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酶工程酶工程Enzyme EngineeringEnzyme Engineering第五章第五章 化学酶工程化学酶工程第第1页页第一节第一节 酶分子化学修饰酶分子化学修饰第二节第二节 模拟酶模拟酶第三节第三节 抗体酶抗体酶第四节第四节 印迹酶印迹酶第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第第2页页第一节第一节 酶分子化学修饰酶分子化学修饰游离酶缺点：游离酶缺点：抗原性；抗原性；稳定性差；稳定性差；活性不够高。活性不够高。第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第第3页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程广义：广义：凡是经过化学方法和伎俩或是经过化学反应使酶分子结凡是经过化学方法和伎俩或是经过化学反应使酶分子结构发生改变技术或过程，都可称为酶化学修饰。构发生改变技术或过程，都可称为酶化学修饰。狭义：狭义：酶化学修饰则主要是指在较温和条件下，以可控方式使酶化学修饰则主要是指在较温和条件下，以可控方式使酶同一些化学试剂发生特异反应，从而引发单个氨基酸残基或酶同一些化学试剂发生特异反应，从而引发单个氨基酸残基或其功效基团发生共价化学改变过程。其功效基团发生共价化学改变过程。定义定义第一节第一节 酶分子化学修饰酶分子化学修饰第第4页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程酶化学修饰目标酶化学修饰目标：人为地改变天然酶一些性质，创造天然酶人为地改变天然酶一些性质，创造天然酶所不具备一些优良特征甚至创造出新特征，扩大酶应用领域。所不具备一些优良特征甚至创造出新特征，扩大酶应用领域。酶化学修饰后改变酶化学修饰后改变：改变活性部位构象。改变活性部位构象。提升生物活性。提升生物活性。增强酶稳定性。增强酶稳定性。降低酶类药品抗原性。降低酶类药品抗原性。改变酶学性质。改变酶学性质。第一节第一节 酶分子化学修饰酶分子化学修饰第第5页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程酶化学修饰原理酶化学修饰原理利用化学修饰剂所含有各种基团特征，直接或间接地经过一定活利用化学修饰剂所含有各种基团特征，直接或间接地经过一定活化过程与酶分子某种氨基酸残基发生化学反应，从而使酶分子结化过程与酶分子某种氨基酸残基发生化学反应，从而使酶分子结构发生改变。构发生改变。被修饰酶。被修饰酶。修饰剂选择。修饰剂选择。修饰反应条件选择。修饰反应条件选择。第一节第一节 酶分子化学修饰酶分子化学修饰考虑原因考虑原因第第6页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程 酶分子侧链基团化学修饰酶分子侧链基团化学修饰 酶分子表面化学修饰酶分子表面化学修饰方法及修饰剂方法及修饰剂第一节第一节 酶分子化学修饰酶分子化学修饰第第7页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程采取一些可溶性大分子物质经过共价键将其连接到酶分子表面，采取一些可溶性大分子物质经过共价键将其连接到酶分子表面，使之在酶表面形成覆盖层，从而使酶性质发生改变，以满足人们使之在酶表面形成覆盖层，从而使酶性质发生改变，以满足人们需要。需要。惯用大分子修饰剂惯用大分子修饰剂：聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清白聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清白蛋白。蛋白。常见修饰方法常见修饰方法：溴化氰法、高碘酸氧化法、戊二醛法、叠氮法、：溴化氰法、高碘酸氧化法、戊二醛法、叠氮法、琥珀酸法、三氯均嗪法。琥珀酸法、三氯均嗪法。酶分子表面化学修饰酶分子表面化学修饰第一节第一节 酶分子化学修饰酶分子化学修饰第第8页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程酶分子侧链基团化学修饰酶分子侧链基团化学修饰酶蛋白侧链主要包含酶蛋白侧链主要包含氨氨基基、羧基羧基、巯基巯基、胍基胍基、酚基酚基等。侧链基团一旦等。侧链基团一旦改变将引发酶蛋白空间改变将引发酶蛋白空间构象改变，从而改变酶构象改变，从而改变酶特征和功效。特征和功效。