TGTM011-2022微生物肥料中粪大肠菌群检测操作规程.pdf

团体标准T/GTM011-2022微生物肥料中粪大肠菌群检测操作规程Practice for detection of fecal cruciform bacteriain microbial fertilizers2022-10-14发布2022-10-25实施北京国农科技特派员创新战略联盟发布全国团体标准信息平台T/GTM011-2022I前前言言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由保定多微质检技术服务有限公司提出。本文件由北京国农科技特派员创新战略联盟归口。本文件起草单位：保定多微质检技术服务有限公司、微生物肥料技术研究推广中心、北京国农科技特派员创新战略联盟、河北神微环境治理有限公司、河北昱鼎生物科技有限公司。本文件主要起草人：黄思迪、王文磊、陈明涛、景玉蓉、刘亚楠、孟庆伟、张少骅、江洋、王宏杰、顾殊瑜、柳慧静。本文件为首次发布。全国团体标准信息平台T/GTM011-20221微生物肥料中粪大肠菌群检测操作规程微生物肥料中粪大肠菌群检测操作规程1 1范围范围本文件规定了测定微生物肥料中粪大肠菌群的多管发酵法。本文件适用于微生物肥料中粪大肠菌群的检测。2 2规范性引用文件规范性引用文件下列文件中的条款通过本文件的引用而成为本文件的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本文件。GB/T 19524.1-2004肥料中粪大肠菌群的测定GB 20287-2006农用微生物菌剂NY/T 798-2015复合微生物肥料NY 884-2012生物有机肥NY/T 2321-2013微生物肥料产品检验规程3 3术语和定义术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1粪大肠菌群一群在44.50.5条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。3.2最可能数又称稀释培养计数，是一种基于泊松分布的间接计数法。利用统计学原理，根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表估算一定体积样品中目标微生物存在的数量（单位体积存在目标微生物的最大可能数）。4 4方法原理方法原理将样品加入含乳糖胆盐培养基的试管中，44.50.5发酵培养，培养基中的胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，44.5初发酵富集培养，大肠菌群在培养基中生长繁殖分解乳糖产酸产气，产生的酸使溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，产生的气体进入套管中，指示产气。37复发酵培养，最后产气的细菌确定为是粪大肠菌群。通过查MPN表，得出粪大肠全国团体标准信息平台T/GTM011-20222菌群浓度值。5 5仪器设备仪器设备5.1高压蒸汽灭菌器：115、121可调。5.2恒温水浴或隔水式培养箱：允许温度偏差361、440.5。5.3酸度计：准确到0.1pH值单位。5.4接种环：直径3mm。5.5试管：（15mmX150mm）。5.6般实验室常用仪器和设备：小套管（杜兰管）；移液管；三角瓶；培养皿；载玻片；玻璃珠；酒精灯；显微镜；恒温旋转式摇床；干燥箱；天平试；管架。6 6培养基和试剂培养基和试剂除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂或生物试剂，实验用水为蒸馏水或去离子水。6.1培养基：参照GB/T 19524.1-2004肥料中粪大肠菌群的测定附录A的内容。6.2革兰氏染色液：参照GB/T 19524.1-2004肥料中粪大肠菌群的测定附录B的内容。6.3无菌水：取适量实验用水或生理盐水，经121高温蒸汽灭菌30min，备用。7 7采样采样7.1样品采集参照农用微生物菌剂GB 20287-2006、复合微生物肥料NY/T 798-2015、生物有机肥NY 884-2012和微生物肥料产品检验规程NY/T 2321-2013中有关样品抽样的相关内容，进行样品的采集工作。7.2样品保存参照农用微生物菌剂GB 20287-2006、复合微生物肥料NY/T 798-2015、生物有机肥NY 884-2012和微生物肥料产品检验规程NY/T 2321-2013中有关样品留样、保存的相关内容，进行样品的保存工作。8 8检验步骤检验步骤8.1样品稀释参照肥料中粪大肠菌群的测定GB/T 19524.1-2004的内容。8.2乳糖发酵试验全国团体标准信息平台T/GTM011-20223参照肥料中粪大肠菌群的测定GB/T 19524.1-2004的内容。8.3分离培养参照肥料中粪大肠菌群的测定GB/T 19524.1-2004的内容。8.4证实试验参照肥料中粪大肠菌群的测定GB/T 19524.1-2004的内容。8.5对照实验8.5.1空白对照每次试验都需使用无菌水按照步骤8.2、8.3、8.4进行实验室空白测定。8.5.2阳性及阴性对照将粪大肠菌群的阳性标准菌株（如大肠埃希氏菌）和阴性标准菌株（如产气肠杆菌）制成目标浓度的菌悬液，分别吸取相应体积的菌悬液按检测步骤进行培养、观察。检测结果应为阳性菌株应呈现阳性反应，阴性菌株应呈现阴性反应，否则，该批次样品检测结果无效，需分析原因后重新进行测定。9 9结果结果计算与表示计算与表示证实试验结果为粪大肠菌群阳性的，根据阳性发酵管数，查MPN检索表，可得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。9.1结果计算接种9份样品时，查MPN检索表，可得每克/毫升肥料中粪大肠菌群MPN值，按照下方公式换算样品中粪大肠菌群数：C=MPN值/f式中：C样品中粪大肠菌群数，（个/g或个/ml）；MPN值每克（或毫升）样品中粪大肠菌群数最可能数；f实际样品最大接种量，ml。9.2结果表示测定结果保留至整数位，保留两位有效数字。当测定结果100个/g（或个/ml）时，以科学计数法表示；当测定结果未检出时，以“未检出”表示。1010质量保证和质量控制质量保证和质量控制10.1培养基验收更换不同批次培养基时要进行验收检测，将粪大肠菌群的阳性标准菌株和阴性标准菌株制成目标浓度的菌悬液。使用定性标准菌株时，先进行预实验，摸清浓度后进行稀释；使用全国团体标准信息平台T/GTM011-20224定量标准菌株时，则可按照给定值直接稀释。稀释后分别吸取相应体积的菌悬液按检测步骤进行培养、观察，阳性菌株应呈现阳性反应，阴性菌株应呈现阴性反应。则本批次培养基验收合格。10.2对照试验10.2.1空白对照每次试验都要用无菌水做实验室空白对照（8.5.1），培养后的试管中不得有任何颜色变化。否则，该批次样品测定结果无效，需分析原因后重新进行测定。10.2.2阳性及阴性对照定期按照（8.5.2）进行阳性标准菌株及阴性标准菌株对照试验，阳性菌株应呈现阳性反应，阴性菌株应呈现阴性反应。否则，该批次样品测定结果无效，需分析原因后重新进行测定。10.2.3废物处理使用后的废弃物及器皿须经121高温蒸汽灭菌30min或使用市售消毒液浸泡灭菌。器皿灭菌后方可清洗，废弃物作为一般废物进行处理。全国团体标准信息平台