浓度（即离子强度）：盐浓度（即离子强度）：绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为为“盐溶盐溶”现象。但中性盐的浓度增加至一定时，蛋白质的溶解度又现象。但中性盐的浓度增加至一定时，蛋白质的溶解度又逐渐下降，直至沉淀析出，称为逐渐下降，直至沉淀析出，称为“盐析盐析”现象。盐溶现象的产生主要现象。盐溶现象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。所以低盐溶液常用于大多加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。所以低盐溶液常用于大多数生化物质的提取。通常使用数生化物质的提取。通常使用0.02mol/L0.05mol/L缓冲液或缓冲液或0.09mol/L0.15mol/LNaCl溶液提取蛋白质和酶。不同的蛋白质极性大溶液提取蛋白质和酶。不同的蛋白质极性大小不同，为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水小不同，为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度（如加入溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或或(NH4)2SO4）可以增加溶液的极性。）可以增加溶液的极性。2)pH值：值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关。过酸、过碱值有关。过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在均应尽量避免，一般控制在pH=68范围内，提取溶剂的范围内，提取溶剂的pH应应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。碱性在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。碱性蛋白质选在偏酸一侧，酸性蛋白质选在偏碱的一侧，以增加蛋白蛋白质选在偏酸一侧，酸性蛋白质选在偏碱的一侧，以增加蛋白质的溶解度，提高提取效果。例如胰蛋白酶为碱性蛋白质，常用质的溶解度，提高提取效果。例如胰蛋白酶为碱性蛋白质，常用稀酸提取，而肌肉甘油醛稀酸提取，而肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，则常用稀磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，则常用稀碱来提取。碱来提取。3)温度：温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在05的低温操作。但少数对温度耐受力强的蛋白质和酶，可的低温操作。但少数对温度耐受力强的蛋白质和酶，可提高温度使杂蛋白变性，有利于提取和下一步的纯化。提高温度使杂蛋白变性，有利于提取和下一步的纯化。2有机溶剂提取有机溶剂提取 一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等。剂提取。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等。其中正丁醇在其中正丁醇在0时在水中的溶解度为时在水中的溶解度为10.5，40时为时为6.6，同时又用具有较强的亲脂性，因此常用来提取与脂结合较牢或含同时又用具有较强的亲脂性，因此常用来提取与脂结合较牢或含非极性侧链较多的蛋白质、酶和脂类。非极性侧链较多的蛋白质、酶和脂类。三、生物大分子的分离纯化三、生物大分子的分离纯化 1.沉淀法沉淀法沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。分离。在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：中中性性盐盐沉沉淀淀（盐盐析析法法）：多多用用于于各各种种蛋蛋白白质质和和酶酶的的分分离离纯化。纯化。蛋蛋白白质质和和酶酶均均易易溶溶于于水水，因因为为这这些些分分子子的的COOH、NH2和和OH都都是是亲亲水水基基团团，这这些些基基团团与与极极性性水水分分子子相相互互作作用用形形成成水水化化层层，包包围围于于蛋蛋白白质质分分子子周周围围形形成成1nm100nm颗颗粒粒的的亲亲水水胶胶体体，削削弱弱了了蛋蛋白白质质分分子子之之间间的的作作用用力力，蛋蛋白白质质分分子子表表面面极极性性基基团团越越多多，水水化化层层越越厚厚，蛋蛋白白质质分分子子与与溶溶剂剂分分子子之之间间的的亲亲和和力力越越大大，因因而而溶溶解解度度也也越越大大。亲亲水水胶胶体体在在水水中中的的稳稳定定因因素素有有两两个个：即即电电荷荷和和水水膜膜。因因为为中中性性盐盐的的亲亲水水性性大大于于蛋蛋白白质质和和酶酶分分子子的的亲亲水水性性，所所以以加加入入大大量量中中性性盐盐后后，夺夺走走了了水水分分子子，破破坏坏了了水水膜膜，暴暴露露出出疏疏水水区区域域，同同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。盐析的操作方法盐析的操作方法 最最常常用用的的是是固固体体硫硫酸酸铵铵加加入入法法。欲欲从从较较大大体体积积的的粗粗提提取取液液中中沉沉淀淀蛋蛋白白质质时时，往往往往使使用用固固体体硫硫酸酸铵铵，加加入入之之前前要要先先将将其其研研成成细细粉粉不不能能有有块块，要要在在搅搅拌拌下下缓缓慢慢均均匀匀少少量量多多次次地地加加入入，尤尤其其到到接接近近计计划划饱饱和和度度时时，加加盐盐的的速速度度更更要要慢慢一一些些，尽尽量量避避免免局局部部硫硫酸酸铵铵浓浓度度过过大大而而造造成成不不应应有有的的蛋蛋白白质质沉沉淀淀。盐盐析析后后要要在在冰冰浴浴中中放放置置一一段段时时间间，待待沉沉淀淀完完全全后后再再离离心心与与过过滤滤。