第一节第一节 酶分子化学修饰酶分子化学修饰第第9页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程氨基化学修饰氨基化学修饰（赖氨酸）（赖氨酸）乙酸酐乙酸酐2,4,62,4,6三硝基苯磺酸三硝基苯磺酸第第10页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程2,42,4二硝基氟苯二硝基氟苯碘乙酸碘乙酸氨基化学修饰氨基化学修饰（赖氨酸）（赖氨酸）酶分子侧链基团化学修饰酶分子侧链基团化学修饰第第11页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程丹璜酰氯丹璜酰氯氨基化学修饰氨基化学修饰（赖氨酸）（赖氨酸）酶分子侧链基团化学修饰酶分子侧链基团化学修饰第第12页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程羧基化学修饰羧基化学修饰 （谷氨酸、天冬氨酸）（谷氨酸、天冬氨酸）碳二亚胺碳二亚胺硼氟化三甲烊盐硼氟化三甲烊盐第第13页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程巯基化学修饰巯基化学修饰 （半胱氨酸）（半胱氨酸）5,5/-二硫代二硫代 双（双（2-硝基苯甲硝基苯甲酸）酸）4,4/-二硫二吡二硫二吡啶啶对氯汞苯甲酸对氯汞苯甲酸第第14页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程N-乙基乙基 马来酰亚胺马来酰亚胺2-氯汞氯汞-4-硝基苯酚硝基苯酚巯基化学修饰巯基化学修饰 （半胱氨酸）（半胱氨酸）第第15页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程组氨酸咪唑基化学修饰组氨酸咪唑基化学修饰碘乙酸碘乙酸焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯酶分子侧链基团化学修饰酶分子侧链基团化学修饰第第16页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程精氨酸胍基化学修饰精氨酸胍基化学修饰丁二酮丁二酮1,2-环己二酮环己二酮丁二酮丁二酮1,2-环己二酮环己二酮第第17页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程苯乙二醛苯乙二醛精氨酸胍基化学修饰精氨酸胍基化学修饰酶分子侧链基团化学修饰酶分子侧链基团化学修饰第第18页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程色氨酸吲哚基化学修饰色氨酸吲哚基化学修饰2 羟基羟基 5-硝基苄硝基苄溴溴4-硝基苯硫氯硝基苯硫氯第第19页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程酪氨酸残基和脂肪族氨基酸残基羟基化学修饰酪氨酸残基和脂肪族氨基酸残基羟基化学修饰N-乙酰咪唑乙酰咪唑酶分子侧链基团化学修饰酶分子侧链基团化学修饰第第20页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程丝氨酸残基丝氨酸残基-二异丙基氟磷酸酯二异丙基氟磷酸酯四硝基甲烷四硝基甲烷酪氨酸残基和脂肪族氨基酸残基羟基化学修饰酪氨酸残基和脂肪族氨基酸残基羟基化学修饰第第21页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程甲硫氨酸残基化学修饰甲硫氨酸残基化学修饰甲硫氨酸亚砜甲硫氨酸亚砜过甲酸过甲酸碘乙酰胺碘乙酰胺第第22页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第第23页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程采取一些可溶性大分子物质经过共价键将其连接到酶分子表面，采取一些可溶性大分子物质经过共价键将其连接到酶分子表面，使之在酶表面形成覆盖层，从而使酶性质发生改变，以满足人们使之在酶表面形成覆盖层，从而使酶性质发生改变，以满足人们需要。需要。惯用大分子修饰剂惯用大分子修饰剂：聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清白：聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清白蛋白。蛋白。常见修饰方法常见修饰方法：溴化氰法、高碘酸氧化法、戊二醛法、叠氮法、：溴化氰法、高碘酸氧化法、戊二醛法、叠氮法、琥珀酸法、三氯均嗪法。琥珀酸法、三氯均嗪法。酶分子表面化学修饰酶分子表面化学修饰第一节第一节 酶分子化学修饰酶分子化学修饰第第24页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程聚乙二醇对酶修饰聚乙二醇对酶修饰 （单甲氧基聚乙二醇（单甲氧基聚乙二醇MPEG）MPEG均三嗪类衍生物均三嗪类衍生物MPEG1MPEG2第第25页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程聚乙二醇对酶修饰聚乙二醇对酶修饰 （单甲氧基聚乙二醇（单甲氧基聚乙二醇MPEG）第第26页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程MPEG氨基类衍生物氨基类衍生物蜂巢型蜂巢型MPEG聚乙二醇对酶修饰聚乙二醇对酶修饰 （单甲氧基聚乙二醇（单甲氧基聚乙二醇MPEG）第一节第一节 酶分子化学修饰酶分子化学修饰第第27页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯对酶修饰右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯对酶修饰右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯分子中多糖链上羟基经活化后可与酶右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯分子中多糖链上羟基经活化后可与酶分子上氨基结合。分子上氨基结合。（右旋糖酐）（右旋糖酐）第第28页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程羟基活化羟基活化-溴化氰法溴化氰法第第29页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程羟基活化羟基活化-高碘酸氧化法高碘酸氧化法第第30页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程糖肽对酶修饰糖肽对酶修饰异氰酸法异氰酸法戊二醛法戊二醛法第第31页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程含有生物活性大分子对酶修饰含有生物活性大分子对酶修饰肝素是一个含硫酸酯黏多糖，由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子肝素是一个含硫酸酯黏多糖，由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成，平均分子量量0左右。左右。肝素增加酶稳定性，因为肝素在体内还含有抗凝血、抗血栓、肝素增加酶稳定性，因为肝素在体内还含有抗凝血、抗血栓、降血脂等活性，极适适用来修饰血栓溶解酶而增加其疗效。降血脂等活性，极适适用来修饰血栓溶解酶而增加其疗效。第第32页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程碳二亚胺法碳二亚胺法第第33页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程三氯均嗪法三氯均嗪法第第34页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程蛋白质或其它大分子对酶修饰蛋白质或其它大分子对酶修饰修饰剂：人血清白蛋白修饰剂：人血清白蛋白修饰方法：戊二醛法、羰二亚胺法、活化酯法修饰方法：戊二醛法、羰二亚胺法、活化酯法活化酯法活化酯法琥珀酸酐琥珀酸酐第第35页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程影响酶化学修饰原因影响酶化学修饰原因反应时间影响反应时间影响分子量影响分子量影响pH对化学修饰影响对化学修饰影响修饰剂与酶用量之比对修饰效果影响修饰剂与酶用量之比对修饰效果影响温度影响温度影响第一节第一节 酶分子化学修饰酶分子化学修饰第第36页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程修饰酶性质修饰酶性质修饰酶稳定性得到提升修饰酶稳定性得到提升-热稳定性、耐蛋白水解酶稳定性。热稳定性、耐蛋白水解酶稳定性。修饰酶抗原性得到降低修饰酶抗原性得到降低-PEG和人血清白蛋白效果显著。