在在低低浓浓度度硫硫酸酸铵铵中中盐盐析析可可采采用用离离心心分分离离，高高浓浓度度硫硫酸酸铵铵常常用用过过滤滤方方法法，因因为为高高浓浓度度硫硫酸酸铵铵密密度度太太大大，要要使使蛋蛋白白质质完完全全沉沉降降下下来来需需要要较较高高的的离离心心速速度度和和较较长长的的离心时间。离心时间。有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。值下易变性的杂蛋白。等电点沉淀等电点沉淀：用用于于氨氨基基酸酸、蛋蛋白白质质及及其其他他两两性性物物质质的的沉沉淀淀，但但此此法法单单独独应应用较少，多与其他方法结合使用。用较少，多与其他方法结合使用。有机聚合物沉淀：有机聚合物沉淀：是发展较快的一种新方法，是发展较快的一种新方法，主要使用主要使用PEG聚乙二醇（聚乙二醇（Polyethyeneglycol）作为沉淀剂。）作为沉淀剂。未得到充分的证实解释主要有：未得到充分的证实解释主要有：认为沉淀作用是聚合物与生物认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。大分子发生共沉淀作用。由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀。子脱水而发生沉淀。聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。复合物，在重力作用下形成沉淀析出。通过空间位置排斥，使液体通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。本方法的优点是：本方法的优点是：操作条件温和，不易引起生物大分子变性。操作条件温和，不易引起生物大分子变性。沉淀效能高，使用很少量的沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子。即可以沉淀相当多的生物大分子。沉淀后有机聚合物容易去除。沉淀后有机聚合物容易去除。2.分离纯化方法的选择分离纯化方法的选择生物大分子能否高效率地制备成功，关键在于分离纯化方案生物大分子能否高效率地制备成功，关键在于分离纯化方案的正确选择和各个分离纯化方法实验条件的探索。选择与探索的的正确选择和各个分离纯化方法实验条件的探索。选择与探索的依据就是生物大分子与杂质之间的生物学和物理化学性质上的差依据就是生物大分子与杂质之间的生物学和物理化学性质上的差异。异。制备生物大分子的方法可以粗略地分类如下：制备生物大分子的方法可以粗略地分类如下：以分子大以分子大小和形态的差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透小和形态的差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。析和凝胶过滤等。以溶解度的差异为依据的方法：盐析、萃取、以溶解度的差异为依据的方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。分配层析、选择性沉淀和结晶等。以电荷差异为依据的方法：以电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。以以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等。生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等。从从动动物物胰胰脏脏中中提提取取胰胰蛋蛋白白酶酶时时，一一般般是是用用稀稀酸酸溶溶液液将将胰胰腺腺细细胞胞中中含含有有的的酶酶原原提提取取出出来来，然然后后再再根根据据等等电电点点沉沉淀淀的的原原理理，调调节节pH以以沉沉淀淀除除去去大大量量的的酸酸性性杂杂蛋蛋白白以以及及非非蛋蛋白白杂杂质质，再再以以硫硫酸酸铵铵分分级级盐盐析析将将胰胰蛋蛋白白酶酶原原等等（包包括括大大量量糜糜蛋蛋白白酶酶原原和和弹弹性性蛋蛋白白酶酶原原）沉沉淀淀析析出出。经经溶溶解解后后，以以极极少少量量活活性性胰胰蛋蛋白白酶酶激激活活，使使其其酶酶原原转转变变为为有有活活性性的的胰胰蛋蛋白白酶酶（糜糜蛋蛋白白酶酶和和弹弹性性蛋蛋白白酶酶同同时时也也被被激激活活），被被激激活活的的酶酶溶溶液液再再以以盐盐析析分分级级的的方方法法除除去去糜糜蛋蛋白白酶酶及及弹弹性性蛋蛋白白酶酶等等组组分分。收收集集含含胰胰蛋蛋白白酶酶的的级级分分，并并用用结结晶晶法法进进一一步步分分离离纯纯化化。一一般般经经过过23次次结结晶晶后后，可可获获得得相相当当纯纯的的胰胰蛋蛋白白酶酶，其其比比活活力力可可达达到到800010000BAEE单单位位/毫毫克克蛋蛋白白，或更高。或更高。胰蛋白酶制备基本原理胰蛋白酶制备基本原理一、试剂一、试剂pH2.5乙酸酸化水；硫酸铵。二、材料二、材料新鲜或冰冻动物胰脏 猪胰蛋白酶原的提取猪胰蛋白酶原的提取1.称称取取适适量量动动物物胰胰脏脏（新新鲜鲜的的或或杀杀后后立立即即冷冷藏藏的的），除除去去脂脂肪肪和和结缔组织后，绞碎。结缔组织后，绞碎。2.加加入入2倍倍体体积积预预冷冷的的乙乙酸酸酸酸化化水水（pH2.5）于于1015搅搅拌拌提提取取24小小时时，四四层层纱纱布布过过滤滤得得乳乳白白色色滤滤液液，用用2.5MH2SO4调调pH至至2.53.0，放置，放置12小时后，小时后，3000r/min,10min离心，得黄色透明上清液。离心，得黄色透明上清液。3.分分多多批批加加入入固固体体硫硫酸酸铵铵（予予先先研研细细），使使溶溶液液达达0.75饱饱和和度度（每每升升滤滤液液加加492克克）放放置置过过夜夜后后，3000r/min,15min离离心心，得得胰胰蛋蛋白白酶原粗制品。酶原粗制品。注意事项注意事项：1、所用胰脏应是刚屠宰的新鲜组织。、所用胰脏应是刚屠宰的新鲜组织。2、盐析沉淀后，需在低温下放置若干时间。时间过短影响分、盐析沉淀后，需在低温下放置若干时间。时间过短影响分离效果和产率。离效果和产率。