和人血清白蛋白效果显著。修饰酶半衰期得到延长修饰酶半衰期得到延长-保持药用酶体内疗效保持药用酶体内疗效修饰酶最适修饰酶最适pH改变改变-在生理和临床应用上含有主要意义。在生理和临床应用上含有主要意义。修饰酶动力学性质修饰酶动力学性质-Vmax没有改变，有些没有改变，有些Km会增大。会增大。第一节第一节 酶分子化学修饰酶分子化学修饰第第37页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程概述概述模拟天然酶（生物酶）结构、特征、作用原理及其在生物体内模拟天然酶（生物酶）结构、特征、作用原理及其在生物体内化学反应过程，人工合成含有分子识别和催化能力化合物质，化学反应过程，人工合成含有分子识别和催化能力化合物质，称为称为模拟酶模拟酶天然酶缺点：天然酶缺点：很轻易受到各种物理、化学及生物影响而失活。很轻易受到各种物理、化学及生物影响而失活。第二节第二节 模拟酶模拟酶第第38页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程当前模拟酶研究方向：当前模拟酶研究方向：模拟酶金属辅基。模拟酶金属辅基。模拟酶活性功效基。模拟酶活性功效基。模拟酶高分子作用方式。模拟酶高分子作用方式。模拟酶与底物作用。模拟酶与底物作用。模拟酶性状。模拟酶性状。第二节第二节 模拟酶模拟酶第第39页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程酶学基础：酶学基础：Pauling稳稳定过渡态理论定过渡态理论酶先结合底物，进而选择性酶先结合底物，进而选择性地让底物稳定处于某一特定地让底物稳定处于某一特定反应过渡态，降低反应活化反应过渡态，降低反应活化能，从而加速反应速度。能，从而加速反应速度。模拟酶理论基础：模拟酶理论基础：第二节第二节 模拟酶模拟酶第第40页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程超分子化学基础超分子化学基础-Pederson、Cram、Lehn提出：提出：超分子形成源于超分子形成源于底物和受体结合，这种底物和受体结合，这种结合基于非共价键相互结合基于非共价键相互作用，如静电作用、氢作用，如静电作用、氢键和范德华力等。键和范德华力等。模拟酶理论基础：模拟酶理论基础：第二节第二节 模拟酶模拟酶第第41页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程模拟酶分类模拟酶分类主主-客体酶模型，包含环糊精、冠醚、穴醚、杂环大环化合物客体酶模型，包含环糊精、冠醚、穴醚、杂环大环化合物 分子印迹酶分子印迹酶 抗体酶抗体酶胶束酶模型胶束酶模型肽酶肽酶半合成酶。半合成酶。依据模拟酶属性可分为：依据模拟酶属性可分为：第二节第二节 模拟酶模拟酶第第42页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程环糊精环糊精是直链淀粉在芽孢杆菌产生环糊精葡萄糖基转移酶作用下是直链淀粉在芽孢杆菌产生环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成一系列环状低聚糖总称，通常含有生成一系列环状低聚糖总称，通常含有612个个D-吡喃葡萄糖单吡喃葡萄糖单元。元。环糊精中各葡萄糖单元均以环糊精中各葡萄糖单元均以1,4糖苷键结合成环，空间结构呈锥糖苷键结合成环，空间结构呈锥形圆环。环糊精外缘亲水而内腔疏水，所以能像酶一样提供一个形圆环。环糊精外缘亲水而内腔疏水，所以能像酶一样提供一个疏水结合部位。疏水结合部位。环糊精模拟酶环糊精模拟酶第二节第二节 模拟酶模拟酶第第43页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程环糊精环糊精葡萄糖单元数量不一样可分为葡萄糖单元数量不一样可分为(6个个)，(7个个)及及(8个个)环糊精三种环糊精三种，每个葡萄糖残基均展现无扭曲变形椅式构象，每个葡萄糖残基均展现无扭曲变形椅式构象，葡萄糖单元均以葡萄糖单元均以1,4糖苷键结合成环，糖苷键结合成环，内有空穴，内有空穴，疏水。外缘亲水疏水。外缘亲水第第44页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程环糊精模拟酶所含有催化作用（活性）：环糊精模拟酶所含有催化作用（活性）：水解酶活性水解酶活性 核酸酶活性核酸酶活性 转氨酶活性转氨酶活性 桥联欢糊精仿酶桥联欢糊精仿酶氧化和水解酶活性氧化和水解酶活性 环糊精模拟酶环糊精模拟酶第二节第二节 模拟酶模拟酶第第45页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程大环聚醚按结构可分为：冠醚、穴醚、球醚。大环聚醚按结构可分为：冠醚、穴醚、球醚。冠醚冠醚是指含杂原子是指含杂原子单环化合物，单环化合物，穴醚穴醚是指含杂原子双环化合物，是指含杂原子双环化合物，球醚球醚是指含有杂原是指含有杂原子球状大环醚。子球状大环醚。大环聚醚模拟酶活性大环聚醚模拟酶活性：水解酶活性水解酶活性肽合成酶活性肽合成酶活性大环聚醚及其模拟酶大环聚醚及其模拟酶第二节第二节 模拟酶模拟酶Lehn第第46页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程杯芳烃杯芳烃是由苯酚及其衍生物与甲醛缩合而成，分子上缘由苯环是由苯酚及其衍生物与甲醛缩合而成，分子上缘由苯环对位取代基组成，下缘紧密排列着酚羟基，中间是苯环组成富对位取代基组成，下缘紧密排列着酚羟基，中间是苯环组成富含含电子疏水空腔，其上缘亲油，下缘亲水，可与中性分子和电子疏水空腔，其上缘亲油，下缘亲水，可与中性分子和极性离子等各种物质结合。极性离子等各种物质结合。模拟水解酶活性。模拟水解酶活性。杯芳烃及其模拟酶杯芳烃及其模拟酶第二节第二节 模拟酶模拟酶第第47页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程金属卟啉金属卟啉能够模拟以金属离子为辅基或辅酶天然酶。卟啉是能够模拟以金属离子为辅基或辅酶天然酶。卟啉是含有四个吡咯分子大环聚合物，主要骨架是卟吩。金属卟啉含有四个吡咯分子大环聚合物，主要骨架是卟吩。金属卟啉分子含有以共轭大分子含有以共轭大电子体系，金属原子价改变为基础氧化电子体系，金属原子价改变为基础氧化还原性质，因而可作为与分子氧相关氧化还原酶模拟酶。还原性质，因而可作为与分子氧相关氧化还原酶模拟酶。金属卟啉及其模拟酶金属卟啉及其模拟酶第二节第二节 模拟酶模拟酶第第48页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程肽酶肽酶是模拟天然酶活性部位，人工合成含有催化活性多肽。是模拟天然酶活性部位，人工合成含有催化活性多肽。环肽在分子识别方面更含有优势。环肽在分子识别方面更含有优势。肽酶肽酶1977年人工合成八肽年人工合成八肽Glu-Phe-Ala-Glu-Glu-Ala-Ser-Phe含含有溶菌酶有溶菌酶(lysozyme)活性，其活力可到达天然酶活性，其活力可到达天然酶50%。第二节第二节 模拟酶模拟酶第第49页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程抗体酶催化特征抗体酶催化特征含有催化化学反应能力单克隆抗体，称为含有催化化学反应能力单克隆抗体，称为抗体酶抗体酶，又称为催化性抗体。又称为催化性抗体。抗体酶理论基础及研究背景抗体酶理论基础及研究背景酶催化机制：过渡态理论。（酶催化机制：过渡态理论。（1946，Pauling）免疫诱导产生底物过渡态抗体，抗体含有催化性能免疫诱导产生底物过渡态抗体，抗体含有催化性能（1969，Jencks）单克隆抗体技术发展。（单克隆抗体技术发展。（1975，Kohler,Milstein）第一个催化酯水解抗体酶。（第一个催化酯水解抗体酶。（1986，Lerner,Schultz）第三节第三节 抗体酶抗体酶第第50页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程抗体酶特点抗体酶特点能催化一些天然酶不能催化反应能催化一些天然酶不能催化反应有更高专一性和稳定性有更高专一性和稳定性催化作用机制不一样。催化作用机制不一样。抗体酶和非催化抗体作用比较抗体酶和非催化抗体作用比较反应特异性反应特异性反应可逆性反应可逆性反应量效关系反应量效关系反应过程。反应过程。第三节第三节 抗体酶抗体酶第第51页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程抗体酶催化作用机制抗体酶催化作用机制过渡态理论过渡态理论抗体酶催化反应类型抗体酶催化反应类型转酰基反应转酰基反应磷酸酯水解反应磷酸酯水解反应磺酸酯闭环反应磺酸酯闭环反应Claisen重排反应重排反应脱羧反应脱羧反应金属螯合反应金属螯合反应第三节第三节 抗体酶抗体酶第第52页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程抗体酶制备标准抗体酶制备标准利用某一反应利用某一反应过渡态类似物过渡态类似物作为免疫原，则可诱导得到催化该作为免疫原，则可诱导得到催化该反应抗体酶。过渡态类似物结构稳定，可化学合成。反应抗体酶。过渡态类似物结构稳定，可化学合成。当前制备抗体酶主要步骤当前制备抗体酶主要步骤：依据催化目标，经过化学反应合成：依据催化目标，经过化学反应合成模型化合物（过渡态类似物），并与载体蛋白偶联成人工抗原，模型化合物（过渡态类似物），并与载体蛋白偶联成人工抗原，制备含有催化活性单克隆抗体。制备含有催化活性单克隆抗体。抗原设计是制备抗体酶关键抗原设计是制备抗体酶关键。策略：策略：利用抗体稳定带电过渡态利用抗体稳定带电过渡态抗体作为熵阱抗体作为熵阱抗体静电互补效应抗体静电互补效应第三节第三节 抗体酶抗体酶第第53页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程当前制备抗体酶主要方法当前制备抗体酶主要方法：依据催化目标，经过化学反应合成：依据催化目标，经过化学反应合成模型化合物（过渡态类似物），并与载体蛋白偶联成人工抗原，模型化合物（过渡态类似物），并与载体蛋白偶联成人工抗原，制备含有催化活性单克隆抗体。制备含有催化活性单克隆抗体。拷贝法拷贝法化学诱变法。化学诱变法。蛋白质工程技术。蛋白质工程技术。相同分子诱导法。相同分子诱导法。共价抗原免疫法。共价抗原免疫法。抗体酶制备方法抗体酶制备方法第三节第三节 抗体酶抗体酶第第54页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程利用过渡态类似物制备抗体酶利用过渡态类似物制备抗体酶抗体酶制备方法抗体酶制备方法第三节第三节 抗体酶抗体酶第第55页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程使不可能发生化学反应称为可能。使不可能发生化学反应称为可能。使苛刻条件下化学反应在温和条件下实现。使苛刻条件下化学反应在温和条件下实现。选择性催化平行反应中某一反应。选择性催化平行反应中某一反应。制备蛋白质氨基酸序列快速分析抗体酶。制备蛋白质氨基酸序列快速分析抗体酶。制备水解病毒蛋白抗体酶。制备水解病毒蛋白抗体酶。指导未知酶寻找。指导未知酶寻找。为化学反应机理研究提供依据。为化学反应机理研究提供依据。抗体酶应用前景抗体酶应用前景第三节第三节 抗体酶抗体酶第第56页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程分子印迹原理分子印迹原理以一个分子作为模板，在其周围用聚合物交联，当除去该分子以一个分子作为模板，在其周围用聚合物交联，当除去该分子时，聚合物中间留下与该分子形状相同空穴，这种空穴就有可时，聚合物中间留下与该分子形状相同空穴，这种空穴就有可能对该分子含有选择性识别结合能力能对该分子含有选择性识别结合能力。该化合物分子叫。该化合物分子叫印迹印迹分子分子，也叫，也叫模板分子模板分子。聚合物称为分子。聚合物称为分子印迹聚合物印迹聚合物。制备对某一化合物分子含有选择性识别结合聚合物过程称为制备对某一化合物分子含有选择性识别结合聚合物过程称为分分子印迹子印迹（技术）（技术）第四节第四节 印迹酶印迹酶第第57页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程分子印迹原理分子印迹原理第四节第四节 印迹酶印迹酶第第58页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程选定印迹分子和功效性单体，选定印迹分子和功效性单体，使二者发生互补反应；使二者发生互补反应；在印迹分子在印迹分子功效性单体复功效性单体复合物周围发生交联聚合；合物周围发生交联聚合；用抽提法从聚合物中除掉印用抽提法从聚合物中除掉印迹分子。迹分子。分子印迹技术普通过程：分子印迹技术普通过程：第四节第四节 印迹酶印迹酶第第59页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程分子印迹技术分类分子印迹技术分类预组织法预组织法又称共价法。印迹分子先经过共价键与功效性单体结合，聚合又称共价法。印迹分子先经过共价键与功效性单体结合，聚合后再将共价键断裂除去印迹分子。后再将共价键断裂除去印迹分子。功效单体：含有乙烯基硼酸、醛、胺、酚、醇等。功效单体：含有乙烯基硼酸、醛、胺、酚、醇等。共价化合物：共价化合物：硼酸酯硼酸酯、亚胺、希夫碱、缩醛酮等。、亚胺、希夫碱、缩醛酮等。特点特点：结合基团定位准确，对印迹分子选择性高；共价键结合结合基团定位准确，对印迹分子选择性高；共价键结合较牢靠，对印迹分子识别和解离较慢。较牢靠，对印迹分子识别和解离较慢。第四节第四节 印迹酶印迹酶第第60页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程又称非共价法。印迹分子与功效性单体自组织排列，以非共价又称非共价法。印迹分子与功效性单体自组织排列，以非共价键自发形成含有多个作用位点复合物。键自发形成含有多个作用位点复合物。功效单体：丙烯酸、丙烯酰胺、含有乙烯基苯甲酸、苯乙酸、功效单体：丙烯酸、丙烯酰胺、含有乙烯基苯甲酸、苯乙酸、咪唑和吡啶类化合物。咪唑和吡啶类化合物。甲基丙烯酸甲基丙烯酸特点特点：操作简单易行，印迹分子易除去，分子识别过程更靠近：操作简单易行，印迹分子易除去，分子识别过程更靠近天然分子识别系统，可同时采取各种功效单体，增加印迹效果；天然分子识别系统，可同时采取各种功效单体，增加印迹效果；功效单体过量，选择性下降。功效单体过量，选择性下降。分子印迹技术分类分子印迹技术分类自组装法自组装法第四节第四节 印迹酶印迹酶第第61页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程聚合时，印迹分子与功效基团共价结合。识别时，印迹分聚合时，印迹分子与功效基团共价结合。识别时，印迹分子与功效基团非共价结合。子与功效基团非共价结合。金属离子配位方法金属离子配位方法印迹分子印迹分子-金属离子金属离子-功效单体三维复合物进行交联聚合。功效单体三维复合物进行交联聚合。金属配位作用强度可经过金属配位作用强度可经过EDTA简单变换金属离子种类实简单变换金属离子种类实现对印迹分子聚合物亲和能力灵活调整。现对印迹分子聚合物亲和能力灵活调整。分子印迹技术分类分子印迹技术分类自组装和预组织相结合方法自组装和预组织相结合方法第四节第四节 印迹酶印迹酶第第62页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程分子印迹聚合物制备分子印迹聚合物制备功效性单体功效性单体：羧酸类化合物（甲基丙烯酸、丙烯酸、乙烯基苯：羧酸类化合物（甲基丙烯酸、丙烯酸、乙烯基苯甲酸）、磺酸及杂环弱碱类（乙烯基吡啶、乙烯基咪唑），最甲酸）、磺酸及杂环弱碱类（乙烯基吡啶、乙烯基咪唑），最惯用体系为聚丙烯酸和聚丙烯酰胺体系。惯用体系为聚丙烯酸和聚丙烯酰胺体系。交联剂交联剂：丙烯酸类交联剂（二亚乙基丙烯酸）：丙烯酸类交联剂（二亚乙基丙烯酸）溶剂溶剂：溶剂极性越大，产生识别效果越弱（甲苯，二氯甲烷）：溶剂极性越大，产生识别效果越弱（甲苯，二氯甲烷）低温聚合低温聚合：可提升分子印迹聚合物分辨力。：可提升分子印迹聚合物分辨力。分子印迹聚合物形态分子印迹聚合物形态：快、珠、薄膜、表面印迹、固定容器内：快、珠、薄膜、表面印迹、固定容器内就地聚合。就地聚合。第四节第四节 印迹酶印迹酶第第63页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程分子印迹酶分子印迹酶含有催化能力（作用）分子印迹聚合物称为含有催化能力（作用）分子印迹聚合物称为分子印迹酶分子印迹酶。印迹底物及其类似物。印迹底物及其类似物。印迹过渡态类似物。印迹过渡态类似物。表面印迹过渡态类似物。表面印迹过渡态类似物。第四节第四节 印迹酶印迹酶第第64页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程Wulff研究小组充分考虑结合态和定向引入催化基团对催化作用印迹磷酸单酯印迹磷酸单酯脒基脒基第第65页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第第66页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第第67页页第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程第五章第五章第五章第五章 化学酶工程化学酶工程化学酶工程化学酶工程思索题思索题1 简述酶分子化学修饰基本原理，及酶化学修饰方法。简述酶分子化学修饰基本原理，及酶化学修饰方法。2 酶分子被修饰后在性质上有哪些改变？酶分子被修饰后在性质上有哪些改变？3 酶分子哪些侧链能够被修饰？酶分子哪些侧链能够被修饰？4 为何环糊精及其衍生物能够作为模拟酶模型，该模型与大环为何环糊精及其衍生物能够作为模拟酶模型，该模型与大环冠醚模拟酶模型有何区分？冠醚模拟酶模型有何区分？5 简述抗体酶催化反应类型有哪些？简述抗体酶催化反应类型有哪些？6 抗体酶有何特征？抗体酶有何特征？7 简述分子印迹基本过程。简述分子印迹基本过程。第第68页页